Nous remercions le Dr Alan Tessler pour les commentaires et l&#39;aide éditoriale. Ce travail a été soutenu par le NIH NS062320.

1. Microscope mis en place et la préparation d&#39;imagerie <ol><li> Notre kit se compose d&#39;imagerie d&#39;un stéréomicroscope Leica MZ16 fluorescent avec une vitesse d&#39;obturation rapide et une caméra CCD refroidie contrôlé par un logiciel Metamorph. </li><li> Préparer un coussin chauffant thermostaté et d&#39;ajuster la sortie à 32,5 ° C pour maintenir la température du corps de l&#39;animal pendant et après la chirurgie. </li><li> Chaud solution de Ringer stérile ou artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF) à 32,5 ° C à l&#39;avance pour l&#39;irrigation de la moelle épinière pendant la chirurgie. </li><li> Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale de xylazine (8 mg / kg) et la kétamine (120 mg / kg) à cocktail. </li><li> Rasez le haut du dos avec une tondeuse pour petits animaux et la propagation une petite goutte de lotion d&#39;épilation sur la zone rasée avec un coton-tige tampons. Quelques minutes plus tard, retirer la lotion appliquée en utilisant 70% d&#39;éthanol d&#39;éponges de gaze imbibée. </li></ol> 2. Laminectomie et l&#39;exposition chirurgicale de la racine L5 dorsale <ol><li> Placez l&#39;animal sur une chauffée (32,5 ° C) pad et désinfecter la peau avec des tampons imbibés d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Sous un éclairage en champ clair sur le stéréomicroscope, effectuer une incision médiane (2 - 3 cm) dans la peau du dos. Si nécessaire, utilisez un coton-tige tampons pour arrêter le saignement. </li><li> Refléter la musculature vertébrale afin d&#39;exposer les vertèbres lombaires sous-jacentes. </li><li> Exposer les segments L3-S1 épinière par côté droit hémi-laminectomie utilisant rongeurs de petite taille. Une laminectomie partielle exposant 4-6 segments de la moelle épinière lombaire et sacrée est créée en supprimant la partie droite dorsale des vertèbres L5 au niveau de la crête iliaque de la hanche (l&#39;emplacement des DRG L5) rostralement aux vertèbres L2 (2 vertèbres caudales et la dernière côte). Perfuser la cavité avec une solution chaude Ringer stérile. </li><li> Position de l&#39;animal sur un coussin de soutien (gaze de coton roulé) pour aplatir la colonne vertébrale. Utilisez des crochets de rétraction pour élargir la zone exposée. </li><li> A ce point (environ 30 minutes après la première injection ip d&#39;anesthésique, un supplément (0.5X) doit être injecté par voie sous cutanée afin de garder l&#39;animal totalement anesthésié. Alternativement anesthésie gazeuse, (2-4% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène 0.5L/min ) peuvent être utilisés pour l&#39;anesthésie répétée lors des séances d&#39;imagerie plus de 1 heure. </li></ol> 3. Rhizotomie / écraser racine dorsale <ol><li> Interrupteur à l&#39;excitation de fluorescence de visualiser YFP étiquetés (+) des axones. </li><li> En utilisant la pointe d&#39;un sous-Q (26ga.) aiguille, effectuer une petite incision dans la durée recouvrant la racine L5 dorsale (DR). Perfuser à plusieurs reprises avec une solution de Ringer et nettoyer délicatement avec un coton-tige tampons. </li><li> Identifier le site pour être écrasés et insérez un côté d&#39;une pince fine (Dumont # 5) sous-durale. </li><li> Fermer la pince doucement mais fermement, en tenant la partie médiale de la racine L5 pendant 10 secondes, puis relâchez doucement la pince. </li><li> Laver à plusieurs reprises avec une solution physiologique et nettoyez doucement avec un coton-tige tampons. </li></ol> 4. L&#39;acquisition des images et des post-op procédures <ol><li> Obtenir des images multiples de toute la zone exposée, y compris le site de l&#39;écrasement et DREZ avant et juste après l&#39;écraser à la fois un grossissement faible et élevé. </li><li> Les images sont acquises soit comme des instantanés unique ou de multiples flux de 10 à 20 images acquises dans les 30 - du temps d&#39;exposition de 40 ms. En-focus images sont ensuite sélectionnés, et un montage aperçu est créé ultérieurement en utilisant Photoshop. </li><li> Afin de minimiser la formation de cicatrices, bien appliquer un morceau de membrane fine matrice synthétique (Biobrane), suivie par artificielle-mère, au sommet de la moelle épinière exposées. Veillez à couper des morceaux pour s&#39;adapter précisément dans la fenêtre de la moelle épinière exposés afin qu&#39;elles soient adhérentes à la moelle épinière. </li><li> Fermer la musculature avec des sutures stériles 5-0 et fermer l&#39;incision médiane avec des clips plaie. </li><li> Injecter la solution de Ringer (0,3 à 0,5 ml par voie sous cutanée), et d&#39;administrer la buprénorphine comme analgésie postopératoire (0,05 mg / kg) par voie sous cutanée toutes les 12 h pendant 2 jours. </li><li> Gardez l&#39;animal sur un coussin chauffant (34 ° -35 ° C) jusqu&#39;à ce récupérés. </li></ol> 5. Imagerie répétés <ol><li> Anesthésier les animaux et enlever les clips de la plaie et des sutures. </li><li> Retirer artificielle mère et fine membrane synthétique patchs matrice et les conserver dans un tube stérile contenant une solution de Ringer pour une réutilisation ultérieure. </li><li> Retirez doucement la cicatrice conjonctifs accumulés tissu avec la pointe d&#39;une aiguille pliée sous-Q et une pince fine. Perfuser fréquemment avec une solution de Ringer au chaud en. </li><li> Re-exposer le champ opératoire, y compris le site écraser et DREZ, relocaliser YFP + axones imagé dans les sessions précédentes, et répéter les procédures décrites dans la section 4. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Nous avons observé que, alors qu&#39;ils ne se régénèrent pas après une blessure transection, presque tous les axones + YFP grandi à travers le site deblessures en 3 jours après l&#39;écrasement (Figure 1) 11. Typiquement, le lendemain, après écrasement, nous avons observé meurent-back dégénérescence des axones moignon proximal et de la fragmentation / dégénérescence des axones mêmes distale à l&#39;écrasement, qui a confirmé que les axones avaient été endommagés de manière appropriée (par exemple, la Figure 1; Jour 3 et 5) . Plusieurs critères supplémentaires sont appliqués à distinguer sans ambiguïté les axones repoussent à partir des axones qui ont été épargnés ou avait récupéré de sa blessure. Ces sont les suivants: (1) axones régénérant montrent une expansion de la partie non-fluorescent de la YFP + axone au site écraser due à la dégénérescence proximales et distales (par opposition à un rétrécissement de l&#39;écart non étiquetés en raison de cytoplasme fluorescentes remplissage du site écraser si les axones ont survécu à la blessure), (2) régénération des axones sont beaucoup plus minces, moins vives fluorescentes, et plus vallonné que les axones qui ont survécu à la blessure, (3) neurites de régénération sont plus minces et plus faiblement fluorescentes que les fragments ne dégénère fluorescentes des axones à travers lequel ils ont étendu; (4) contrairement à survivre ou épargné les axones, les axones régénérant arrêt à la DREZ, et (5) contrairement aux survivants ou épargné les axones, les axones régénérant ne présentent pas de nœuds de Ranvier. La figure 1 montre quatre superficielle axones + YFP immédiatement après l&#39;écrasement (A1; flèches colorées). Trois jours après l&#39;écrasement, les quatre axones prolonger une seule neurites qui pousse à travers le site d&#39;écrasement (A2). Cinq jours après écraser, neurites rester stable et il n&#39;ya pas de croissance supplémentaire d&#39;axones de ces ou d&#39;autres proximale (A3). Les neurites régénérant qui traversait le site écraser allongée grâce à beaucoup plus épais et plus lumineux fragments fluorescents d&#39;un axone dégénère (ie, les tubes endoneurial), et arriver à l&#39;DREZ dès 4 jours après l&#39;écrasement (environ 3mm / 2 jours) 11. Imagerie répétée de ces axones et leurs conseils tous les deux ou trois jours pour deux semaines de plus (Figure 2) a révélé qu&#39;ils ne poussent pas vers l&#39;avant ou se rétracter, mais il est resté immobile. Le seul changement notable a été le gonflement des conseils et des puits de certains axones. Ces observations montrent donc l&#39;immobilisation étonnamment rapide et chroniques des axones régénérant à l&#39;DREZ. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1: imagerie répétés de L5 + DR YFP axones sur le site d&#39;écrasement de la racine dorsale de plus de 5 jours. La partie médiale de la racine L5 a été écrasé (rouge pointe de flèche) et imagé aux jours 0, 3 et 5 après l&#39;écrasement. La zone de l&#39;écrasement est amplifié dans les panneaux de droite (A1-A3). <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2:. Imagerie répétés des axones est arrivé à l&#39;DREZ plus de 20 jours après écraser la racine L5 Jour 4, trois axones (flèches colorées) sont arrivés à la DREZ. Les pointes de ces axones restent au même endroit et ont une apparence semblable à des sessions ultérieures sur l&#39;imagerie Jours 7, 9, 13, 15 et 20. Positions d&#39;une pointe axone par rapport à d&#39;autres trucs axone et les repères (astérisques) ont été utilisées pour déterminer la motilité axone entre les séances d&#39;imagerie.

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Imagerie DR directement dans la régénération de vie des souris est particulièrement difficile car il nécessite une laminectomie dorsale substantielle pour surveiller la croissance des axones sur une large zone suivie par plusieurs interventions chirurgicales effractives et anesthésiques à des séances d&#39;imagerie ultérieurs. Plusieurs stratégies ont aidé à surmonter ces défis. Premièrement, l&#39;imagerie réussie nécessaire de réduire la mortalité de la souris (environ 25%) en minimisant la durée de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Ligne H Thy1-YFP (2-4 mois, soit le sexe) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (injection AnaSed, solution stérile) </td><td> Laboratoires Lloyd, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> La kétamine (chlorhydrate de kétamine par injection, USP) </td><td> Hospira, Inc (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> La buprénorphine (injectable Buprenex) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Petite tondeuse poils </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Lotion Épilation </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR avec Baby Oil </td><td></td></tr><tr><td> Compresses de gaze </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Coton-tige tampons </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14 à 960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> Seringues de 1 ml </td><td> Becton, Dickson et Société Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Sous-cutanée (sous-Q) aiguilles, Calibre 26. </td><td> Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Des ciseaux et des pinces à ressort </td><td> Outils Fine Science, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm Rongeurs courbes </td><td> Outils Fine Science, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Injection de Ringer lactate USP </td><td> B. Braun Medical Inc (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Une solution saline stérile </td><td> APP Pharmaceuticals (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Mince membrane matrice synthétique (Biobrane) </td><td> Pharmaceuticals Bertek, (Morgantown) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial durée </td><td> Gore Empêcher MVP Dura substitution, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 sutures de soie </td><td> Ethicon, Inc (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Clips des plaies </td><td> Parfait - Ets Bruneau, (Burnea, France) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Stéréomicroscope fluorescent </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Allemagne) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Hamamatsu, de Bridgewater (NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Régulateur de température </td><td> World Precision Instruments (Sarasota, Floride) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph logiciels </td><td> Molecular Devices (Sunnyvale, Californie) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

Les axones sensoriels primaires blessés par des blessures profondes épinière ne parviennent pas à régénérer dans la moelle épinière, entraînant des douleurs chroniques et permanents perte sensorielle. Régénération de la racine dorsale (DR) axones dans la moelle épinière est empêché à la dorsale d&#39;entrée de zone racine (DREZ), l&#39;interface entre le SNC et du SNP. Notre compréhension des événements moléculaires et cellulaires qui empêchent la régénération au DREZ est incomplète, en partie parce que les changements complexes associées à des lésions nerveuses ont été déduites à partir d&#39;analyses post-mortem. Dynamique des processus cellulaires, telles que la régénération des axones, sont les mieux étudiés avec les techniques que la capture en temps réel des événements avec de multiples observations de chaque animal vivant. Notre capacité à surveiller les neurones en série in vivo a augmenté de façon spectaculaire grâce à des innovations révolutionnaires en matière d&#39;optique et de la souris transgénique. Plusieurs lignes de souris transgéniques Thy1-GFP, dans les sous-ensembles de neurones sont génétiquement distincts étiquetés dans des couleurs fluorescentes, permis de neurones individuels à imager in vivo 1. Ces souris ont été largement utilisés pour l&#39;imagerie in vivo de muscle 2-4 et le cerveau 5-7, et ont fourni de nouvelles connaissances sur les mécanismes physiologiques qui analyse statique ne pouvait pas résolu. Les études d&#39;imagerie des neurones dans la moelle épinière de vie n&#39;ont commencé que récemment. Lichtman et ses collègues ont d&#39;abord démontré leur faisabilité par le suivi des blessés dorsale colonne (CC) avec de larges axones microscopie à champ 8,9. Multi-photon dans l&#39;imagerie in vivo des axones CC profondément positionnée, la microglie et les vaisseaux sanguins ont également été accomplis 10. Au cours des dernières années, nous avons été les premiers à appliquer l&#39;imagerie in vivo pour contrôler la régénération des axones DR utilisant la microscopie à champ large et la ligne H du Thy1-YFP souris. Ces études nous ont conduit à une nouvelle hypothèse sur les raisons axones DR sont empêchés de régénération dans la moelle épinière 11. Dans la ligne H du Thy1-YFP souris, distincte YFP axones + sont superficiellement placés, ce qui permet plusieurs axones être surveillés simultanément. Nous avons appris que les axones DR arrivant à DREZ sont mieux imager dans lombaire que dans la moelle épinière cervicale. Dans le présent rapport, nous décrivons plusieurs stratégies que nous avons trouvé utile d&#39;assurer avec succès l&#39;imagerie à long terme et répétées des axones régénérant DR. Il s&#39;agit notamment de méthodes qui éliminent l&#39;intubation et l&#39;interruption répétée des voies respiratoires, de minimiser la chirurgie associée stress et la formation de cicatrices, et acquérir des images stables à haute résolution sans phototoxicité.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Une<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie protocole à suivre axones sensoriels primaires suivantes écraser la racine dorsale est décrite. Les procédures utilisent à grand champ microscopie par fluorescence et Thy1-YFP souris transgéniques, et permettent une imagerie répétée de la régénération des axones plus de 4 cm dans le SNP et les interactions avec l&#39;interface axone du SNC.

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K vues.  Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology. Une In vivo Imagerie protocole à suivre axones sensoriels primaires suivantes écraser la racine dorsale est décrite. Les procédures utilisent à grand champ microscopie par fluorescence et Thy1-YFP souris transgéniques, et permettent une imagerie répétée de la régénération des axones plus de 4 cm dans le SNP et les interactions avec l'interface axone du SNC.

Vidéo: Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Recherche

Neurosciences

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy pour accès de Ganglion de la racine dorsale lombaire et Injection chez le porc

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Microscopie spectrale réflectométrique sur les axones myélinisés In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...