Nous tenons à remercier M. Scullion et R. Crisp des Technologies de l&#39;Idaho pour le soutien technique et le Centre de recherche écologique USGS occidentaux pour le financement (S. Schwarzbach) et l&#39;assistance (K. Spragens, T. Graham). Cette recherche a été réalisée sous les auspices du Centre pour la technologie innovatrice - Institut pour la Défense et la Sécurité intérieure (www.idhs.org), à l&#39;appui du ministère de la Défense et Air Force Research Laboratory. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation de l&#39;US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l&#39;Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Toute utilisation des appellations commerciales, des produits, ou de l&#39;entreprise dans cette publication est à des fins descriptives et n&#39;implique pas l&#39;approbation par le gouvernement américain.

1. Capture d&#39;oiseaux sauvages au moyen de filets brouillard <ol><li> Pour la capture d&#39;oiseaux de rivage, mis en place des filets de brume à un site actif butinage, comme un marais, le littoral, ou de la boue à plat. </li><li> Glissez trémails ligne de boucles d&#39;un bout du filet autour du pôle et insérez pole verticalement dans la boue. </li><li> Étends net, insérez le deuxième pôle à travers les boucles trémails à l&#39;autre extrémité du filet de brume et verticalement, insérez poteau dans la boue, en s&#39;assurant que les lignes trémails sont enseignées. </li><li> Une fois qu&#39;un oiseau est capturé, extrait de l&#39;oiseau du filet et revenir à la station de baguage. </li></ol> 2. Cloacaux tige d&#39;échantillonnage <ol><li> Recueillir des écouvillons cloacaux immédiatement après sa capture </li><li> Localisez le cloaque et l&#39;utilisation des doigts pour repousser plumes entourant </li><li> Déballer une Dacron ou stériles polyester-tige, tige première extrémité, et humidifier le bout avec les milieux stériles de transport viral pour une plus grande aisance dans pistonnage. Après humidification, toute la tête de l&#39;écouvillon est délicatement inséré dans le cloaque. Nettoyer la circonférence intérieure du cloaque par le virevoltant l&#39;écouvillon lentement et enlever la tige du cloaque. </li><li> Insertion de la pointe de tige directement dans le flacon d&#39;échantillon de transport viral médias; tourner la tige de l&#39;écouvillon entre le pouce et l&#39;index tandis que la tige est dans les médias. Vous avez un assistant de terminer la procédure en tirant le bout de l&#39;arrière-tige au fond de la fiole ~ 1 cm et couper la tige de la tige avec une paire de ciseaux pour la pointe tige reste dans le flacon et l&#39;arbre ne pas interférer avec bouchon de fermeture. Flacon bouchon. Désinfecter les ciseaux avec de l&#39;alcool dans les arbres de coupe entre le coton-tige. </li><li> Placer les flacons dans une boîte de congélation contenant soit de la glace sèche ou de la glace. </li></ol> 3. Oropharyngée prélèvement tige <ol start="1"><li> Ouvrez doucement le bec de l&#39;oiseau de sorte que la fente est visible choanes </li><li> Déballer un écouvillon propre à partir de l&#39;emballage, la tige première extrémité, et humidifier le bout avec les médias de transport viral pour une plus grande aisance dans écouvillonnage </li><li> Sans toucher la pointe d&#39;autres surfaces, l&#39;insérer dans la bouche et nettoyer l&#39;ouverture des choanes sur le toit de la bouche et continuer en direction de la région oropharyngée ou de la gorge </li><li> Placez l&#39;extrémité tige directement dans le transport des médias flacon virale. Tournez la tige de l&#39;écouvillon entre le pouce et l&#39;index tandis que la tige est dans les médias. Comme ci-dessus, un assistant tirez la pointe de l&#39;arrière-tige au fond de la fiole ~ 1 cm et couper la tige de la tige avec une paire de ciseaux pour la pointe tige reste dans le flacon et l&#39;arbre n&#39;interfère pas avec le chapeau fermeture. Flacon bouchon. Désinfecter les ciseaux avec de l&#39;alcool dans les arbres de coupe entre le coton-tige. </li><li> Placer les flacons dans une boîte de congélation contenant de la glace sèche ou de la glace. </li></ol> 4. La manipulation d&#39;oiseaux et la libération <ol start="1"><li> Retour des oiseaux sur le site de capture et de libération dans les meilleurs délais (&lt;20min). Gestionnaires doivent être conscients des principes de protection des animaux et être attentifs aux signes de la souffrance des oiseaux lors de l&#39;échantillonnage (c.-à-abrasions, la capture et la myopathie hypo-ou hyperthermie). Une trousse de premiers soins devraient être inclus dans la liste des équipements. </li></ol> 5. Installations d&#39;essai <ol start="1"><li> Les échantillons peuvent être testés dans un espace confiné comme une remorque de recherche ou d&#39;une tente, avec une alimentation électrique (générateur de tension régulée) pour faire fonctionner l&#39;appareil PCR et l&#39;ordinateur relié. </li></ol> 6. Extraction de l&#39;ARN <ol start="1"><li> L&#39;extraction d&#39;ARN a été réalisée avec le kit RNeasy Mini avec des modifications mineures aux instructions du fabricant suivantes Spackman et al. 1 </li><li> Vortex, le support écouvillon pour 3-5 s et de transfert 350 pi à un microtube de 2 ml. Remarque: Conservez l&#39;échantillon restant sur la glace en cas de PCR positive des échantillons doivent être recriblés H5 ou test doit être exécuté. </li><li> Ajouter 350 pi de tampon RLT (avec β-moi) et vortex pendant 5 s. </li><li> Ajouter 350 ul d&#39;ARN 70% d&#39;éthanol de grade. </li><li> Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min. </li><li> Ajouter 600 ul du surnageant dans une colonne spin placé dans un tube collecteur de 2 ml. Conserver l&#39;échantillon restant dans le portoir. </li><li> Centrifuger pendant 20 s à 10 000 xg et jetez accréditives. </li><li> Répétez les étapes 17 à 18 jusqu&#39;à ce que tous l&#39;échantillon a été passé à travers la colonne. </li><li> Placer la colonne spin dans un tube collecteur de 2 ml. </li><li> Ajouter 700 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger 25 s à 10 000 x g. Jeter l&#39;effluent à travers. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger pendant 25 s à 10 000 x g. Jeter l&#39;effluent à travers. </li><li> Répétez l&#39;étape 22 pour un total de deux lavages avec le tampon RPE. </li><li> Centrifuger la colonne de spin pour un supplément de 2 minutes à 14000 x g. Jeter le tube collecteur. </li><li> Placer la colonne spin dans un endroit propre microtube 1,5 ml et ajouter 50 pl d&#39;eau sans nucléase. Incuber à température ambiante pendant 60 s. </li><li> Eluer ARN en faisant tourner pendant 60 s à 10 000 xGFou 60 s. Placer l&#39;échantillon sur la glace purifiée. </li></ol> 7. Préparation des contrôles négatifs <ol start="1"><li> Réactifs lyophilisés ont été préparés pour utilisation dans le dosage par PCR selon les instructions de l&#39;Idaho Technologies lyophilisées kit de détection Réactif pour TaqMan Sondes grippe A Objectif 1 (Asay-ASY-0109). </li><li> Centrifugeuse négative flacon de réactif de contrôle (rouge) pendant 3 s pour assurer granulés sont à la base. </li><li> Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base. </li><li> Ajouter 20 ul de tampon de reconstitution 2 X et 20 ul d&#39;eau de qualité réactive. </li><li> Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale. </li><li> Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon. </li><li> Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n&#39;est répéter les étapes 31-32. </li><li> Pipeter 19 ul du mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l&#39;étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata. </li></ol> 8. Échantillons Préparation <ol start="1"><li> Centrifugeuse flacon de réactif inconnu (bleu) pendant 3 secondes afin d&#39;assurer les granulés sont à la base. </li><li> Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base. </li><li> Ajouter 40 ul d&#39;ARN purifié. </li><li> Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale. </li><li> Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon. </li><li> Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n&#39;est répéter les étapes 38-39. </li><li> Pipeter 19 ul de mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l&#39;étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata. </li></ol> 9. Préparation des contrôles positifs <ol start="1"><li> Centrifuger le flacon de contrôle positif réactif (vert) pendant 3 s pour assurer les granulés sont à la base. </li><li> Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base. </li><li> Ajouter 20 ul de tampon de reconstitution 2 X et 20 ul d&#39;eau de qualité réactive. </li><li> Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale. </li><li> Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon. </li><li> Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n&#39;est répéter les étapes 45-46. </li><li> Pipeter 19 ul du mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l&#39;étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata. </li></ol> 10. La centrifugation des tubes capillaires <ol start="1"><li> Une fois que tous les tubes capillaires pour le lot ont été préparés les charger dans le mini-centrifugeuse équipée d&#39;adaptateurs capillaire. </li><li> Centrifuger à réglage le plus bas en maintenant le bouton d&#39;impulsion vers le bas pour 1 s. Ce transfert de liquide vers le bas en préparation pour les tests. </li></ol> 11. Fonctionnement du RAPID <ol start="1"><li> Créez un nouveau fichier. Contrôle Label positif, témoin négatif, et des échantillons (par leur numéro d&#39;identification). </li><li> Programme 1: Préparation des échantillons d&#39;ARN Tenir <ol><li> Cycles = 1 </li><li> Mode d&#39;analyse = Aucun </li><li> Température cible = 40 </li><li> = Temps d&#39;incubation 30 min </li><li> Taux de transition de température = 20 ° C / s (par défaut) </li><li> Température cible secondaire = 0 (par défaut) </li><li> Taille étape = 0 (par défaut) </li><li> Retard étape = 0 (par défaut) </li><li> Mode d&#39;acquisition = Aucun (par défaut) </li></ol></li><li> Programme 2: ARN Dénaturation <ol><li> Cycles = 1 </li><li> Mode d&#39;analyse = Aucun </li><li> Température cible = 94 </li><li> = Temps d&#39;incubation 120s </li><li> Taux de transition de température = 20 ° C / s (par défaut) </li><li> Température cible secondaire = 0 (par défaut) </li><li> Taille étape = 0 (par défaut) </li><li> Retard étape = 0 (par défaut) </li><li> Mode d&#39;acquisition = Aucun (par défaut) </li></ol></li><li> Programme 3: amplification de l&#39;ARN <ol><li> Cycles = 45 </li><li> Mode d&#39;analyse Analyse automatique = </li><li> Température cible, le segment 1 = 94; Segment 2 = 60 </li><li> Temps d&#39;incubation, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s </li><li> Taux de transition de température, Seg 1 &amp; 2 = 20 ° C / s (par défaut) </li><li> Température cible secondaire, Seg 1 &amp; 2 = 0 (par défaut) </li><li> Taille étape, Seg 1 &amp; 2 = 0 (par défaut) </li><li> Retard étape, Seg 1 &amp; 2 = 0 (par défaut) </li><li> Mode d&#39;acquisition, le segment 1 = Aucun; Segment 2 = simple </li></ol></li><li> Paramètres de fluorescence <ol><li> Mode d&#39;affichage: le canal de fluorescence 2 (Ch2 / 1) Les gains: <ol><li> Ch. 1 (F1) = 1 </li><li> Ch. 2 (F2) = 8 </li><li> Ch. 3 (F3) = 1 </li></ol></li><li> Pour afficher les données en temps réel par fluorescence pour chaque échantillon, sélectionner l&#39;échantillon d&#39;intérêt et de cliquer sur le bouton «Afficher le graphique» au bas de l&#39;écran </li></ol></li><li> Pour chaque capillaire, les résultats sont les suivants: <ul><li> # - Identifie la position du carrousel carrousel </li><li> Nom de l&#39;échantillon - fournit le nom de l&#39;échantillon </li><li> Contrôle - identifie également le type d&#39;échantillon pour chaque échantillon </li><li> Score - calculée en utilisant la relation entre la fluorescence de l&#39;échantillon et le niveau de fluorescence de fond dans l&#39;échantillon </li><li> Résultat - affiche le résultat global de l&#39;échantillon </li></ul></li></ol> 12. Les résultats représentatifs: Présent: Un rouge «présent» appel à un test / échantillon inconnu indique que la cible a été identifié dans l&#39;échantillon et les contrôles ont été réussies. Non détecté: «non détecté» Un vert appel à un test / échantillon inconnu indique que la cible n&#39;a pas été identifié dans l&#39;échantillon et les contrôles d&#39;essai ont été réussies. S&#39;il vous plaît répéter: Un «s&#39;il vous plaît répétez &#39;indique que le contrôle positif ou négatif échoué. Un exemple d&#39;une analyse réussie par le 7200 RAPID est montré dans la figure 4. Le contrôle positif est amplifié et génère fluorescence détectable (axe Y) à environ 25 cycles (axe x). Un cycle seuil (CT)&gt; 35 est le seuil accepté pour la plupart des laboratoires de référence VIA. Par conséquent, les contrôles positifs à cette méthode produit un signal fluorescent dans le nombre de cycles acceptée (0-35) pour la détection de l&#39;AIV. En revanche, le contrôle négatif ne génère pas un signal fluorescent, même après 45 cycles. De même, les douze échantillons prélevés dans les bécasseaux l&#39;Ouest n&#39;ont pas de générer un signal fluorescent indiquant que les oiseaux ont été négatifs pour l&#39;AIV. Des tests de suivi de tous les échantillons positifs dans un laboratoire traditionnel est encouragé à veiller à ce qu&#39;aucun faux positifs sont produites par erreur. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Capture d&#39;oiseaux de rivage en utilisant filets. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Collecte d&#39;échantillons cloacaux et de l&#39;oropharynx de moins bécasseaux. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Programmation du 7200 RAPIDE pour l&#39;amplification de l&#39;ARN. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Fluorogram générés par le RAPID 7200 portables rRT-PCR montrant comment les contrôles positifs et négatifs devraient apparaître dans un essai réussi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">Cliquez ici pour voir l&#39;image pleine grandeur</a>

<ol>
	<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds:+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents.">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li><li>Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+internal+positive+control+for+rapid+diagnosis+of+avian+influenza+virus+infections+by+real-time+reverse+transcription-PCR+with+lyophilized+reagents.">Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents.</a> J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).</li><li>Spackman, E., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+virus+RNA+extraction+from+tissue+and+swab+material.">Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material.</a> Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).</li><li>Chen, R., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+inter-species+transmission+and+geographic+subdivision+in+avian+influenza+viruses+from+wild+birds.+Virology.">Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology.</a> , 383-3156 (2009).</li><li>Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+turnover+by+reassortment+of+replication+complex+genes+from+avian+influenza+A+virus.">Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus.</a> J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).</li><li>Dugan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+genetics+and+emergence+of+avian+influenza+viruses+in+wild+birds.">The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds.</a> PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analyses+of+type+A+influenza+genes+in+natural+reservoir+species+in+North+America+reveals+genetic+variation.">Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation.</a> Virus Res. 114, 89-100 (2005).</li><li>Pasick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+based+techniques+for+the+diagnosis+and+characterization+of+avian+influenza+virus+infections..">Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections..</a> Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE+Manual+of+diagnostics+tests+and+vaccines+for+terrestrial+animals+(mammals,+birds+and+bees).">OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees).</a> 1, 258-269 (2004).</li><li>Weber, T. P., Stilianakis, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecologic+immunology+of+avian+influenza+(H5N1)+in+migratory+birds.">Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).</li><li>Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ducks:+the+"Trojan+Horses"+of+H5N1+influenza.">Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).</li><li>Gilbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flying+over+an+infected+landscape:+distribution+of+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+risk+in+South+Asia+and+satellite+tracking+of+wild+waterfowl.">Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl.</a> Ecohealth. , (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode de diagnostic rapide facilite les tests présentés ici de temps précis et efficace des échantillons d&#39;oiseaux sauvages pour la surveillance de l&#39;AIV. Les exigences beaucoup moins strictes de stockage portables spécimen de RT-PCR sont adaptés à des situations isolées où le maintien d&#39;une chaîne du froid peut être impraticable si les expéditeurs azote liquide ou de glace sèche n&#39;est pas disponible. De plus, nous avons constaté que l&#39;analyse de l&#39;échantillon avec les réact...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> RNeasy mini colonne de centrifugation </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inclus dans kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Tubes de prélèvement (1,5 et 2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inclus dans kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Tampon RLT </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inclus dans kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Tampon RW1 </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inclus dans kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Le tampon RPE </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inclus dans kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans RNase </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inclus dans kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> 14,3 M β-mercaptoéthanol solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100% d&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie 2, 120V </td><td> Scientific Industries </td><td> SI-0236 </td><td></td></tr><tr><td> Taqman grippe A Objectif 1 (sonde d&#39;hydrolyse) </td><td> Technologies Idaho </td><td> Asay-ASY-0109 </td><td></td></tr><tr><td> Lightcycler 20ml tubes capillaires </td><td> Roche Applied Science </td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-centrifugeuse avec rotateur pour tubes de 2 ml </td><td> Technologies Idaho </td><td></td><td> Inclus dans le kit RAPIDE </td></tr><tr><td> Renforcé avancée des périphériques d&#39;identification des agents pathogènes (RAPID) 7200 </td><td> Technologies Idaho </td><td></td><td> Inclus dans le kit RAPIDE </td></tr><tr><td> Pentium ordinateur portable avec Windows XP Professionnel </td><td> Technologies Idaho </td><td></td><td> Inclus dans le kit RAPIDE </td></tr><tr><td> Analyse des données du logiciel LightCycler </td><td> Technologies Idaho </td><td></td><td> Inclus dans le kit RAPIDE </td></tr></tbody></table>

rapid diagnosis of avian influenza virus in wild birds: use of a portable rrt-pcr and freeze-dried reagents in the field

Les oiseaux sauvages ont été impliqués dans la propagation de l&#39;influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1, ce qui incite de surveillance le long des voies migratoires. L&#39;échantillonnage des oiseaux sauvages du virus de la grippe aviaire (AIV) est souvent menée dans des régions éloignées, mais les résultats sont souvent retardées en raison de la nécessité de transporter les échantillons à un laboratoire équipé pour des tests moléculaires. En temps réel de la transcriptase inverse de la chaîne par polymérase (RT-PCR) est une technique moléculaire qui offre l&#39;une des méthodes les plus précises et sensibles pour le diagnostic de l&#39;AIV. Les protocoles de laboratoire préalablement strict nécessaire pour la RT-PCR sont maintenant adaptés pour le champ. Développement de réactifs lyophilisés (lyophilisé) qui ne nécessitent pas la chaîne du froid, avec une sensibilité au niveau des réactifs humide a amené les tests sur site distant à un but pratique. Nous présentons ici une méthode pour le diagnostic rapide de l&#39;AIV chez les oiseaux sauvages en utilisant une unité de RT-PCR (Ruggedized avancée des périphériques d&#39;identification des agents pathogènes ou rapide, des technologies de l&#39;Idaho, de Salt Lake City, UT) qui emploie des réactifs lyophilisés (grippe A Cible 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Technologies Idaho). Les réactifs contiennent tous les composants nécessaires pour les tests à des concentrations appropriées dans un seul tube: amorces, des sondes, des enzymes, les tampons et les contrôles internes positifs, éliminant les erreurs liées à un mauvais entreposage ou la manipulation de réactifs humide. L&#39;unité portable effectue un écran pour la grippe A en ciblant le gène de la matrice et donne des résultats en 2-3 heures. Sous-typage génétique est également possible avec un apprêt H5 et H7 jeux qui ciblent le gène hémagglutinine. Le système est adapté pour une utilisation sur des échantillons cloacaux et oropharyngée prélevés sur des oiseaux sauvages, comme l&#39;a montré ici sur les espèces de limicoles migrateurs, le bécasseau d&#39;Alaska (Calidrus mauri) capturé en Californie du Nord. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation de l&#39;US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l&#39;Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Le principal avantage de cette technique est d&#39;accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné. Diagnostic sur site serait également s&#39;avérer utile pour identifier et étudier les individus infectés dans les populations sauvages. La possibilité de collecter des informations sur la biologie hôte (réponse immunologique et physiologique à l&#39;infection) et de l&#39;écologie spatiale (performance migratoires des oiseaux infectés) fourniront un aperçu de la mesure dans laquelle les oiseaux sauvages peuvent agir comme des vecteurs de l&#39;AIV sur de longues distances.

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Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l&#39;écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d&#39;un scénario d&#39;épidémie. L&#39;utilisation d&#39;outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.

Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L&#39;utilisation d&#39;un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

rapid-diagnosis-avian-influenza-virus-wild-birds-use-portable-rrt-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K vues.  USGS Western Ecological Research Center. Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.

Vidéo: Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

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Immunologie et infection

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.