This work has been funded in part with federal funds from the Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contract No. HHSN272201400006C.

Tous les porcs utilisés pour la collecte des données suivantes ont été protégés en vertu de la Commission institutionnelle soin et l&#39;utilisation des animaux Ohio State University (utilisation animale numéro de protocole 2009A0134-R1). 1. Préparation de transport viral moyen de prélèvement des échantillons et flacons <ol><li> Ajouter 37 g de Brain Heart Infusion à 900 ml d&#39;eau purifiée et bien mélanger avec une barre d&#39;agitation et d&#39;agitateur magnétique tout en chauffant à 70 ° C pour dissoudre complètement la poudre. </li><li> Autoclaver le bouillon à 121 ° C pendant 15 min. Laisser refroidir sur la paillasse jusqu&#39;à ce que le bouillon atteigne la température ambiante. Réfrigérer à 4 ° C pendant la nuit si nécessaire. </li><li> Dissoudre, par mélange avec un barreau d&#39;agitation magnétique, 6,02 g de sel de sodium de pénicilline G et 10 g de sulfate de streptomycine dans 50 ml d&#39;eau purifiée à la température ambiante. Ajouter de l&#39;eau purifiée supplémentaire pour porter le volume total à 100 ml. Filtrer la solution à travers une membrane de 0,22 um de polyéthersulfone dans un flacon stérile. </li><li> Ajouter stérilement la pénicilline filtré et la solution de streptomycine dans le cerveau refroidi Heart Infusion Broth et bien mélanger (barre d&#39;agitation ou turbulence flacon à la main) pour rendre le milieu de transport viral. </li><li> Aseptiquement tester le pH du milieu de transport viral; si nécessaire, ajuster le pH à 7,4 ± 0,2 en utilisant du HCl ou du NaOH. </li><li> Effectuer des tests d&#39;assurance qualité sur le milieu de transport viral en testant pour la grippe A protéine de matrice du virus par RT-PCR, comme décrit par Zhang et Harmon. 22 </li><li> Distribuer 5 ml de milieu de transport viral dans des bouteilles en polyéthylène haute densité stériles avec capacité de 8 ml. Étiqueter les flacons pour une utilisation dans le domaine. </li><li> Conserver les flacons prêts à l&#39;emploi dans cryo-boîtes standards à -20 ° C jusqu&#39;à ce que la collecte de l&#39;échantillon. </li></ol> 2. Collecte des nasale Lingettes de porcs <ol><li> Décongeler le nombre approprié de flacons immédiatement avant le prélèvement des échantillons; un flacon sera nécessaire par porc échantillonnée. Décongélation à mangertempérature dure environ 30 à 45 min. Conserver les flacons décongelés refroidir sur les paquets de glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Don équipement de protection individuelle approprié que dictées par la situation (par exemple, une combinaison, des couvre-bottes, masque respiratoire, des bouchons d&#39;oreille, etc.). </li><li> Entrez dans la zone de l&#39;animal. Si nécessaire, limiter le cochon à une petite zone mais ne retenir aucune. Ne pas réveiller de repos des animaux. </li><li> Mettez une paire de gants d&#39;examen jetables. Prenez soin de ne pas contaminer les gants par les porcs touchant, des personnes ou des objets inanimés. </li><li> Utilisez une main gantée pour enlever un stériles 5,08 cm x 5,08 cm (2 po. X 2 po.) Coussin de gaze de coton de son emballage. Tampons de gaze stériles doivent être utilisées autant que possible. Tampons de gaze emballées individuellement sont plus faciles à utiliser que ceux enveloppé avec deux tampons de gaze par paquet. </li><li> Maintenez le pad de gaze de coton avec les doigts d&#39;une main exposer autant de la tablette que possible pour l&#39;échantillonnage. </li><li> Essuyez le tampon de gaze sur le museau du porc, en prenantdes précautions supplémentaires pour saisir les narines externes, si possible. Recueillir les sécrétions nasales visibles (environ 1 ml) avec le même tampon de gaze. </li><li> Utilisation de la même main, plier le tampon de gaze sur lui-même pour faciliter le placement dans le flacon contenant le milieu de transport viral. </li><li> Avec l&#39;autre main, retirez le bouchon du flacon et placer la compresse de gaze plié dans le flacon. Reboucher le flacon et agiter le flacon pour assurer le mélange du tampon de gaze et de milieu de transport viral. </li><li> Retirer les gants et les placer dans un récipient approprié. Changer de gants entre chaque porc. </li><li> Vérifiez l&#39;identifiant flacon. Numéro d&#39;identification de porc, l&#39;âge, le sexe, les signes cliniques, et d&#39;autres notes jugées nécessaires par l&#39;enquêteur. </li><li> Réfrigérer les échantillons immédiatement après le prélèvement. Pensez à faire des aliquotes de l&#39;échantillon avant de le congeler afin d&#39;éviter de multiples cycles de gel-dégel. Dès que possible après la collecte, placer les échantillons sur glace sèche pour le transport au laboratoire. Conserver les flacons à -80° C jusqu&#39;à ce que le test est initié. </li></ol> 3. Détection du virus grippal A Nucleic Acid <ol><li> Décongeler les échantillons dans un bain de perles sec 37 ° C pendant 5 min, puis terminer la décongélation les échantillons sur la paillasse à température ambiante pendant 20-30 min. L&#39;addition simultanée de plusieurs flacons à billes entraîne le bain à chauffer; il faut être prudent pour ne pas surchauffer les flacons. </li><li> Retirer 100 pi de milieu de transport viral pour l&#39;extraction de l&#39;ARN. <ol><li> Utiliser un débit élevé (format de plaque à 96 puits) magnétique de la plate-forme de talon pour extraire l&#39;ARN à partir d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons. 31 </li></ol></li><li> Utilisation essais de PCR de la transcriptase inverse en temps réel pour la détection rapide de la grippe A de virus. 31 </li></ol> 4. L&#39;isolement du virus grippal A partir Lingettes nasaux <ol><li> Décongeler les échantillons comme décrit ci-dessus à la section 3.1 </li><li> Traiter les échantillons décongelés avec le sulfate de gentamicine (1000ug / ml), de l&#39;amphotéricine B (22,5 pg / ml), et du sulfate de kanamycine (325 ug / ml). </li><li> Inoculer dans Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) des cellules épithéliales comme décrit précédemment. 32 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Prélèvement d&#39;échantillons provenant de porcs en utilisant des écouvillons nasaux polyester pointe est avéré utile dans la conduite de la surveillance IAV; Cependant, l&#39;utilisation de la procédure de l&#39;écouvillon nasal entrave les efforts de surveillance en raison de l&#39;utilisation obligatoire de un piège à la retenue. Lingettes nasales représentent un raffinement des techniques porcine actuelles d&#39;échantillonnage pour minimiser le stress sur les personnes et les porcs lors de la collecte de l&#39;échantillon. Alors que la méthode a été développée et validée dans les paramètres exposition de porcs, il peut facilement être appliquée à d&#39;autres situations où la détection ante mortem de l&#39;IAV chez le porc est nécessaire (c. porcine commerciale, marchés d&#39;animaux vivants, la recherche biomédicale, etc.) Comme indiqué plus haut, le principal moteur de cette technique d&#39;échantillonnage a été la population exposition porcine. Pendant les foires agricoles, les propriétaires de porcs sont en concurrence pour obtenir des récompenses financières et la notoriété basée sur la composition globale du cochon. Des preuves empiriques indiquent que si un cochon ne montre pas bien, osociété respectiv peuvent attribuer à le niveau de stress du porc au cours de retenue et de collecte de l&#39;échantillon. Lingettes nasales sont utiles pour les efforts de surveillance qui impliquent des animaux individuels échantillonnage dans des milieux qui nécessitent une faible stress des animaux. La capacité à éviter la prise au collet et les porcs visiblement pénibles tout en effectuant le nasale essuyez technique a amélioré l&#39;acceptation du public des efforts de surveillance VIA dans l&#39;exposition porcine. 33 La faible nature du stress de la nasale essuyer procédé permet également bien adapté pour les fermes porcines commerciales. En outre, la nasale essuyer méthode peut aider à réduire les coûts, car il nécessite moins de personnel et ne prescrit pas de formation spécialisée. En plus de tampons nasale, une autre forme couramment utilisée de détection de pathogènes dans porcine commerciale consiste à permettre porcs qui sont logés ensemble à mâcher sur une corde de coton qui a été placé dans leur enclos. Ils déposent fluides oraux qui peuvent être collectées à partir de la corde. 27,34,35 orale fluide collection produRésultats de la CES qui sont basés sur des échantillons prélevés à partir d&#39;un groupe d&#39;animaux et a des limitations pour les études de prévalence ou de transmission pathogène. En outre, l&#39;IAV isolement des fluides oraux a été médiocre. 29 fluides oraux ont été utilisés pour les porcs individu, mais le temps nécessaire pour accrocher les cordes et pour les porcs pour saturer les cordes peuvent être inefficaces pour les ressources en personnel. 36 Utilisation de lingettes nasales permet pour la l&#39;évaluation rapide des animaux individuels. La capacité à la fois de détecter et isoler de lingettes IAV nasales fournit un avantage distinct sur les fluides oraux. Comme d&#39;autres méthodes d&#39;échantillonnage, lingettes nasales peuvent être plus efficace lors de l&#39;excrétion virale pic. Il ya quelques limitations associées à la nasale Essuyez méthode qui devrait être pris en considération avant la mise en œuvre de la procédure. Les porcs sont des animaux curieux que root avec leur museau. Souvent, il ya plus de débris recueillis sur une nasale essuyer, par rapport aux écouvillons nasaux, en raison de l&#39;environnement sale et humidela lingette contacts à l&#39;extérieur du museau de porc. Le contact entre le substrat et nasale essuyer le racleur est limitée à une surface plus externe des voies respiratoires nasales de tampons, une situation qui se traduit souvent par un dépôt non intentionnelle de débris de l&#39;environnement (c.-à litière, d&#39;aliments, de fumier, etc.) sur le nasal lingettes. Ces contaminants environnementaux peuvent inhiber la PCR ou provoquer une toxicité cellulaire lors de tentatives d&#39;isolement viral. La propreté de l&#39;emplacement de l&#39;échantillonnage et des niveaux de débris de l&#39;environnement peut avoir besoin d&#39;être évalués avant de procéder à nasale essuyer protocoles. L&#39;apparition de contamination de l&#39;environnement de lingettes nasales signifie également que IAV détecté avec cette méthode peut ne pas avoir été versé par l&#39;animal testé, mais était présent dans l&#39;environnement. Bien que la capacité d&#39;attribuer un IAV isoler à un animal particulier peut ne pas être un sujet de préoccupation pour les activités de surveillance ou d&#39;un troupeau en fonction des diagnostics, ce peut être une limitation à considérer pour laboratoire à base de trétudes de ansmission. Une autre question qui doit être traitée avant de choisir cette méthode est le stockage et le transport d&#39;espace accru que de grands nombres de nasale essuyer échantillons auront besoin. Les flacons utilisés pour les lingettes sont beaucoup plus grandes que les flacons de stockage 2 ml cryogéniques standards utilisés pour le stockage nasale écouvillon et prennent environ trois à quatre fois plus d&#39;espace de congélateur pour le stockage à long terme et de l&#39;espace refroidisseur pour le transport au laboratoire. Stocker des échantillons pour des périodes de temps prolongées à température ambiante, sous réfrigération ou congélation-décongélation les échantillons seront tous entraîner une diminution de la viabilité du virus. Un soin particulier doit être pris lors de la décongélation de ces échantillons. Parce que la gaze absorbe une grande partie du milieu de transport viral, les échantillons seront surchauffer rapidement dans un bain de perles sec. Surchauffe par inadvertance les échantillons au cours du processus de décongélation peut également entraîner une diminution de la viabilité du virus. Aussi, en raison de la reprise diminué IAV in vitro à partir lingettes maquetteARED de tampons, il est recommandé que nasale lingettes pas être utilisé dans des situations nécessitant une haute sensibilité pour la récupération de virus viable. 30 L&#39;utilisation réussie de la surveillance IAV chez les porcs par la nasale essuyer méthode peut aboutir à une plus grande facilité de l&#39;échantillonnage, l&#39;acceptation accrue des efforts de surveillance, et moins de stress sur les animaux. Dans l&#39;avenir, il peut être utile pour l&#39;échantillonnage des porcs dès l&#39;entrée à une foire ou pour des tests à faible stress de porcs individuels dans les troupeaux de porcs commerciaux. Cette méthode pourrait être étudiée pour détecter d&#39;autres pathogènes respiratoires chez les porcs utilisation. Parce que les porcs jouent un rôle essentiel dans l&#39;émergence de nouvelles souches IAV, a continué la surveillance active de l&#39;IAV chez les porcs est critique. En tant que tel, cette méthode peut aider à l&#39;enquête épidémiologique et de détection des souches émergentes de nouveaux IAV.

<html> Les virus grippaux A (IAV) provoquent des maladies respiratoires chez de nombreuses espèces, y compris les oiseaux domestiques, les porcs et les humains. En raison de réassortiment du génome IAV segmenté évolution virale rapide peut se produire et de nouvelles souches IAV sortir fréquemment. Les porcs sont une espèce qui peut servir comme une cuve de mélange pour réassortiment des IAV d&#39;espèces hôtes multiples. 1 Il existe actuellement trois principaux sous-types de l&#39;IAV couramment circulant chez les porcs en Amérique du Nord (H1N1, H1N2, H3N2), mais de multiples introductions de VIA de l&#39;homme ont a conduit à une vaste diversité IAV au sein de ces sous-types. 2 évolution rapide des IAV infectant les porcs a été évidente depuis 1998 quand un triple réassorti IAV contenant des segments de gènes provenant de virus humain, aviaire et porcine 3 est répandue chez les porcs aux États-Unis. 4 Le gène interne segments de cette triple réassorti IAV restent très fréquente chez IAV infectant actuellement porcine. 5 &quot;&gt; Dans le monde entier, l&#39;IAV est une cause importante de maladie respiratoire chez les porcs présentant des signes cliniques typiques comprennent la fièvre, anorexie, léthargie, toux, respiration laborieuse, les éternuements, l&#39;écoulement nasal et le gain de poids insuffisant. IAV peut être particulièrement coûteux pour semer fermes où la reproduction échec en raison de la fièvre induite IAV et de porcelets chétifs-né ont été documentés. 6,7 Aux États-Unis, l&#39;IAV est couramment détectée dans les troupeaux de porcs commerciaux et la diversité antigénique et génomique étendue et l&#39;évolution continue entre IAV porcine infecter a entravé le contrôle de cette virus. 11/08 Santé Les préoccupations du public au sujet de l&#39;émergence d&#39;une souche IAV pandémie résultant d&#39;un réassortiment chez le porc ont été réalisé en 2009 quand un IAV porcine lignée contenant des segments de gènes de la lignée porcine nord-américaine triple réassorti et la lignée porcine aviaire de type eurasien causé une pandémie mondiale chez les humains. 12 Le virus pandémique (A (H1N1) pdm09) a depuisréassorti avec des porcs souches endémiques IAV 13,14 et certaines de ces nouvelles souches ont été réassortis transmis en retour à l&#39;homme. 15 La fréquence des événements réassortiment et émergence de nouvelles souches IAV à potentiel pandémique rend la surveillance active des virus circulant chez les porcs IAV impératif, en particulier à l&#39;interface de porc-humain. L&#39;interface de la peste humaine est important pour bi-directionnel de la transmission interespèces de l&#39;IAV. Human-à-porcine transmission se produisant dans la production porcine commerciale est responsable d&#39;une grande quantité de IAV diversité actuellement présent dans la population porcine. Les foires agricoles sont les plus grands paramètres de la mêlage des personnes et des porcs aux États-Unis et sont des sites pour la transmission zoonotique de l&#39;IAV. 15-21 En 2012 connus, lors de l&#39;épidémie de variante H3N2 IAV, 93% des cas signalés à la fréquentation une foire agricole dans les jours précédant l&#39;apparition de la maladie. 15 L&#39;analyse génomiquedes isolats viraux provenant de porcs d&#39;exposition par rapport aux isolats humains confirmé transmission zoonotique. porcine 21 Exposition infectés par IAV souvent ne présentent pas de signes cliniques de la maladie, 21-23 indiquant la nécessité de tests de diagnostic directs. L&#39;échantillonnage des porcs visiblement malades ne suffira pas à réussir à identifier la prévalence IAV chez les porcs et ne peut être invoquée pour identifier de nouvelles souches de l&#39;IAV émergents parmi les porcs. La surveillance active est absolument nécessaire pour la détection des souches émergentes de l&#39;IAV chez le porc et d&#39;évaluer leur menace à la fois pour les porcs et la santé publique. La plupart des activités de surveillance IAV sont volontaires et donc des méthodes peu perturbateurs sont nécessaires. Les trois principales procédures de prélèvement d&#39;échantillons ante mortem pour IAV infecter les porcs sont: écouvillons nasaux, des fluides oraux, et les lingettes nasales. Les recommandations actuelles pour échantillonner porcine individuelle pour détecter liste IAV l&#39;insertion de fibres synthétiques écouvillons dans les narines comme la méthode préféréepour recueillir les sécrétions nasales et les cellules épithéliales. 24,25 Parce que les porcs peuvent essayer d&#39;éviter cette procédure, une équipe de personnel qualifié doit retenir porcs soit manuellement ou avec un piège en fonction de la taille de l&#39;animal. 26 Le processus de retenue est laborieuse pour le personnel et stressant pour les porcs. En outre, l&#39;exposition des porcs sont souvent impliqués dans plusieurs compétitions à une foire de sorte que la perception de stress supplémentaire sur un animal de la concurrence peut faire propriétaires résistant aux efforts de surveillance. Avec probabilités de détection IAV allant de 80-100% dans IAV troupeaux infectés, fluides oraux sont devenus une alternative populaire aux écouvillons nasaux pour la détection moléculaire de l&#39;IAV dans les populations de porcs. 27,28 De plus, les fluides oraux peut offrir une fenêtre plus large de détection IAV que écouvillons nasaux après l&#39;infection initiale. Cependant, l&#39;isolement de l&#39;IAV fluides oraux a été problématique avec seulement 50% des tentatives d&#39;isolement du virus entraînant IAV récupération. 29 Utilisation de lingettes nasales en lieu et place des écouvillons nasaux cours de la surveillance chez les porcs IAV surmonte les limitations décrites ci-dessus. Lingettes nasales ne nécessitent pas l&#39;utilisation d&#39;un piège de retenue et peuvent être effectuées sans stresser les animaux ou les témoins de la procédure. Formation technique minimale est nécessaire pour recueillir des lingettes nasales, ce qui permet aux professionnels non-vétérinaires, y compris les propriétaires de porcs, de recueillir les échantillons de surveillance. Lingettes nasaux ont été précédemment par rapport aux écouvillons nasaux pour la détection et l&#39;isolement des virus de la grippe A et le 30 protocole détaillé pour cette méthode non invasive d&#39;échantillonnage est décrite ci-dessous.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BBL Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:360px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">211059</td>
			<td style="width:356px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin G Sodium Salt</td>
			<td style="width:360px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:119px;">021194537</td>
			<td>1500 u/mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td style="width:360px;">AMRESCO LLC</td>
			<td style="width:119px;">0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Solution</td>
			<td style="width:360px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B Solution</td>
			<td style="width:360px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S 24 25</td>
			<td>250 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:360px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">K2105</td>
			<td>5000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TPP Rapid Filtermax System</td>
			<td style="width:360px;">TPP Techno Plastic Products AG&#160;</td>
			<td style="width:119px;">99150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nalgen Diagnostic Bottles</td>
			<td style="width:360px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">342002-9025</td>
			<td>HDPE with white PP closure</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Dermacea Gauze Sponge, 8 ply</td>
			<td style="width:360px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441211</td>
			<td>5.08 cm &#215; 5.08 cm (2 in. &#215; 2 in)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrile Exam Gloves</td>
			<td style="width:360px;">Saftey Choice</td>
			<td style="width:119px;">19-170-010 (A-D)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal wipes for influenza a virus detection and isolation from swine

Surveillance des virus de l&#39;influenza A chez le porc est essentielle à la santé humaine et animale en raison de la grippe A virus évolue rapidement dans les populations de porcs et de nouvelles souches sont continuellement en train d&#39;émerger. Porcine sont en mesure d&#39;être infecté par diverses lignées de virus influenza A qui les rend hôtes importants pour l&#39;émergence et le maintien de la nouvelle grippe A souches de virus. L&#39;échantillonnage des porcs dans divers contextes tels que les fermes commerciales porcs, les foires agricoles et les marchés d&#39;animaux vivants est important de fournir une vue complète des souches actuellement en circulation IAV. L&#39;ante-mortem technique d&#39;échantillonnage de l&#39;étalon-or actuel (collecte des écouvillons nasaux) est un travail intensif car il nécessite la contention physique des porcs. Lingettes nasales impliquent frotter un morceau de tissu à travers le groin du porc avec peu ou pas de retenue de l&#39;animal. Le nasale essuyer procédure est simple à réaliser et ne nécessite pas de personnel avec vétérinaire ou de formation professionnelle de la manipulation des animaux. Wien que légèrement moins sensibles que les écouvillons nasaux, les taux de détection de virus et d&#39;isolement sont suffisants pour faire nasale essuie une alternative viable pour l&#39;échantillonnage de porcs individuels lorsque les méthodes d&#39;échantillonnage faible de stress sont nécessaires. Le protocole de procédure décrit les étapes nécessaires pour recueillir une nasale viable essuyer d&#39;un porc individuel.

L&#39;utilisation réussie de cette méthode donne des résultats RRT-PCR qui, accompagnée de l&#39;utilisation d&#39;un contrôle interne lors de l&#39;extraction de l&#39;ARN et RT-PCR, montrent des échantillons ne contiennent des inhibiteurs de PCR de tout débris de l&#39;environnement ramassé lors de l&#39;échantillonnage. Après inoculation échantillon, puits d&#39;isolement du virus devraient être libres de débris de l&#39;environnement visible de l&#39;échantillon. Il ya un accord raisonnable entre les résultats RRT-PCR et les résultats d&#39;isolement du virus avec la compréhension que la PCR donne souvent un taux positif supérieur IAV que l&#39;isolement du virus, car PCR détecte acide nucléique viral, pas de virus nécessairement viable. Les résultats montrent que les lingettes nasales sont une alternative utile aux écouvillons nasaux, qui sont la technique d&#39;échantillonnage standard actuel de l&#39;or pour l&#39;IAV. Edwards et al. A effectué une comparaison des lingettes de museau et les écouvillons nasaux qui ont été collectées à partir de porcs dans les foires agricoles aux États-Unis au cours de 2013. Dans cette étude, les porcs ont été échantillonnées à la fois nasaleécouvillons nasaux et les lingettes et les échantillons ont été essai en parallèle avec RRT-PCR et l&#39;isolement du virus. Edwards et al. déclaré la concordance à la fois pour la détection et l&#39;isolement de l&#39;IAV par RT-PCR et l&#39;isolement du virus dans les cellules cultivées a été démontrée par la comparaison de la 553 écouvillon nasal jumelé nasale et essuyez échantillons. Sur ces 30 échantillons testés, 93,5% (517/553) des résultats des tests RRT-PCR étaient d&#39;accord (tableau 1) et 92,4% (511/553) étaient d&#39;accord en utilisant l&#39;isolement du virus dans les cellules MDCK (tableau 2). 21 La sensibilité RRT-PCR estimé pour lingettes nasales par rapport aux écouvillons nasaux était 92,9% et la sensibilité de l&#39;isolement IAV estimé pour lingettes nasales par rapport aux écouvillons nasaux était de 82,9%. Edwards et al., Précédemment noté que lingettes nasales qui étaient positifs à la fois par RT-PCR et l&#39;isolement du virus en moyenne une valeur inférieure Ct (24,32) de lingettes nasaux qui étaient positifs par RT-PCR mais négatifs pour l&#39;isolement du virus (Ct = 31,96). 21 Tableau 1: détection RT-PCR du virus grippal A partir des écouvillons nasaux et lingettes museau recueillies auprès porcine à 29 foires du comté (de Edwards et al (2014) utilitaire du museau lingette échantillons pour l&#39;influenza A la surveillance du virus dans les populations de porcs d&#39;exposition de la grippe et.. Autres virus respiratoires 8 (5), 574-579. <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/53313/53313table2.png" /> Tableau 2: Isolement du virus grippal A partir des écouvillons nasaux et lingettes museau recueillies auprès porcine à 29 foires du comté (de Edwards et al (2014) utilitaire du museau essuyer échantillons pour l&#39;influenza A la surveillance du virus dans les populations de porcs d&#39;exposition de la grippe et d&#39;autres virus respiratoires.. 8 (5), 574-579).

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Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

nasal-wipes-for-influenza-a-virus-detection-and-isolation-from-swine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K vues.  The Ohio State University. The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses. 

Vidéo: Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...