Nous remercions Dibbits Bert pour l&#39;assistance technique. L&#39;élevage et du Groupe de génomique, Université de Wageningen, Pays-Bas, nous a généreusement hébergé dans leur laboratoire. Le personnel de l&#39;Observatoire Ottenby Bird, la Suède, est remercié pour le piégeage et l&#39;échantillonnage des colverts, en particulier Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson et Stina Andersson. Nous remercions Sanne Svensson, Jonatan Qvist et Per-Axel Gjöres pour filmer au Ottenby, et Mano Camon pour le tournage dans le laboratoire. Daniel Bengtson fourni des photographies de canard magnifique pour la partie vidéo de cette publication. En outre matériau exempt de la Bibliothèque CDC Public Image Santé (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) a été utilisée: La microscopie électronique (n ° 280; par le Dr. Erskine Palmer) et de l&#39;illustration (n ° 11823; par Douglas Jordanie) du virus de la grippe. Un soutien financier a été donné par le KNJV (Royal Netherlands Association des chasseurs), le ministère néerlandais de l&#39;Agriculture, de l&#39;Faunafonds et la Stichting de fiducies Eik (à la fois aux Pays-Bas), le Conseil de recherche suédois (subvention aucune. 2007-20774) et la CE fondée Newflubird projet. Produits chimiques d&#39;isolement d&#39;ARN ont été un généreux don de Ambion, Inc, la compagnie ARN. Ceci est la contribution n ° 245 de l&#39;Observatoire Ottenby oiseaux.

1. Le piégeage de canard et d&#39;écouvillonnage cloacal <ol><li> Piège canards barboteurs de l&#39;Anas genre (ou d&#39;autres oiseaux) dans une cage en les attirant avec des canards leurre ou la nourriture, et les mettre dans des boîtes individuelles en carton. Le temps de transport dans la boîte devrait être maintenu au minimum, par exemple, en installant une station de terrain à une courte distance vers le piège. Logistique circonstances peuvent varier dans chaque étude. Les conseils et l&#39;approbation du comité d&#39;éthique pertinents animaux doit être recherchée pour chaque nouveau set-up. Alternativement, également chasseur de tir des oiseaux peuvent être échantillonnés. </li><li> Sortez le canard de la boîte en tenant ses ailes serrées à son corps. Goûtez à une chute frais, qui seront présents dans la plupart des cas, directement à partir du bas de la boîte. Ramassez-les avec un tampon stérile et appliquer le liquide à une carte de Whatman FTA. Si non, effectuer des écouvillonnage cloacal. </li><li> Tournez le canard sur son dos. Cela permet l&#39;accès au cloaque et facilite l&#39;échantillonnage. Le cloaque est une structure saillante située au-dessous de l&#39;abdomen, près de la base de la queue. Une personne expérimentée peut tenir et l&#39;échantillon de l&#39;oiseau dans le même temps, ou bien une deuxième personne peut aider. </li><li> Insérez soigneusement le plastique stérile de rayonne-tige (Copan, Italie) environ 1 cm et faire un tourbillon douceur du cloaque. Rouler l&#39;écouvillon avec les fluides du cloaque sur la surface d&#39;une carte de Whatman FTA. Après l&#39;échantillonnage a été effectué libération immédiate de l&#39;animal est souhaitable. </li><li> Sécher les cartes FTA à la température ambiante pendant au moins 1 heure, puis stocker chaque échantillon séparément dans des sacs en papier (enveloppes, par exemple). Le stockage est possible à température ambiante, éventuellement avec des billes de silice dans les climats humides. L&#39;envoi et la réception des agents des institutions de biosécurité peut permettre d&#39;envoyer des cartes FTA par courrier ordinaire, puisque les agents pathogènes deviennent inactifs au contact avec la surface de la carte FTA. </li></ol> 2. Isolement viral RNA <ol><li> Extrait du matériel, y compris les matières fécales carte FTA / fluide cloacaux. Punch trois disques avec un perforateur Harris mm 2 et placer tous ceux dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits sans RNase. Entre chaque nouvel échantillon, nettoyer le puncheur soigneusement avec de l&#39;alcool et une précision Kim essuyer (Kimtech). Toujours utiliser des contrôles positifs et négatifs. Un contrôle positif peut consister en une souche de laboratoire fraîchement appliqué à une carte FTA, ou un échantillon naturel qui est connu pour donner un résultat positif. Comme contrôle négatif, punch out disques à partir d&#39;une carte vide ALE. De plus, laisser un autre puits libre pour un contrôle PCR tard dans votre expérience (avec de l&#39;eau en tant que modèle). </li><li> Ajouter 70μl ARN solution d&#39;extraction rapide (Ambion) et la chaleur de la plaque d&#39;étanchéité (ABgene Thermo-Scelleur). Incuber 5 minutes sur un agitateur plaque à température ambiante avec la vitesse déterminée qui ne cause pas de débordement (cela dépend du modèle de plaque agitateur utilisé, test à l&#39;avance). </li><li> Carry virale isolement d&#39;ARN conformément aux protocoles du fabricant avec le Magmax-96 virale isolement d&#39;ARN kit (Ambion). En bref: Ajouter 130μl préparés lyse / solution de liaison (à partir du kit) à chaque puits. Transfert du matériel extrait 50 pl carte FTA à chaque puits. Agiter la plaque pendant 1 minute. </li><li> Ajouter 20 pi mélange préparé billes (à partir du kit) pour chaque échantillon et mélanger par pipetage de haut en bas. Agiter vitesse déterminée pendant 5 minutes. Molécules d&#39;ARN se lient à des billes magnétiques. </li><li> Déplacer la plaque à un champ magnétique de 96 puits pour capter tenir les perles. Selon le modèle du support magnétique utilisé, cela peut prendre plus de 5 minutes. Quand la solution est devenue complètement clair, retirer et jeter le surnageant. Ensuite, retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Laver les billes à deux reprises avec une solution de lavage et deux fois avec la solution de lavage 2 (à partir du kit). Pour chacune des 4 étapes de lavage ajouter 150μl de solution de lavage préparée à chaque échantillon, agiter pendant 1 minute à vitesse déterminée, déplacer la plaque au support magnétique, la capture des billes pendant environ 5 minutes (ou jusqu&#39;à ce que la solution est complètement clair), retirer et jeter le surnageant. Ensuite, retirer la plaque du socle magnétique, ajouter la solution de lavage suivant, et effectuer les étapes de lavage comme précédemment. Après la dernière étape de lavage, enlever la solution de lavage autant que possible et l&#39;air sec des perles à la température ambiante dans le shaker la plaque pendant 2 minutes. </li><li> Ajouter 50 pl de tampon d&#39;élution (à partir du kit) pour libérer l&#39;ARN à partir des perles et secouer pendant 4 minutes sur l&#39;agitateur assiette. Capturez des perles comme décrit précédemment. Le surnageant contient maintenant l&#39;ARN isolé, qui est prête pour les applications en aval. </li></ol> 3. RT-PCR du gène AIV Matrice Effectuer la transcription inverse PCR (RT-PCR) avec le One-Step RT-PCR d&#39;accès système (Promega) dans 25 réactions ul (ajusté de Kraus et al 18 et Fouchier et al 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 tampon </td&gt; <td> 5uL </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> apprêt M52C 22 (10 uM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> apprêt M253R 22 (10 uM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> Transcriptase inverse AMV (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Polymérase TfL (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Échantillon d&#39;ARN </td><td> 5uL </td></tr></tbody></table> Les conditions de PCR dans un thermocycleur Biometra T1 sont: première transcription inverse de 45 minutes à 45 ° C, suivi par 2 minutes dénaturation initiale à 94 ° C et 40 cycles de: 94 ° C pendant 1 minute, 56 ° C pendant 1 minute, et 68 ° C pendant 2 minutes. Un allongement supplémentaire de 7 minutes à 68 ° C conclut l&#39;amplification. 4. Le dépistage de l&#39;IA et les échantillons positifs pour la purification de fragments ciblés à partir de gel <ol><li> Charge 2μl du produit de PCR mélangés avec de la teinture de chargement 2μl 5x (BioRad) et de l&#39;eau 6μl sur un gel d&#39;agarose 1% (Roche) coloré au bromure d&#39;éthidium à 1% (2.5μl par 100 ml de gel) pour un examen préalable. </li><li> Exécutez le gel pendant 1 heure à 120 V, avec un standard de taille d&#39;ADN (BioRad EZ charge de 100 pb échelle), de visualiser avec un système de documentation de gel. Voir un exemple dans la figure 1. </li><li> Sélectionner des échantillons avec des fragments amplifiés dans la gamme de taille attendue (entre 200 pb et 300 pb (fragment cible est de 244 pb). Chargez le volume de réaction PCR entière (dont ~ 23μl sont à gauche) de ces candidats avec le colorant de chargement 6μl 5x sur un 2 bromure d&#39;éthidium% gel d&#39;agarose coloré et courir pendant 2 heures. </li><li> Placer le gel sur un transilluminateur UV (Bioblock Scientific) et inspectés visuellement. Voir un exemple dans la Figure 2. Des bandes d&#39;accise de la taille correcte du gel avec un scalpel et placées dans des tubes de réaction individuelle 1,5 ml. Purifier fragments de gel, par exemple avec le Kit Gel Zymoclean récupération de l&#39;ADN (Zymo Research). </li></ol> 5. Séquencement et identification des produits de PCR <ol><li> Effectuer séquençage Sanger des fragments cibles, par exemple sur un ABI 3730 séquenceur capillaire ABI avec Big Dye 3,1 chimie (Applied Biosystems). Préparer des réactions de séquençage dans des volumes 10 ul contenant 10-20 ng purifié sur gel matrice d&#39;ADNc, tampon de dilution 1.75μl 5x, 0.5μl Big Dye V3.1 prémélange, une primaire ul avant (M52C 20, 10 mM), et ddH2O. Cyclisme conditions sont: 1 min de dénaturation initiale, suivie par 25 cycles de: 10 s à 96 ° C, 5 s à 45 ° C et 4 min à 60 ° C. Purifier et préparer la réaction de séquençage selon vos protocoles internes. </li><li> Identifier les séquences d&#39;ADNc résultant des bases de données de nucléotides tels que GenBank23, par exemple en outils du web tels que BLAST au Centre national d&#39;information sur la biotechnologie (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Canard colvert (Anas platyrhynchos) ont été échantillonnées à Ottenby Bird Observatory en Décembre 2007. De chaque colverts un échantillon sur la carte FTA a été prise comme décrit dans ce protocole. Après l&#39;expédition, les cartes FTA ont été conservés dans un congélateur à -20 ° C pendant deux ans. L&#39;échantillon même carte FTA du laboratoire d&#39;isoler testé dans Kraus et al. 18 a été inclus comme contrôle positif, ainsi que neuf dilutions décuplé série d&#39;elle. Deux contrôles négatifs ont été i) l&#39;extraction à partir d&#39;une carte vide ALE, pour tester si il y avait report de la perforatrice, et ii) RT-PCR dans laquelle l&#39;eau sans nucléase a été utilisé comme modèle, afin de tester si la contamination s&#39;est produite pendant ou en préparation de la réaction PCR. 84 échantillons ont été analysés. Une image de gel des produits de PCR à partir de ces 84 échantillons peuvent être trouvés dans la figure 1. A partir d&#39;échantillons naturels d&#39;une multitude de bandes non spécifiques peuvent être observés en raison de la présence de contaminations microbiennes différentes dans les fèces. Toutefois, le fragment cible de la paire d&#39;amorces est de 244 pb. L&#39;ensemble réaction PCR volume d&#39;un sous-ensemble des échantillons qui produit des fragments dans environ la gamme de taille correcte (entre 200 pb et 300 pb) a été chargé sur gel (figure 1). Une illustration de la fourchette dans laquelle ont été coupés à partir du gel peut être trouvée dans une figure supplémentaire. En plus du contrôle positif, deux de ces échantillons (69 899 et 69 912) étaient positifs par le nouveau protocole. Une recherche BLAST contre la base de données NCBI nucléotides ont révélé leur identité en tant que matrice de l&#39;IA du gène (figure 3), tandis que toutes les autres bandes ressemblait séquences bactériennes les plus près, ou n&#39;ont pas donné une séquence lisible à tous. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Figure 1. Gel d&#39;image d&#39;une sélection préliminaire des produits de PCR. Produit 2 ul PCR de contrôle positif, sdilutions erial du contrôle positif, deux contrôles négatifs et 84 échantillons cloacaux ont été chargés. 48 échantillons sont présentés dans le panneau de gel de haut, et 48 échantillons dans le panneau inférieur. Les flèches rouges indiquent les voies de gel utilisé pour la norme 100 pb de taille d&#39;ADN. À titre d&#39;illustration, les cercles rouges montrent les bandes dans la gamme de taille attendue. Les cercles bleus indiquent un amplicon non spécifiques (en haut à gauche) ou d&#39;un artefact dimère primaire inférieure à 100 pb en taille (en bas à droite). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Figure 2. Des échantillons de sélection des échantillons avec des fragments de la gamme de taille correcte. Avec des bandes entre 200 pb et 300 pb (fragment de 244 pb cibles) ont été choisis. La flèche verte indique le contrôle positif, les deux flèches rouges indiquent les échantillons qui ont été confirmés positifs à l&#39;AIV en comparant leurs séquences d&#39;ADNc de la base de données NCBI nucléotides. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Figure 3. Capture d&#39;écran d&#39;une recherche BLAST au NCBI représentatives. Une des séquences d&#39;ADNc obtenue à partir des fragments excisés a été interrogé la base de données de nucléotides sur le site du NCBI. L&#39;échantillon est correctement identifié en tant que fragment du gène IA Matrix. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Pour voir une version pleine grandeur de cette image, cliquez ici.</a> <img alt="Figure 1 supplémentaire" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Figure S1 supplémentaire. Bandes d&#39;échantillons sélectionnés excisé du gel. Cette photo a été prise à partir du gel représenté dans la figure 1, après les bandes candidats entre 200 pb et 300 pb ont été coupés.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

Le piégeage, la manipulation et l&#39;échantillonnage d&#39;oiseaux ont été faits suivants législation nationale et ont été approuvés par le Conseil suédois de l&#39;Agriculture et de l&#39;animal comité d&#39;éthique.

Le protocole décrit ici fournit une méthode complémentaire à l&#39;écran des échantillons fécaux ou similaires pour la présence de l&#39;AIV. Il a été spécialement conçu pour rendre la collecte d&#39;échantillon rapide et facile. Cela permet aux personnes de moins formés, comme les chasseurs ou les gestionnaires de la faune, de contribuer à la surveillance de l&#39;IA. Pas de chaînes de froid doivent être appliquées, bien que la congélation des échantillons est recommandée lorsque cela est possible. A quelques jours de la température ambiante, par exemple lors du transport vers le laboratoire, ne sont pas un problème pour les molécules d&#39;ARN sur les cartes FTA, aussi longtemps que les cartes sont restées sèches. D&#39;autres systèmes de stockage non-refroidis qui sont actuellement évaluées par la communauté de la recherche, comme l&#39;alcool 15 ou 16 guanidine, nécessitent des dispositions spéciales d&#39;expédition en raison de leur caractère dangereux. En revanche, la méthode carte FTA ne nécessite pas de transport de matières dangereuses. Cependant, un autre support de stockage intéressante à cet égard est RNAlater ™ qui n&#39;est pas dangereux, soit 17. L&#39;analyse des échantillons peut être effectuée dans n&#39;importe quel laboratoire moléculaire standard. Aucun équipement spécial autre que pour les réactions PCR et séquençage d&#39;habitude capillaire a été nécessaire. Toutes les mesures qui pourraient être réalisées sans un niveau de biosécurité, car déjà à la collecte de l&#39;échantillon des agents pathogènes potentiels ont été inactivés par l&#39;activité antibactérienne et antivirale de la carte FTA. Contamination croisée et ultérieures faux échantillons positifs n&#39;ont pas été observés lors de nos essais avec des échantillons d&#39;oiseaux sauvages. Toutefois, lorsque l&#39;on travaille avec de l&#39;ARN et PCR, il est toujours conseillé de porter une attention particulière à la propreté des lieux de travail et de salles séparées pour les étapes pré-et post-PCR. Travailler sous une hotte diminue le risque de contamination par aérosol dans le laboratoire. Pipetage doit être effectuée avec des conseils de filtre. Partir d&#39;une étude précédente sur des échantillons prélevés simultanément à partir des canards mêmes, nous savons que six des 84 échantillons étaient positifs par le RealTime traditionnelle méthode RT-PCR 24 et les valeurs Ct de Realtime RT-PCR sont connues. Les deux échantillons positifs détectés par notre méthode de la tige de canards qui avaient des valeurs de Ct &lt;30 (indiquant une forte concentration de l&#39;ARN viral). Les quatre autres échantillons qui étaient positifs avec le protocole traditionnel avait valeurs Ct&gt; 30 (moins concentré) et ne pouvaient pas être détectés par notre protocole. Seuls les échantillons avec des titres de virus relativement élevé ont été positifs dans notre test et il est probable que la sensibilité de la méthode a été la source de l&#39;échec de détecter tous les échantillons positifs. En outre, la taille de l&#39;échantillon de l&#39;étude actuelle a été très faible et la méthode peut être entièrement développé et évalué si des expériences plus contrôlé et rigoureux sont effectués. Cependant, si ces échantillons ont été collectés dans une zone distante, l&#39;analyse traditionnelle n&#39;aurait pas été possible du tout. De plus, ces premiers résultats proviennent des expériences pilotes qui ont besoin d&#39;une optimisation plus poussée. Une période de deux années de stockage dans un congélateur régulièrement -20 ° C après prélèvement probablement aussi affecté la qualité de l&#39;ARN viral. Cette dégradation possible de l&#39;ARN est une question importante lorsqu&#39;il s&#39;agit de stockage à température ambiante de virus inactivés. Les échantillons stockés dans les liquides alternatifs comme mentionné plus haut souffrent d&#39;une dégradation importante qui a des répercussions analyse des séquences plus longues de l&#39;génome viral 16. Bien que n&#39;étant pas testées dans notre étude, les cartes FTA se sont avérés bien adaptés pour préserver intactes les molécules d&#39;ARN dans les systèmes de l&#39;ARN d&#39;autres qui sont très similaires aux virus de la grippe aviaire 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif ou d&#39;un instrument </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Plastique de rayonne sèche-tige </td><td> Copan, Italie </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> ALE carte </td><td> Whatman </td><td></td><td> plusieurs options </td></tr><tr><td> Harris micro perforation 2mm avec tapis </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 96 puits Plaque </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> ou comparables </td></tr><tr><td> Kim précision lingettes </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> Solution d&#39;ARN extraction rapide </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> Magmax-96 Kit isolement viral </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step RT-PCR d&#39;accès du système </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> ou comparables </td></tr><tr><td> Agarose MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> polyvalent agarose </td></tr><tr><td> Tampon de chargement 5x </td><td> BioRad </td><td></td><td> livré avec échelle d&#39;ADN </td></tr><tr><td> Charge EZ 100 pb échelle </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> ou comparables </td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium à 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> ou comparables </td></tr><tr><td> Les tubes de réaction de 1.5ml </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> ou comparables </td></tr><tr><td> Zymoclean gel d&#39;ADN kit de récupération </td><td> Zymo recherche </td><td> D4001 </td><td> ou comparables </td></tr><tr><td> ABI Big Dye 3,1 chimie </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> ou comparables </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

Virus de l&#39;influenza aviaire (AIVs) infectent de nombreux mammifères, y compris les humains 1. Ces AIVs sont divers dans leurs hôtes naturels, abritant presque tous les sous-types viraux possibles 2. Pandémies de grippe humaine à l&#39;origine proviennent AIVs 3. Beaucoup de cas humains mortels au cours des flambées de H5N1 dans ces dernières années ont été signalés. Dernièrement, une souche nouvelle AIV liées balayé la population humaine, provoquant quatre «l&#39;épidémie de grippe porcine». Bien que les échanges humains et de l&#39;activité de transport semble être responsable de la propagation de souches hautement pathogènes 5, la dispersion peut également être attribuée en partie aux oiseaux sauvages 6, 7. Toutefois, le réservoir réel de toutes les souches AIV oiseaux sauvages. En réaction à cela et face à de graves pertes commerciales dans l&#39;industrie de la volaille, les programmes de surveillance ont été mises en œuvre de grandes globalement de recueillir des informations sur l&#39;écologie des AIVs, et d&#39;installer des systèmes d&#39;alerte précoce pour détecter certaines souches hautement pathogènes 8-12. Les méthodes traditionnelles nécessitent virologiques des virus à être intact et cultivées avant l&#39;analyse. Cela nécessite stricte des chaînes de froid avec des congélateurs et lourdes procédures de biosécurité à mettre en place pendant le transport. Surveillance à long terme est donc généralement limitée à une des stations de terrain proche de quelques laboratoires bien équipés. Les régions éloignées ne peuvent être prélevés si des procédures sont mises en œuvre logistique lourde. Ces problèmes ont été reconnus 13, 14 et l&#39;utilisation du stockage et de stratégies alternatives de transport étudiés (alcools ou guanidine) 15-17. Récemment, Kraus et al. 18 a introduit une méthode pour collecter, stocker et transporter des échantillons AIV, basé sur un papier spécial filtre. ALE cartes 19 préserver l&#39;ARN sur une base de stockage à sec 20 et rendre inactifs les agents pathogènes au contact 21. Cette étude a montré que les cartes FTA peut être utilisé pour détecter l&#39;ARN dans AIV transcription inverse PCR et que l&#39;ADNc résultant pourrait être séquencé les gènes du virus et déterminé. Dans l&#39;étude de Kraus et al. 18 un laboratoire d&#39;isoler de l&#39;AIV a été utilisé, et des échantillons ont été traités individuellement. Dans le prolongement présentées ici, des échantillons fécaux provenant d&#39;oiseaux sauvages de la trappe de canard à l&#39;Observatoire Ottenby Bird (SE Suède) ont été testés directement à illustrer l&#39;utilité des méthodes sur le terrain. Attraper des canards et la collecte de l&#39;échantillon par écouvillonnage cloacal est démontrée. Le protocole actuel comprend up-scaling du flux de travail d&#39;une manipulation simple tube à une conception de 96 puits. Bien que moins sensible que les méthodes traditionnelles, la méthode de l&#39;ALE cartes fournit un excellent complément aux régimes de surveillance important. Il permet la collecte et l&#39;analyse des échantillons provenant de partout dans le monde, sans la nécessité de maintenir une chaîne du froid ou de règles de sécurité à l&#39;égard de l&#39;expédition des réactifs dangereux, comme l&#39;alcool ou la guanidine.

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Une méthode pour préserver, de détecter et de séquence d&#39;ARN à partir des virus grippaux aviaires a été validé et étendu en utilisant des échantillons de fèces naturelle des oiseaux. Cette technique élimine la nécessité de maintenir une chaîne du froid et la manipulation des virus infectieux et peuvent être appliquées dans un de 96 puits à haut débit de configuration.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K vues.  Wageningen University. Une méthode pour préserver, de détecter et de séquence d'ARN à partir des virus grippaux aviaires a été validé et étendu en utilisant des échantillons de fèces naturelle des oiseaux. Cette technique élimine la nécessité de maintenir une chaîne du froid et la manipulation des virus infectieux et peuvent être appliquées dans un de 96 puits à haut débit de configuration.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L&#39;utilisation d&#39;un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modélisation du cycle de vie du virus Ebola Sous biosécurité de niveau 2 Conditions de particules de type viral contenant Tetracistronic minigénomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.