Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines. Le Mexique est un pays avec un potentiel d’élevage considérable. Les États où l’élevage est le plus élevé contiennent à la fois des régions tropicales humides et des régions sèches à risque d’épidémies de rage en raison de la présence de la chauve-souris vampire, Desmodus rotundus, principal émetteur de la rage.
La détection du gène N de nucléoprotéine de virus de rage est principalement employée pour le diagnostic de rage par des essais moléculaires. À l’aide d’approches basées sur la PCR, des quantités minimales d’un agent infectieux peuvent être détectées dans un échantillon clinique par l’amplification sélective et répétitive d’une séquence de nucléotides d’ADN. qRT-PCR est basé sur la détection et la quantification d’une molécule où les augmentations de signal de fluorescence sont en proportion directe de la quantité de produit PCR en une seule réaction.
À mesure que le nombre de copies de la cible de l’acide nucléique augmente, la fluorescence augmente également. Sur cette base, l’objectif de l’étude était d’utiliser qRT-PCR quantitative pour déterminer le nombre de particules virales dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin, après la mort, en raison de l’infection à la rage. L’ARN total a été extrait directement des cerveaux bovins à l’aide d’une méthode d’extraction organique selon le protocole suivant.
Utilisez 100 milligrammes de tissu cérébral de chaque structure anatomique pour extraire l’ARN total à l’aide d’un réaccélérable disponible dans le commerce contenant de l’isothiocyanate de guanidinium. Homogénéiser manuellement un total de 100 milligrammes de tissu de chaque structure en un millilitre du réagent d’isothiocyanate de guanidinium par vortexing à l’aide d’un homogénéisateur Dounce avec un petit pilon à l’intérieur du microtube pendant 15 secondes à la vitesse maximale. Incuber les échantillons sur la glace pendant cinq minutes, puis ajouter 200 microlitres de chloroforme.
Mélanger vigoureusement les échantillons pendant 15 secondes. Incuber sur la glace pendant deux à trois minutes, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 15 minutes à quatre degrés centigrades. Transférer la phase aqueuse dans un tube propre et ajouter 500 microlitres d’alcool isopropylique.
Incuber les échantillons pendant 15 minutes à 21 degrés centigrades. Centrifugeuse les échantillons à 12 000 x g pendant 10 minutes à 4 degrés centigrades. Aspirer le supernatant aqueux par pipetting.
L’ARN isolé sera présent comme granulé dans le tube. Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec un millilitre de 75% d’éthanol par pipetting et centrifugeuse à 7500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés centigrades. Décanter le supernatant et sécher à l’air le granulé d’ARN à température ambiante, 21 degrés centigrades.
Ensuite, diluer la pastille dans 50 microlitres d’eau sans nucléase. Déterminer la concentration et la qualité de l’ARN à 260 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. La transcription in vitro génère l’ARNm d’un gène cible.
Utilisez une paire d’amorce qui amplifie le gène RABV N complet, et qui est utilisé comme un contrôle positif pour l’analyse qRT-PCR. Ces amorces sont conçues pour amplifier le gène RABV N complet, et pour ajouter un promoteur qui reconnaît la polymése T7. Pour amplifier l’ensemble du gène N RABV, utilisez les amorces trans et RAB vers l’avant et vers l’arrière, ainsi qu’un kit PCR haute fidélité.
Pour chaque réaction, préparez un mélange principal PCR en ajoutant à un tampon de réaction propre de tube PCR avec 10 micromolaire de chaque amorce et 0,5 unité de polymése haute fidélité. Pour utiliser le produit PCR comme modèle pour la synthèse in vitro et pour supprimer les composants de la réaction enzymatique, purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit concentrateur basé sur la colonne, selon les instructions du fabricant. Et puis quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.
Pour la synthèse de l’ARN, utilisez une trousse de transcription in vitro avec le mélange de réaction suivant : cinq microlitres T7 transcription 5X tampon, 1,9 microlitres de chaque nucléotide triphosphate, 10 microgrammes d’ADN RABV N purifié, et 2,5 microlitres du mélange enzymatique. Ensuite, incuber le mélange à 37 degrés centigrades pendant quatre heures. Ensuite, ajouter un microlitre d’une unité par microgramme Rnase-Free DNase au mélange de réaction et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés centigrades pour éliminer la contamination par l’ADN.
Purifier l’ARN transcrit in vitro, puis le concentrer à l’aide de phénol: chloroforme: alcool isoamyle à un rapport de 25:24:1. Resuspendez la pastille d’ARN purifiée en 70 microlitres de tampon TE, puis conservez-la à 80 degrés centigrades jusqu’à utilisation. Répétez le protocole PCR jusqu’à ce qu’environ cinq microgrammes de produit PCR soient obtenus.
Après purification et concentration, l’ARNm transcrit in vitro du gène N sera présent à une concentration de 4.711 microgrammes par microlitre. Confirmez que l’ARNm transcrit in vitro correspond au gène N suivant l’étape cinq de ce protocole, et utilisez-le comme un contrôle positif pour la réaction en chaîne de polymésexe de transcription inverse en temps réel, qRT-PCR. Pour une réaction en chaîne de polymése de transcription inverse en temps réel, utilisez une transcription in vitro de l’ARNm pour coder le gène N complet comme un contrôle positif.
Avec un kit commercial qRT-PCR en une étape, utilisant des sondes d’hybridation selon les instructions du fabricant. Utilisez la sonde dans les amorces décrites par Coronado et son collègue 2010 pour détecter une région conservée du RABV en utilisant les conditions de cycle thermique suivantes. Effectuer des dilutions périodiques de l’ARNm transcrit in vitro en pipetant périodiquement un microgramme par microlitre d’ARNm en tubes jusqu’à ce que six dilutions découplées soient obtenues.
Préparez des tubes à un volume de 100 microlitres en triplicate pour une utilisation dans la création de la courbe standard. Effectuez qRT-PCR comme décrit précédemment. Effectuez qRT-PCR dans un cycleur thermique avec un rotor en traitant les différents échantillons de cerveau simultanément avec les réactions de fonctionnement pour créer une courbe standard et en utilisant des contrôles positifs, des contrôles négatifs et des supernatants isolés de la culture cellulaire.
Pour évaluer la limite de détection, d’efficacité des tests et de sensibilité du test, utilisez une courbe standard en triplicate dans les mêmes conditions. Pour la détection du gène RABV N, utilisez l’ARN à partir d’échantillons sur le terrain, de contrôles positifs, de contrôles négatifs et de supernatants de culture cellulaire pour effectuer qRT-PCR à l’aide du kit PCR décrit précédemment. Pour déterminer le nombre de copies du génome rabv présent dans les échantillons de cerveau bovin, obtenir des données de CT à partir de la courbe standard et des échantillons biologiques, et de ceux interpolés à partir de l’équation de courbe d’étalonnage Ce chiffre montre les tissus cérébraux bovins présentant une coloration positive en fonction de l’immunofluorescence directe.
Les résultats montrent 100%100%83.3%66%et 50%positivité pour RABV dans le cortex, thalamus, medulla, pons, et corne respectivement. Ces résultats confirment les résultats précédents, et au moins trois des structures disséquées de chaque cerveau étaient positives pour RABV. D’autre part, l’équation de la courbe standard montre la relation entre la quantité de contenu génétique RABV dans l’échantillon et la taille du fragment amplifié par pcr.
La quantité de contenu génétique RABV dans les nanogrammes a été déduite par interpolation des valeurs de CT dans la courbe d’étalonnage en utilisant l’équation présentée dans ce chiffre. À l’aide de cette équation, la limite de détection d’une fois 10 à la cinquième microgramme par microlitre d’ARN viral correspondait à 36 copies du génome du RABV. Ces résultats démontrent que l’analyse est sensible et peut être utilisée pour détecter le virus dans des échantillons qui contiennent un faible nombre de copies du gène RABV N.
L’efficacité de l’essai a été calculée à l’aide de la pente de la courbe standard, qui était de 3,28. Les échantillons utilisés pour qRT-PCR ont montré l’amplification du gène RABV N. Pour déterminer le nombre de copies virales présentes, les valeurs de CT pour chaque échantillon ont été interpolées à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage.
Les résultats obtenus en nanogrammes ont été substitués à la formule décrite ici. Ce tableau montre les résultats comparatifs entre qRT-PCR et DFA. Les résultats des analyses qRT-PCR étaient compatibles avec ceux obtenus à l’aide de DFA.
Selon les résultats obtenus dans le test qRT-PCR dans les cas C et D, le thalamus est la structure qui possède le plus grand nombre de copies du gène RABV N. Ceci suggère que l’infection tôt des neurones hypothalamic et thalamic soit importante dans le développement de la maladie, étant donné que ces neurones contrôlent les fonctions végétatives d’un animal. Les numéros de copie du gène RABV N qui ont été détectés dans chaque structure de chaque échantillon sont: la sensibilité et la spécificité du test qRT-PCR, nous sommes tous deux à 100%, car tous les échantillons étaient positifs.
Ce résultat est compatible avec les diagnostics initiaux des échantillons. qRT-PCR est une technique très sensible. Certaines des étapes sont essentielles pour obtenir les meilleurs résultats.
L’un d’eux est la manipulation appropriée des échantillons pour l’extraction de l’ARN. Cette étape est cruciale car l’ARN est facilement dégradé et les résultats pourraient donc être affectés. Envisagez de maintenir l’échantillon dans des conditions froides, environ quatre degrés centigrades pendant le processus.
En outre, considérez que plusieurs séries d’application de PCR sont effectuées comme mentionné dans la transcription in vitro. L’analyse qRT-PCR menée dans cette étude pourrait détecter aussi peu que 36,3 copies du gène RABV N par milligramme de tissu. Les structures cérébrales les plus appropriées pour qRT-PCR comprenaient le cortex et le thalamus.
Ceci est basé sur les observations selon laquelle des concentrations plus élevées du gène RABV N ont été détectées dans ces structures, et qu’elles se sont également révélés positives à l’aide du test de référence RABV. Le test a été en mesure de détecter des concentrations très faibles, 0,00023 fois 10 à la neuvième copie du virus dans divers échantillons. En plus de quantifier les particules virales dans l’échantillon, le test semble fournir un bon outil alternatif de diagnostic et de recherche pour la détection du RABV présenté ici.
