Ce protocole est une approche utile pour isoler les virus associés aux moustiques et peut aider à poursuivre la recherche sur la distribution des agents pathogènes liés aux moustiques et le contrôle des maladies transmises par les moustiques. L’utilisation de lignes minces pour isoler les virus dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 est plus sûre et plus efficace. Contrairement à d’autres procédures d’isolement du virus, telles que l’inoculation rouge à cycle avec un liquide variable, cette technique ne nécessite pas d’expérimentation animale ou d’évaluation éthique.
La contamination par les échantillons et les cellules prélevées pendant l’incubation peut conduire à l’échec de l’expérience. Par conséquent, il est nécessaire d’ajouter 2% de pénicilline-streptomycine-amphotéricine dans le milieu pour éviter la contamination. Commencez par ajouter des billes de céramique de trois millimètres, 1,5 millilitre de milieu RPMI complété par une solution à 2% de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B dans un tube stérile de deux millilitres placé sur de la glace, puis transférez-y 50 moustiques.
Ensuite, homogénéisez les moustiques avec un homogénéisateur de tissus à basse température en broyant pendant 30 secondes à 70 hertz et 4 degrés Celsius pendant 3 cycles. Centrifuger l’homogénat à 15 000 G pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius et transférer les surnageants dans les nouveaux tubes. Pour éliminer complètement les débris de moustiques, centrifuger à nouveau le surnageant à 15 000 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.
Aliquote les 200 microlitres de surnageant P0 dans un tube de stockage à bouchon à vis de deux millilitres et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour l’amplification du virus, utilisez la lignée cellulaire de moustiques déficiente en ARNi d’Aedes albopictus C6/36 et une lignée cellulaire de vertébrés, un rein de bébé hamster ou BHK-21 provenant d’une fiole carrée de 75 centimètres et ensemencez-les séparément dans 24 plaques de puits. Placez la plaque de 24 puits ensemencée pendant la nuit à 28 ou 37 degrés Celsius.
Le lendemain, observez les cellules au microscope pour confirmer une confluence de 80 à 90% dans chaque puits. Préparez 500 millilitres du milieu de maintien de la culture cellulaire complété par des antibiotiques. Retirez le milieu de culture cellulaire des plaques de 24 puits et ajoutez 100 microlitres du milieu de maintenance de culture cellulaire à chaque puits.
Inoculez ensuite les cellules avec 100 microlitres du surnageant de l’homogénat de moustique ou P0. Incuber les plaques à 28 ou 37 degrés Celsius pendant 60 minutes et agiter doucement les plaques toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement des cellules. Une fois cela fait, retirez le surnageant et rincez chaque puits avec 600 microlitres de milieu de maintien de culture cellulaire pour éliminer complètement les débris. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de milieu de maintenance de culture cellulaire à chaque puits avant de placer les plaques dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 28 ou 37 degrés Celsius pendant 7 jours.
Surveiller quotidiennement l’état des cellules de chaque puits au microscope. Le septième jour, collectez le surnageant des cellules connues sous le nom de P1 et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Répétez la procédure pour recueillir les surnageants viraux P2 et P3.
En raison de l’effet cytopathogène, ou CPE, les cellules de certains puits meurent et se détachent de la surface. Pour amplifier considérablement les virus, prélevez 300 à 400 microlitres du surnageant dans des puits présentant l’effet CPE et transférez-le dans une nouvelle plaque à six puits ayant une confluence cellulaire de 80 à 90% de cellules de culture. Enfin, collectez et transférez 500 microlitres du surnageant des puits de la plaque de six puits vers des tubes de stockage à bouchon à vis de deux millilitres avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius.
L’inoculation des cellules C6/36 avec les homogénats de moustiques P0 a montré un large espace intercellulaire dans les cellules exfoliées 120 heures après l’infection par rapport aux cellules non inoculées ou témoins. L’incubation des cellules BHK21 avec les surnageants viraux P3 a démontré une ECP visible 48 heures après l’infection, montrant la mort de la cellule et le décollement de la surface contrairement aux cellules témoins. Des amorces universelles disponibles dans le commerce ou Flavivirus, Alphavirus et Bunyavirus ont été utilisés pour générer les produits PCR pour le surnageant viral.
Un produit PCR pour le Bunyavirus, le virus du lac Ebinur, a été défini comme témoin positif. Les interdictions d’amplification par PCR dans les couloirs appartenant aux Bunyavirus et le contrôle positif ont mis en évidence la possibilité de la présence de Bunyavirus dans les surnageants. Pour améliorer le taux de réussite de l’isolement du virus, maintenez une température basse pendant le transport, l’isolement et le broyage des échantillons.
Ajoutez des antibiotiques lors de l’homogénéisation des moustiques et de la culture elle-même. Et manipulez la culture rapidement pendant l’incubation et l’enlèvement du milieu de culture. En plus de cette procédure, la solution de broyage peut être injectée dans un embryon de rat ou de poulet à vélo.
Cependant, la procédure d’affirmation soulèvera des préoccupations éthiques et augmentera le coût de l’expérience.
