Étant donné que le débit microvasculaire varie d’un capillaires à l’autre et change en quelques secondes, une méthode de quantification continue du débit dans des champs entiers est nécessaire. Le personnel permet une mesure presque continue des vitesses de débit dans des champs de microscope entiers, en quelques heures, ce qui prendrait autrement des mois à obtenir manuellement. Bien que ces procédures soient simples, la démonstration visuelle aidera considérablement les nouveaux utilisateurs à naviguer dans le personnel pour la première fois.
Pour utiliser TrakEM2 pour définir le réseau vasculaire, sélectionnez d’abord Fichier, Nouveau et TrakEM2 Blank pour configurer un nouveau projet TrakEM2 vierge, et sélectionnez le nouveau dossier contenant l’image unique du film comme dossier de projet. Les fenêtres TrakEM2 s’ouvriront. Cliquez à droite dans la zone de travail principale et sélectionnez Image d’importation et d’importation.
Accédez à l’image enregistrée unique et sélectionnez l’image. Cliquez à nouveau à droite dans la zone de travail principale et sélectionnez Display et Auto Resize Canvas/LayerSet. Puis, cliquez à gauche dans la fenêtre de travail principale.
L’image remplira la zone de travail. Pour sélectionner les zones de l’image qui contiennent le réseau vasculaire, dans la plus petite fenêtre TrakEM2, cliquez à droite sur le modèle N’importe quoi, et sélectionnez Ajouter nouvel enfant et liste de zone. Dans la plus petite fenêtre TrakEM2, faites glisser le modèle N’importe quoi sur les objets du projet, projet sans titre.
Puis faites glisser le modèle N’importe quoi, liste de zone, sur les objets du projet, les projets sans titre, N’importe quoi. Dans le cadre de Project Objects, projet sans titre, la liste de la zone Anything sera désormais présente. Dans la fenêtre principale TrakEM2 sous l’onglet Espace Z, une liste de zone labellisé bar aura été créée.
Cliquez pour sélectionner la liste. Dans la fenêtre principale TrakEM2, sélectionnez l’outil pinceau et cliquez sur Shift tout en roulant la roue de la souris pour sélectionner une taille de pinceau qui est plus petite que le diamètre de la vasculature d’intérêt. Contrôle de presse S pour sauver le projet.
À l’aide de l’outil pinceau, peindre le réseau vasculaire, à l’exclusion de toutes les régions hors foyer. Lorsque l’étiquetage est terminé, cliquez à droite dans la fenêtre principale TrakEM2 et sélectionnez Listes d’exportation et de zone sous forme d’étiquettes. Dans la fenêtre pop-up, sélectionnez Échelle, 100% et exportez toutes les listes de zone.
Fermez les fenêtres TrakEM2 et sélectionnez Oui pour enregistrer le projet. L’image de la liste de zone s’ouvrira et peut apparaître sous forme d’image blanche et noire. Dans le menu principal fidjien, sélectionnez Image, Adjust et Brightness/Contrast.
Dans la fenêtre Luminosité et contraste, cliquez sur Auto et la liste de zone deviendra visible. Dans le menu principal fidjien, sélectionnez Image, Table de rechercher et Table de réveil inversée. Enregistrez cette image d’étiquettes noires sur fond blanc sous forme de fichier t-i-f et fermez l’image.
Ouvrez le fichier Labels aux Fidji et sélectionnez Plugins, Skeleton et Skeleton Eyes. Ensuite, enregistrez l’image Skeleton Eyes sous la forme d’un fichier t-i-f. Pour créer un nouveau projet personnel, sélectionnez Plugins, Macros et Open/Create Project et suivez les invites pour créer ou mettre à jour un fichier de configuration.
À partir du menu du projet Open/Create, accédez au dossier fichier d’entrée de l’annuaire du projet et sélectionnez les fichiers Input Movie et Skeleton. Entrez les valeurs de la vitesse mesurée maximale, de la vitesse maximale cartographiée, de la longueur minimale du segment, de la taille pixel et du taux d’image. Vérifiez la boîte de correction Flicker si les images ont un scintillement périodique de l’intensité de fond et cliquez sur OK. Ajustez les paramètres pour la meilleure visualisation des données.
Définissez la vitesse maximale cartographiée pour inclure environ 95 pour cent des données, de sorte que les données sont cartographiées sur toute la plage de l’échelle de couleur. Pour analyser le squelette, sélectionnez Plugins, Macros et Analyze Skeleton. Le fichier squelette s’ouvrira et le gestionnaire de la Région d’intérêt ouvrira et exécutera.
Dans le gestionnaire de la région d’intérêt, cliquez sur Afficher tous et étiqueter et cliquez sur OK. Pour sélectionner les intervalles de temps, sélectionnez Plugins, Macros et Modifier les intervalles de temps et attendez que la macro génère un kymograph à partir d’un seul segment sur la durée totale du film. Utilisez les touches Control plus et moins pour augmenter la taille du kymograph au besoin et utilisez l’outil de sélection rectangle pour dessiner un rectangle autour de chaque intervalle de temps. Appuyez sur la touche T ou cliquez sur le bouton Ajouter pour enregistrer une sélection intervalle de temps et répéter la sélection pour autant d’intervalles de temps que vous le souhaitez.
Pour évaluer les choix de paramètres, sélectionnez trois à quatre intervalles de temps et terminez l’analyse pour ces intervalles seulement. Cliquez SUR OK lorsque la sélection de l’intervalle de temps est terminée. Une fenêtre contextée s’affiche lorsque les intervalles sélectionnés ont été enregistrés dans le dossier du projet.
Cliquez sur OK. Pour analyser le flux, sélectionnez Plugins, Macros et Analyze Flow. La boîte de dialogue Analyze Flow Parameters s’ouvrira et affichera les valeurs saisies dans l’étape Open/Create Project. Modifiez ces valeurs si nécessaire et cliquez sur OK. La boîte de dialogue Noms de fichier de sortie s’ouvrira et affichera les noms entrés dans l’étape Open/Create Project.
Modifiez ces noms au besoin et cliquez sur OK pour commencer l’analyse de flux. Lorsqu’une boîte de dialogue apparaît indiquant que le flux a été analysé, cliquez sur OK pour stocker les résultats de l’analyse dans les fichiers de feuille de calcul CSV. Pour produire des cartes spatiales, sélectionnez Plugins, Macros et Produire une carte spatiale.
La fenêtre Paramètres de la carte spatiale s’ouvrira en affichant les valeurs saisies dans l’étape Open/Create Project. Modifiez ces valeurs au besoin et cliquez sur OK. Une séquence temporelle des cartes spatiales des vitesses de flux sera générée avec chaque couleur indiquant une vitesse de flux. Faites défiler la pile générée d’une image par intervalle pour visualiser les variations spatiales et temporelles du flux et enregistrer la pile sous forme de fichier a-v-i pour partager le fichier en tant que film.
L’analyse du personnel génère le recensement complet des vitesses microvasculaires dans des champs de microscopes entiers, sur des périodes allant de quelques secondes à quelques minutes. Par exemple, à l’aide d’une seule image dans cette série de temps du réseau microvasculaire dans le foie d’une souris, l’image squelettée générée a été utilisée pour définir l’axe du flux microvasculaire, permettant à l’équipe de cartographie générée des segments vasculaires individuels d’être identifiée pour la quantification ultérieure du débit. À partir des différents segments vasculaires générés par l’image squelettée, des kymographes peuvent être générés représentant l’intensité le long de chaque segment de ligne au fil du temps.
Les intervalles de temps skeleton et user supply peuvent être utilisés pour décomposer le kymographe de chaque segment en intervalles de temps de segment individuels. Le personnel identifie ensuite l’angle prédominant dans le kymograph à partir de chaque intervalle de temps de segment et fournit les mesures calculées de vitesse sous forme de fichiers de données CSV. La sortie CSV du personnel peut être utilisée pour analyser la distribution globale de la vitesse afin de permettre le traçage de la vitesse dans les différents segments vasculaires au fil du temps.
Et peut être visualisé comme des piles d’images de carte de vitesse codées en couleur. Notez que les résultats obtenus par le personnel dépendent de la qualité de la série d’images, en ce qui concerne la stabilité de l’échantillon, la fréquence de l’image, la résolution et le rapport signal-bruit. Les sorties de carte de vitesse du personnel permettent une exploration intuitive du modèle de flux spatial, tandis que les sorties de CSV du personnel permettent l’analyse statistique des vitesses de débit, tant à l’intérieur qu’entre les groupes de traitement.
