This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President&#8217;s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.

1. Préparation des solutions et des aliquotes hydrogel associés <ol><li> Préparation de la solution de précurseur de gel de polyacrylamide. <ol><li> Préparer la solution de précurseur de gel de Polyacrylamide en mélangeant acrylamide (A) (40% p / v, M 71,08 g / mol), le bisacrylamide de réticulation (B) (2% p / v, M 154,17 g / mol), et dé- de l&#39;eau ionisée dans les pourcentages en volume indiquées au tableau 1. REMARQUE: Ces solutions peuvent être préparés en grandes séries et stockées à 4 ° C pendant plusieurs mois. <ol><li> ATTENTION: L&#39;acrylamide est toxique par inhalation ou ingestion, en particulier, lorsqu&#39;il est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 40% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (&lt;23 ° C, une zone bien ventilée). </li><li> ATTENTION: Bis-acrylamide est toxique en cas d&#39;inhalation ou d&#39;ingestion, en particulier,lorsqu&#39;elle est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 2% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (&lt;4 ° C de la zone, bien ventilé). </li></ol></li></ol></li><li> La préparation et l&#39;utilisation de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrophénylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, M 492,40 g / mol) des parties aliquotes. ATTENTION: Sulfo-SANPAH provoque une irritation des yeux; Manipuler avec des gants et des lunettes bon ou de protection du visage. Conserver à -20 ° C dès réception et avant aliquotage. <ol><li> Pour stocker sulfo-SANPAH: dissoudre Sulfo-SANPAH dans dimethylsulfoxane (DMSO) à 50 mg / ml. Aliquoter la solution de stock en 50 micro-tubes de centrifugeuse de 20 pi par tube. Un gel rapide sur la glace sèche ou dans l&#39;azote liquide (une étape facultative mais préférée pour préserver l&#39;efficacité de réticulation maximum) et conserver à -80 ° C. REMARQUE: Les aliquotes can être stockés pendant plusieurs mois. </li><li> Pour utiliser sulfo-SANPAH: décongeler brièvement aliquote et diluer dans 480 pi d&#39;eau désionisée. Utiliser immédiatement. Sulfo-SANPAH hydrolyse rapidement dans l&#39;eau: donc prendre la prudence se acquitter de toutes les étapes ci-dessus rapidement. </li></ol></li><li> Préparation de persulfate d&#39;ammonium (M r 228,18 g / mol) des parties aliquotes. REMARQUE: persulfate d&#39;ammonium provoque yeux, la peau et les voies respiratoires. Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation. Manipulez la poudre de persulfate d&#39;ammonium dans une hotte chimique. Conserver la poudre dans un endroit sec, bien ventilé. Une fois aliquotes, la solution diluée peut être utilisé sur la table de travail. <ol><li> Dissoudre le persulfate d&#39;ammonium dans de l&#39;eau désionisée pour obtenir une concentration finale de persulfate d&#39;ammonium à 10% p / v. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Décongeler immédiatement avant l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Préparation de la solution de collagène de type I. <ol><li> Préparer 0,2 mg / ml solution collagène par dilution de la sorte1x lution dans du tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4. Stocker brièvement de glace ou utiliser immédiatement après dilution. </li></ol></li></ol> 2. Préparation d&#39;hydrogel (Voir Figure 1) <ol><li> Préparation des lames de verre hydrophobes. <ol><li> Placez quelques gouttes d&#39;une solution hydrophobe sur une plaque de verre et d&#39;utiliser du papier de soie se propager à travers la surface. Laissez sécher à l&#39;air et essuyer de nouveau avec un mouchoir en papier pour égaliser le revêtement hydrophobe. REMARQUE: solution hydrophobe magasin dans une armoire inflammable à RT. Porter un équipement de protection individuelle lors de la manipulation. Travailler dans un endroit bien ventilé. </li></ol></li><li> Préparation du support en matière plastique souple. <ol><li> Couper le support plastique flexible pour correspondre à la taille de la plaque de verre à revêtement hydrophobe. </li><li> Marquer le côté hydrophobe du support plastique flexible en grattant légèrement la surface avec un outil pointu comme un scalpel. NOTE: Une fois que le gel - qui est totalement transparent - sèche, Les rayures seront aider à distinguer de quel côté de support souple en plastique contient du gel. REMARQUE: Le support plastique flexible a une hydrophobe et un côté hydrophile. Une fois déposé, le polyacrylamide adhère de façon permanente sur le côté hydrophile du support plastique qui facilite la manipulation d&#39;hydrogel ultérieure facile. </li></ol></li><li> Préparation de gel (par exemple les volumes sont donnés pour des solutions de précurseur de gel de 5 ml). NOTE: 5 ml seraient suffisants pour produire ~ 40 gels lorsque le gel épaisseur initiale est de 0,5 mm. Plus gels peuvent être produits si l&#39;épaisseur du gel est réduite. <ol><li> Passer 4972,5 ul de solution de précurseur de polyacrylamide concentration finale désirée (tableau 1) dans un tube conique de 50 ml. Placez dans une chambre de dégazage pendant 30 min avec le couvercle ouvert. NOTE: L&#39;oxygène agit comme un piège à radicaux libres et lorsqu&#39;il est présent, il inhibe la polymérisation. </li><li> Ajouter 25 ul de 10% en poids / volume de persulfate d&#39;ammonium (voir point 1.3) pour obtenir un finaleconcentration en persulfate d&#39;ammonium à 0,05%. </li><li> Ajouter 2,5 pi de N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, M 116,24 g / mol) à la solution dégazée de gel pour obtenir une concentration finale de TEMED 0,5%. NOTE: Magasin TEMED dans une armoire inflammable à RT. Manipuler dans une hotte chimique lorsque vous portez un équipement de protection individuelle approprié. Gardez bien fermé sous gaz inerte, car il est très sensible à l&#39;humidité et de l&#39;air. </li><li> Mélanger doucement la solution par pipetage de haut en bas 3-5 fois. Ne vortex pour éviter la diffusion d&#39;oxygène dans la solution de précurseur de gel. </li><li> Pipeter la solution de gélatine sur le côté hydrophile du support en matière plastique souple et un sandwich avec lame de verre hydrophobe revêtu. Séparer les deux glissières par des entretoises de silicone d&#39;une épaisseur désirée (par exemple, 0,5 mm). Laisser une petite quantité (~ 100 pi) d&#39;une solution de précurseur de polymère dans le tube conique de 50 ml d&#39;utiliser comme indicateur de gélification. REMARQUE:Tout écartement pourrait être utilisé. Par exemple, une seule bande de Parafilm donne une épaisseur de gel gonflé finale de 100 - 120 um. </li><li> Placez une autre plaque de verre au sommet du sandwich en plastique souple support / gel pour assurer une surface plane hydrogel lors de la polymérisation. </li><li> Laisser polymériser le gel pendant 45 minutes, bien que moins de temps peut être utilisé pour des gels supérieur% en poids, si désiré. Pour se assurer que le gel a polymérisé, observer la solution restante dans le tube conique de 50 ml; si la solution restante a gélifié, alors il est probable que la gélification de la plaque de verre a été initié ainsi. Toutefois, notez que l&#39;ouverture prématurée de la moule empêcher la polymérisation complète. </li><li> Une fois que le gel est formé, décoller le support de plastique souple avec le gel de polyacrylamide attaché de manière covalente sur le dessus, et mettre gel côté-up sécher à l&#39;air. REMARQUE: convection ou séchage à la chaleur peuvent aussi être utilisés pour accélérer cette étape. Une fois séché sur le support en matière plastique souple, le gel peut être magasinD indéfiniment. <ol><li> Marquer des taches nues du support de plastique souple, où les gels de polyacrylamide ne font pas en raison de bulles. Mark tandis que le gel est encore hydratée car cela se fondre dans le support de plastique souple une fois que le gel est sec. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Assemblée Multiwell Plate, Collagène revêtement, et stérilisation <ol><li> Assemblage de plaque à puits multiples. <ol><li> Une fois séché, coupé gels PA dans des formes souhaitées. <ol><li> Pour une plaque de 96 puits, utilisez une perforatrice lourd de devoir avec un diamètre de ~ 6 mm. Utilisez un coupe-papier robuste pour couper gels dans des formes carrées ou rectangulaires. Sinon, utilisez des ciseaux. </li></ol></li><li> Préparer environ 500 ul de PDMS par plaque à 96 puits selon les instructions du fabricant. Pour coller les gels au fond d&#39;une plaque à puits multiples, placer une petite goutte (~ 5 pi) de polydiméthylsiloxane (PDMS) au centre de chaque puits. En utilisant des pinces, placer une polyacrylamidegel de e de chaque côté ainsi, flexible support en plastique vers le bas. Pour permettre PDMS pour guérir, laissez la plaque assemblée à 37 ° C pendant un minimum de 4 heures. </li></ol></li><li> Collagène revêtement de gels de Polyacrylamide. <ol><li> Avec une pipette de transfert, placer une petite quantité (7-8 pi) de sulfo-SANPAH (se reporter au point 1.2.2) dans chaque puits et agiter de droite à gauche pour enrober la surface du gel uniformément. Travaillez rapidement depuis sulfo-SANPAH ne est pas stable dans l&#39;eau. </li><li> Placer la plaque de puits sous une lampe UV à haute intensité (intensité = 37 mW, λ = 302 à 365 nm) pendant 5 min. Rincer les gels avec du PBS pour éliminer sulfo-SANPAH excès. </li><li> Pipette 50 ul de 0,2 mg / ml de collagène de type I solution (voir point 1.4) dans chaque puits. Laissez la plaque couverte à température ambiante pendant au moins 2 heures ou O / N à 4 ° C. NOTE: Pour accélérer le processus de revêtement de collagène, une pipette de transfert peut être utilisé pour ajouter la solution de collagène. Typiquement, 1-2 gouttes de solution devrait être suffisant pour terminerly couvrent la surface du gel. </li><li> Laissez la plaque de puits à température ambiante pendant au moins 2 heures pour permettre la liaison de collagène. </li><li> Rincer avec du PBS pour éliminer l&#39;excès de solution de collagène et stériliser sous UV (λ = 200 nm) dans une hotte de culture tissulaire pendant 2 h. </li><li> Faire tremper les gels dans un milieu complet (voir la section 4.1 pour la composition du milieu) O / N pour hydrater et équilibrer. Utilisez pour la cellule ensemencement immédiatement ou conserver au réfrigérateur jusqu&#39;à 2 jours. </li></ol></li></ol> 4. cellulaire semis sur PA Rigidité Assay REMARQUE: Bien que typique de lignées cellulaires de mammifères communes, le protocole décrit dans cette section est utilisé spécifiquement avec le cancer du sein lignée cellulaire MDA-MB-231 (voir figures 4 et 5). <ol><li> Recueillir les cellules de flacon de culture de tissu par exposition à 5% de trypsine / EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Utilisez ~ 80 pi de trypsine / EDTA pour chaque cm 2 de la culture zone de ballon; par exemple, utiliser 2 ml de trypsine / EDTA fora T25 du ballon de culture de cellules. Remettre en suspension les cellules récoltées dans du milieu complet supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à une concentration finale souhaitée de la cellule. En tenant compte de temps de doublement cellulaire ainsi que la durée pendant laquelle les cellules sont ensemencées sur l&#39;analyse, choisir une concentration cellulaire appropriée sous-confluentes. Assurez-vous que moyen supplémentaire est suffisant pour submerger complètement les hydrogels. NOTE: Depuis les hydrogels ont été pré-équilibrée dans les médias (voir l&#39;étape 3.2.6) un volume de 100 pi devrait être suffisant. Des volumes de taille typiques utilisés pour les plaques multi-puits devraient être suffisants puisque les gels ont été pré-équilibrée dans du support dans l&#39;étape précédente. NOTE: Le test serait approprié pour tout type de fixation des cellules dépendant. <ol><li> Compter le nombre de cellules sous un microscope inversé en utilisant un hémacytomètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire dans chaque port de hémacytomètre et la moyenne du nombre de cellules à partir d&#39;au moins huit quadrants. Pour obtenir leconcentration cellulaire finale, il faut multiplier le nombre de cellules par 10 quatre. REMARQUE: Les meilleurs résultats de comptage cellulaire sont obtenus lorsque le nombre de cellules dans chaque quadrant de hématimètre est 20-50. </li></ol></li><li> Culture des cellules sur le test de rigidité PA dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer de support tous les 2 à 3 jours. Recueillir les cellules en cas de besoin par une exposition à 5% de trypsine / EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Utilisation ~ 80 pi de trypsine / EDTA par cm2 de flacon de culture tissulaire. Au cours de toutes les étapes de manipulation cellulaire, prenez soin de ne pas perturber la surface d&#39;hydrogel: aspirer ou moyen de pipette en inclinant légèrement la plaque à puits multiples sur le côté et de toucher la pointe de la pipette sur la paroi latérale de chaque puits, par opposition à toucher l&#39;hydrogel. REMARQUE: Sauf pour prendre soin de ne pas endommager la surface d&#39;hydrogel lors de la manipulation de culture tissulaire standard, les cellules ensemencées sur le test de rigidité peut être manipulé de la même manière que si elles ont été ensemencées surd&#39;une plaque multipuits régulière. </li></ol> 5. imagerie des cellules ensemencées sur PA Rigidité Assay <ol><li> cellules image directement sur le test de rigidité PA. NOTE: Toute microscope - inversé, fluorescent ou confocale, peut être utilisé pour l&#39;imagerie cellulaire. REMARQUE: Le support en matière plastique souple utilisée pour construire le test de rigidité est entièrement transparent et ne pas interférer avec ou autofluorescence imagerie cellulaire. Cependant, même si le support en matière plastique souple lui-même est transparente, des capacités d&#39;imagerie seront limités par la distance de travail de l&#39;objectif. Le support en matière plastique souple a une épaisseur de 0,23 mm et une distance de travail typique d&#39;un objectif 10X est ~ 4 mm, diminuant fortement pour des grossissements plus élevés. <ol><li> Pour l&#39;imagerie des cellules vivantes, la position PA rigidité test in support de plaque de microscope et l&#39;image. Les séances d&#39;imagerie sous 2 heures, ou utiliser un microscope équipé d&#39;une chambre environnementale des durées d&#39;imagerie. </li><li> Lorsque im de cellules vivantesvieillissement ne est pas l&#39;objectif, fixer les cellules dans une solution de formaldéhyde 4% complété avec 0,1% de détergent. Faire tremper les cellules dans un fixateur à température ambiante pendant un minimum de 2 heures. Rincer deux fois avec PBS. Jeter les déchets fixateur dans un conteneur de déchets désignés. NOTE: Les cellules peuvent être visualisés immédiatement ou stockée immergés dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux semaines. ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique par inhalation et par contact. Manipuler avec des gants dans une hotte chimique. REMARQUE: Cellulaire protocole de fixation doit être choisi sur la base des protocoles de coloration de la cellule et la manipulation ultérieure, parce que certains fixateurs endommagent certaines protéines cellulaires. </li><li> Pour l&#39;imagerie de fluorescence, colorer les cellules avec tache de cellule souhaitée directement dans la plaque multi-puits fixée. Image immédiatement. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+force+microscopy+on+elastic+layers+of+finite+thickness.">Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness.</a> Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Les gels de polyacrylamide, initialement mis au point pour l&#39;électrophorèse, 28 sont maintenant couramment utilisés comme substrats de culture cellulaire pour étudier les effets de la rigidité du substrat sur ​​la morphologie cellulaire, la motilité et la communication 3,24,29 parmi d&#39;autres caractéristiques de cellules. Polyacrylamide permet la manipulation de la rigidité du substrat pour englober la rigidité de l&#39;ensemble des tissus mous dans le corps (0,3 à 300 kPa) ave...

La plupart des tissus dans le corps sont des matériaux visco-élastiques souples avec un module d&#39;Young allant de 0,1 kPa pour le cerveau de 100 kPa pour cartilage souple, encore, la plupart de la recherche sur les cellules in vitro est réalisée sur du polystyrène pour culture de tissus (TCP) qui a un module d&#39;environ 1 GPa . 1 Ce décalage de rigidité affecte grandement la façon dont les cellules répondent à leur environnement. Un nombre croissant d&#39;études est ainsi dédiée à élucider l&#39;effet de la rigidité du substrat sur ​​le sort de divers types de cellules, le 2,3 y compris des cellules souches. 4 En conséquence, plusieurs hydrogels ont été développés pour aider à la compréhension de la cellule de rigidité dépendante biologie, y compris polyacrylamide (PA), 5-7 polyéthylène glycol (PEG), 8,9 (PDMS), 10 et 11 alginate. Bien que la preuve que la rigidité du substrat a un impact considérable sur le sort de la cellule est de plus en plus, la plupart des études sont menées sur une petite échelle avec un petit nombre de sexemples. Systématiques, études multidimensionnelles sur l&#39;effet de la rigidité de substrat pour un éventail de types de cellules ou les conditions environnementales sont rares. 12 Plusieurs technologies d&#39;hydrogel à haut débit prometteuses ont été développées, y compris les microréseaux à base de PEG, 13 des dispositifs microfluidiques pour la production de microbilles d&#39;agarose d&#39;hydrogel, 14 ou des micro et nano-tiges où la rigidité est modulée par le diamètre et la hauteur des microrods. 15 Cependant , les technologies de préparer ces substrats sont sophistiqués et disponibles pour nombre limité de laboratoires. Beaucoup de recherches impliquant rigidité modulée réponses cellulaires utilise polyacrylamide (AP) gels qui ne sont pas seulement bon marché et simple à mettre en œuvre, mais présentent également une gamme physiologiquement pertinente de module de Young, à savoir 0,3 -. 300 kPa 16-22 Cependant, les méthodes existantes pour fabriquer PA gels pour la culture cellulaire sont de main-d&#39;œuvre et par conséquent prepARED en petits lots. Certaines des difficultés liées à la préparation de gels PA comme substrats de cellules souches de l&#39;exigence que les gels doivent être préparé: 1) en l&#39;absence d&#39;oxygène pour permettre la polymérisation complète, 2) avec une surface plane et lisse pour permettre cellulaire uniforme l&#39;attachement et la propagation, et 3) fixée en permanence au fond de la boîte de culture cellulaire pour empêcher flottante. Plusieurs groupes ont tenté de produire des gels PA pour la culture cellulaire en grandes séries. Semler et al. Les feuilles épaisses préparées de gels PA qui ont ensuite été &quot;coupée&quot; avec une perforatrice et placés dans des plaques à 96 puits. 23 Cependant, cette méthode est limitée à des gels sévères, ce est à dire,&gt; 1 kPa dans le module de Young, parce que plus doux gels sont &quot;collante&quot;, difficile à couper, et facilement endommagé. Mih et al. A développé une technique plus sophistiquée qui permet aux gels d&#39;être directement polymérisés dans une plaque à puits multiples à fond de verre. <sjusqu&#39;à&gt; 6 Ceci a été réalisé en versant les solutions de gel dans des plaques à fond de verre fonctionnalisés et former des gels par «sandwich» avec une gamme de lamelle personnalisé. 6 même si de légers effets très prometteurs, bord étaient encore observés avec cette technique. De plus, la technique nécessite un réseau conçu sur mesure pas immédiatement accessible à de nombreux laboratoires ainsi que des plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses. Cet article décrit un moyen simple et peu coûteux à assembler gels PA dans une plaque multi-puits qui pourrait être facilement adoptée par ne importe quel laboratoire. Ici, un support plastique flexible est utilisé, qui a deux côtés - un une hydrophobe, qui est répulsif pour gels PA, et un une hydrophile, qui se lie de manière covalente le gel PA lors du dépôt. Une fois les feuilles de gel PA sont déposés et permanente apposée sur le support plastique flexible, il permet une manipulation des gels de toute épaisseur ou la rigidité et les couper en toute forme souhaitée. Cette apprOach produit non seulement personnalisés &quot;lamelles&quot; en plastique de tailles pas autrement disponibles dans le commerce, mais évite également la nécessité de surfaces de verre-prétraiter, soit des lamelles de verre ou les puits de plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses, avec une solution de liaison PA, qui est un fastidieux et une étape de temps. Enfin, feuilles de gels uniformes PA peuvent être préparés en grandes séries et stockés de-hydraté pendant plusieurs mois. En résumé, l&#39;analyse présentée ici est une amélioration par rapport aux méthodes existantes dans plusieurs aspects. Premièrement, le processus de montage de la plaque à puits multiples est efficace, et le coût total des matériaux requis est faible. Deuxièmement, les hydrogels sont produites en grandes quantités dans un film de gel homogène unique. Enfin, seuls des matériaux qui sont disponibles dans le commerce sont tenus. L&#39;utilité de l&#39;essai est illustré par la découverte de l&#39;effet de la rigidité du substrat sur la morphologie cellulaire et la zone d&#39;étalement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Reagents</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">40% Acrylamide</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:187px;">161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">2% Bis-acrylamide</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:187px;">161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:187px;">161-07000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">Sulfo-SANPAH</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL</td>
			<td style="width:200px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:187px;">BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">Hydrophobic solution - Repel Silane&#160;</td>
			<td style="width:200px;">GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td style="width:187px;">17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:303px;">PBS (1x), pH 7.4</td>
			<td style="width:200px;">HyClone</td>
			<td style="width:187px;">SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:303px;">Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:200px;">Elsworth Adhesives</td>
			<td style="width:187px;">3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tyrpsin/EDTA (10x)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">44174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">RPMI-1640 Medium (1x)</td>
			<td style="width:200px;">HyClone</td>
			<td style="width:187px;">SH30027-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">HyClone</td>
			<td style="width:187px;">SH30073-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:187px;">1670046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Detergent - Triton-X</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:187px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">BSA-based cell adhesion blocking kit - ECM Cell Adhesion Array Kit</td>
			<td style="width:200px;">Chemicon International</td>
			<td style="width:187px;">ECM540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Disposable lab equipment</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">flexible plastic support - GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels</td>
			<td style="width:200px;">GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td style="width:187px;">309819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Glass Plates</td>
			<td style="width:200px;">Slumpys</td>
			<td style="width:187px;">GBS4100SFSL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">50 mL Conicals</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scinetific</td>
			<td style="width:187px;">3181345107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">15 mL Conicals</td>
			<td style="width:200px;">FALCON</td>
			<td style="width:187px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scinetific</td>
			<td style="width:187px;">2 mL: 02681258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">96-well plate (flat bottom)</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scinetific</td>
			<td style="width:187px;">12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:303px;">Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL)</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scinetific</td>
			<td style="width:187px;">1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Glass Transfer Pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scinetific</td>
			<td style="width:187px;">5 3/4&#34;: 1367820A, 9&#34;:136786B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL)</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scinetific</td>
			<td style="width:187px;">2707509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">13-711-9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">PARAFILM&#160;</td>
			<td style="width:187px;">PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:200px;">Quest</td>
			<td style="width:187px;">92897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td style="width:200px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:187px;">JTR-S-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;">3820005619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microscope Software</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;">AxioVision Rel. 4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">UV oven</td>
			<td style="width:200px;">UVITRON</td>
			<td style="width:187px;">UV1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vacuum chamber/degasser</td>
			<td style="width:200px;">BelArt</td>
			<td style="width:187px;">999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Vacuum pump for degasser</td>
			<td style="width:200px;">KNF Lab</td>
			<td style="width:187px;">5097482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tissue Culture Hood</td>
			<td style="width:200px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:187px;">NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Chemical Fume Hood</td>
			<td style="width:200px;">KEWAUNEE</td>
			<td style="width:187px;">99151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Inverted Microscope (Axiovert 25)</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;">663526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Incubator</td>
			<td style="width:200px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:187px;">NU-8500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Pipette Aid</td>
			<td style="width:200px;">Drummond Scientific Co.</td>
			<td style="width:187px;">P-76864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:200px;">Bright-Line</td>
			<td style="width:187px;">383684</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Polyacrylamide (AP) hydrogels sont largement utilisés pour tester les réponses cellulaires rigidité dépendante. 17,24 En mélangeant différentes concentrations d&#39;acrylamide (A) et bis-acrylamide (B) on peut faire gels PA qui couvrent la gamme de rigidité de la plupart des tissus mous le corps - 0,3 -.. 300 le module de kPa Jeune 1 Cependant, la préparation de gels de polyacrylamide est long et fastidieux, ce qui limite souvent leur utilité dans des applications «à haut débit» comme ...

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Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.4K vues.  Saint Louis University. Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Vidéo: Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imagerie par bioluminescence pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Une méthode de fabrication simple et évolutive pour les dispositifs électroniques organiques sur les textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...