Name: Vidéo: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00
Duration: 10 min
Description: 15.3K vues. University of California Davis. Nous démontrons la fabrication d'une scène à faible coût cryogénique conçu pour s'adapter à la plupart des microscopes optiques réfléchie. Cette étape de laboratoire construit cryogénique permet efficace et fiable d'imagerie corrélative entre la Cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

Les auteurs tiennent à remercier le juge Brandon Zipp et Ken B. Kaplan pour l&#39;accès à la souche de levure utilisée dans cette étude. Les auteurs remercient également Julio Dominguez Lénine-Ramirez à l&#39;aide d&#39;enregistrements vidéo. JEE reconnaît le soutien financier du NIH numéro de subvention 5RC1GM91755.

1. Fabrication et montage <ol><li> Placez le dissipateur thermique en aluminium à l&#39;intérieur du 22,96 cm (9 &quot;) moule à tarte d&#39;environ 2 cm du côté de la poêle, comme le montre la figure 1c aide d&#39;un marqueur noir, marque pour les trous de dissipateur thermique en aluminium Remarque:.. Si l&#39;aluminium bloc (acheté dans un magasin de ferrailles locales ou en ligne à <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) ne vient pas avec trous pré-percés, vous aurez besoin de prendre des dispositions pour avoir des trous percés et fraisés avant l&#39;étape 1 pour obtenir de l&#39;aluminium bloc à l&#39;assiette à tarte. Nous avons utilisé 5 trous pour fixer le bloc à la plate-forme et 4 trous supplémentaires pour permettre aux bulles de gaz azote pour sortir du sous de l&#39;aluminium. </li><li> Placez la boîte cryo-réseau à proximité de l&#39;emplacement du puits de chaleur en aluminium et de marquer l&#39;encoche et de chaque côté. </li><li> Percez des trous pour chaque position marquée en utilisant un bit # 17 trous de forage pour le radiateur en aluminium et un peu # 35 trous de forage pour le boîtier cryo-grille. </li><li> Montez le dissipateur thermique en aluminium avec 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 &quot;) à tête plate fendue boulons et écrous correspondants, ainsi que 15 - # 10 rondelles Placer deux rondelles en dessous du bloc en aluminium et le troisième à l&#39;arrière de l&#39;. moule à tarte pour chaque billet de trou:. surplombs non garantis du bloc en aluminium à proximité de la zone de visualisation peut entraîner des vibrations qui limitent les capacités d&#39;imagerie de la scène Assurez-vous que tous les boulons de fixation sont bien serrées.. </li><li> Insérer 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 &quot;) autour des boulons et des écrous à fente correspondante de l&#39;arrière du moule à tarte d&#39;agir comme la boîte de cryo-grille de montage. </li><li> Tape 4 baguettes en binôme avec un autre sommet baguettes. Ruban à chaque paire de bords opposés du moule à gâteau à agir comme des entretoises. </li><li> Mouiller la surface supérieure et inférieure du gâteau et la tarte aux casseroles respectivement avec ddH 2 O. </li><li> Remplir le moule à cake avec deux couches de mousse isolante pulvérisée. Mouillant chaque couche avant d&#39;aller à l&#39;étape suivante. </li><li> Appuyez sur le moule à tarte dans la mousse. </li><li> Retourner les casseroles à l&#39;envers et appuyez sur le moule à gâteau jusqu&#39;à ce que le entretoises contacter le moule à tarte. Placez tous les objets pondérés au sommet de la moule à cake et laissez reposer toute la nuit pour guérir. </li><li> Avec un couteau dentelé, couper l&#39;excès de pulvérisation de mousse isolante secs à partir du bord de la casseroles et enlever les baguettes. </li><li> Retirez le moule à gâteau de la moule à tarte. Le moule à tarte avec dissipateur thermique en aluminium est maintenant isolé et sera appelé le &quot;étage cryotechnique» (figure 1a). </li><li> Placez une planchette à pince en plastique transparent (n&#39;importe quelle couleur et plus de 3 mm d&#39;épaisseur) sur le dessus de l&#39;étage cryotechnique. Marquer avec un marqueur noir l&#39;emplacement de la boîte de montage cryo-grille en dessinant un cercle d&#39;environ 1,5 fois le diamètre d&#39;un seul tour cryo-grille de la boîte. Découpez le trou avec un 1,9 cm (3 / 4 &quot;) le trou vu. Ce presse-papier sera appelé le&quot; écran de chargement &quot;(Fig 1b). </li><li> Mettre un nouveau presse-papiers transparents au-dessus de l&#39;étage cryogénique et le placer sur le microscope avec le dissipateur de chaleur directement sous lentilles de l&#39;objectif. Avec un marqueur noir, marque le chemin des objectifs de leur rotation. </li><li> Coupez le long de la ligne marquée suppression d&#39;un demi-cercle du bord de la planchette. Ceci peut être accompli avec une scie sauteuse ou en utilisant un 7,62 cm (3 &quot;) le trou a vu plusieurs fois, comme indiqué dans la vidéo. </li><li> Enfin couper un trou de 1,9 cm (3 / 4 &quot;) de demi-cercle, mais toujours dans la zone de l&#39;antenne. Ce sera le port pour le remplissage d&#39;azote liquide (LN2), si baisse des niveaux tout en imagerie. Ce presse-papier sera renvoyé le &quot;affichage à l&#39;écran» (figure 1c). </li></ol> 2. Préparation des échantillons <ol><li> Diluer la levure cellules phase log cultivé dans de synthèse complet (SC) des médias à une concentration appropriée de 1x10 6 cellules / mL dans l&#39;eau. </li><li> 2 ml de la levure diluée sont pipette sur une R2 / 1 400 mailles holey carbone revêtu de cuivre cryo-EM grille (fournitures SPI, West Chester, PA) et a permis à adsorber pendant 15 secondes. </li><li> Blot loin l&#39;excès de liquide de la surface de la grille en touchant l&#39;arrière de la grille pour un morceau de tissu déchiré de cellulose souple (Kimwipe) pendant 2 secondes. </li><li> Si nécessaire, la grille peut être lavée avec 3 gouttes uL d&#39;eau (1-3 fois), et les méchants de suite que dans l&#39;étape 3 en tamponnant à l&#39;arrière. </li><li> Avant le lavage final, l&#39;échantillon est chargé dans le congélateur plonger pneumatiques et la grille de la pendaison est lavé comme à l&#39;étape 2.4. Après transfert de la grille avec un papier tissu déchiré (Kimwipe) pour enlever la majorité de l&#39;eau de la surface, la grille est plongé dans ln 2 éthane liquide refroidi et transféré à une boîte de cryo-grille pour le stockage Remarque 1:. Il est important de laisser une couche de liquide aussi mince que possible sur la surface à conserver l&#39;échantillon hydraté. Une mauvaise buvard sera soit sécher l&#39;échantillon ou de quitter la glace qui est opaque au faisceau d&#39;électrons. </li></ol> 3. Cryo-microscopie lumineuse <ol><li> Remplir le stade cryogéniquesLN 2 et de couvrir rapidement avec l&#39;écran de chargement (clipboard en plastique avec une seule 1,9 cm (3 / 4 &quot;) le trou). </li><li> Une fois que le métal atteigne la température de ln 2, le transfert de la boîte cryo-réseau à travers les 1,9 cm (3 / 4 &quot;) le trou de l&#39;écran de chargement et de transfert dans le montage créé par les 3 vis décrite dans la partie A5. Dévissez la boîte cryo-grille de son support et retirez le support pour améliorer l&#39;accès. Maintenez le porte-case cryo-grille sous LN 2 dans un dewar séparés jusqu&#39;à l&#39;étape 3.10. La boîte de cryo-réseau devraient également être maintenus sous LN 2 pour empêcher le réchauffement de grille d&#39;échantillonnage. </li><li> . Recharge LN 2 de l&#39;étage cryotechnique juste en dessous du haut de l&#39;évier de chaleur en aluminium Remarque: ln 2 niveaux doivent être vérifiés périodiquement et rempli pendant le processus d&#39;imagerie afin d&#39;assurer ln 2 est continuellement en contact avec le dissipateur thermique. En général, la recharge se produit toutes les 10 minutes via le port de remplir l&#39;écran de visualisation. </li><li> Pré-refroidir la pointe pince en ln 2, puis le transfert de votre grille (s) sur la surface plate de la visualisation dissipateur thermique en aluminium avec des pincettes, en utilisant le 1,9 cm (3 / 4 &quot;) le trou de l&#39;écran de chargement. </li><li> Soigneusement déplacer la cryo-dessous de scène pour les ouvertures objectif du microscope de lumière réfléchie. </li><li> Placez l&#39;écran d&#39;affichage transparents au-dessus de l&#39;écran de chargement. Puis retirez lentement l&#39;écran de chargement en le faisant glisser sous l&#39;écran Remarque visualisation:. A ce stade, l&#39;échantillon est le plus vulnérable. Tous les courants d&#39;air autour du microscope doit être minimisée, notamment: la respiration, une ouverture de porte à proximité, les gens marchant passé, etc Nous vous suggérons de porter un masque ou d&#39;accrocher un écran facial transparent ci-dessous les oculaires du microscope comme une mesure de précaution. </li><li> Tournez lentilles de l&#39;objectif dans l&#39;environnement de gaz d&#39;azote froid de la cryo-scène et de balayage de l&#39;échantillon sur la zone de visualisation dissipateur thermique plat. Utilisation de la norme lumière des techniques de microscopie en champ se concentrer sur la grille avec un objectif de faible grossissement pour trouver le centre et prendre une image d&#39;aperçu. Spécifications concernant les lentilles de microscope optique utilisé pour cette expérience sont répertoriés dans la section expérimentale des matériaux. Remarque: ln 2 n&#39;entre pas en contact avec les lentilles de l&#39;objectif et nous avons encore à voir la dégradation des images ou des dommages aux lentilles des effets du refroidissement . </li><li> Focus dans grossissement élevé sur une zone d&#39;intérêt et d&#39;acquérir des données avec un champ clair, fond noir, la lumière polarisée ou l&#39;imagerie de fluorescence. Soyez sûr d&#39;enregistrer l&#39;emplacement de la zone d&#39;intérêt sur l&#39;image de terrain faible grossissement brillante pour la corrélation future. Si toutes les précautions énumérées ci-dessus pour le remplissage de la LN 2 sont suivis, la pression positive de l&#39;azote s&#39;évapore est suffisante pour maintenir un environnement sans contamination (indépendante de l&#39;humidité ambiante) pour la durée de l&#39;imagerie. </li><li> Une fois terminé, remplacez l&#39;écran de chargement en le faisant glisser sur le haut de l&#39;écran de visualisation. Enlever l&#39;écran d&#39;affichage en ralentissant le faisant glisser sous l&#39;écran de chargement. </li><li> Retirez le stade de la cryo microscope et avec pré-refroidissement des pincettes, le transfert de la grille de revenir à la boîte de cryo-grille. Visser le support boîte de cryo-grille dans la grille de cryo-case pour sceller contre l&#39;environnement et le transfert à son détenteur d&#39;un dewar LN2 pour le stockage et l&#39;imagerie avenir. </li></ol> 4. Cryo-microscopie électronique <ol><li> Suite à des techniques standard et établie, la charge de la grille de l&#39;échantillon dans un support de transfert de cryo-EM tout en gardant l&#39;échantillon à température de l&#39;azote liquide à tout moment. </li><li> Insérez la cryo-porte avec grille échantillon dans un microscope électronique à transmission. </li><li> Dans une vue en faible grossissement adaptés (50-500x de grossissement nominal), trouver le centre de la grille d&#39;échantillonnage. </li><li> Utilisez le faible grossissement précédemment recueillies cryo-LM données de l&#39;étape 3.7 pour déterminer l&#39;orientation relative des onglets de la grille en cuivre central (comme décrit dans la figure 2) et d&#39;identifier les domaines précis d&#39;intérêt pour la corrélation. </li><li> Procéder à l&#39;alignement de microscope, à faible dose cryo-EM imagerie et de collecte de données. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs L&#39;étage cryogénique (figure 1a) est un moyen efficace de rassembler des cryo-LM de données pour la cryo-microscopie par fluorescence et analyse cryo-LM/cryo-EM corrélative. La figure 2 montre comment la combinaison de bas et haut de grossissement cryo-LM images vous permet de construire des cartes de référence qui vous dirigent vers des zones spécifiques en cryo-EM. La résultante de cryo-LM carte de référence (figure 2b) a été utilisé lors de la cryo-EM acquisition de données pour localiser des régions exacte de la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Étage cryogénique. A) L&#39;aménagement de l&#39;étage cryotechnique est constitué d&#39;un transfert de zone de cryo-grille de montage indiqué wvec une flèche blanche et d&#39;un dissipateur thermique en aluminium. Les grilles sont transférés en vertu de ln 2 de la boîte de cryo-grille et placé directement sur ​​la zone de visualisation du dissipateur de chaleur, comme indiqué par la flèche noire. B) Image illustrant l&#39;étage cryotechnique avec écran de chargement. Le trou dans l&#39;écran de chargement est placé directement sur ​​la boîte cryo-grille de monter et agit comme un port de transférer des échantillons et des échantillons pour le déplacement de la boîte de cryo-grille à la surface de l&#39;échantillon visualisation sur le dissipateur de chaleur avec des pincettes. C) Le cryogénique étape dans la position sous les lentilles d&#39;objectif avec l&#39;affichage à l&#39;écran en place. La découpe spéciale sur l&#39;écran d&#39;affichage permet de lentilles de l&#39;objectif de facilement swing dans la position sans bouger l&#39;étage cryotechnique. Le trou dans l&#39;écran de visualisation loin de la zone de l&#39;échantillon agit comme un ln 2 orifice de remplissage pour reconstituer ln 2 niveaux si nécessaire. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Navigation dans la cryo-LM pour les études corrélatives. A) à faible grossissement cryo-LM vue des cellules de levure adhère à une grille d&#39;échantillonnage. B) La même image dans (a) recouverte d&#39;une image à fort grossissement de fluorescence d&#39;une zone d&#39;intérêt et avec un polygone rempli d&#39;orange marquant le centre de la grille d&#39;échantillonnage. Le centre se compose d&#39;un groupe de quatre carrés, trois ayant une languette métallique supplémentaire et le quatrième ouvert. Pour les trois places avec une languette métallique supplémentaire, deux paires part l&#39;onglet sur les axes longs et courts formant un centre asymétrique. Ce centre asymétrique peut être vu dans le coin supérieur gauche et a été utilisé pour indiquer l&#39;angle de rotation et d&#39;impartialité de la grille entre les cryo-LM et cryo-EM. D&#39;un faible grossissement de nombreuses zones de l&#39;image d&#39;intérêt peut être marqué et utilisé comme une carte de référence pour localiser les zones identiques en cryo-EM. C) Un magnifié par fluorescence cryo-LM image de la zone d&#39;intérêt en (b). HTA1-PCP, un marqueur de la PCP C-terminale des histones, peut être vu comme une structure verte ponctuée d&#39;étiquetage de l&#39;emplacement du noyau. D) Une image cryo-EM de la zone correspondante (c). Barres d&#39;échelle représentent 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Corrélation des cryo-LM et cryo-EM. Deux champs de vue montrant des cellules de levure identiques en corrélation avec la cryo-fond clair (A, D), la cryo-fluorescence (B, E), et cryo-EM (C, F Barres d&#39;échelle). représentent 5 microns.

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	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Les auteurs déclarent pas des intérêts concurrents financiers.

<p class="jove_content"&gt; Grâce à notre étage cryogénique et les techniques de préparation des échantillons, des études de corrélation entre la Cryo-LM et cryo-EM présentent plusieurs avantages sur la température ambiante approches traditionnelles, y compris, mais sans s&#39;y limiter: fixation rapide<sup&gt; 1,2</sup&gt;, A réduit photoblanchiment<sup&gt; 3</sup&gt;, Et la numérisation de l&#39;intégrité de l&#39;échantillon avant de cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; Ou chimique Fixation / embedding<sup&gt; 6</sup&gt;. L&#39;un des goulots d&#39;étranglement pour la cryo-EM de collecte de données est le temps nécessaire à la fois pour le transfert de l&#39;échantillon dans un TEM et de balayage de la grille pour trouver des régions propices à l&#39;image. Avec cryo-LM d&#39;acquisition de données rapide<sup&gt; 5</sup&gt;, Le temps passé à trouver les bonnes cellules peuvent être considérablement réduits. Ainsi, nous pouvons économiser temps et argent et de réduire ce goulot d&#39;étranglement par la pré-numérisation et la cartographie des zones d&#39;intérêt dans la cryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Plus cher ou complexes étages cryogéniques peuvent permettre l&#39;imagerie haute résolution cryo-LM. Cependant, la scène fabriquée ici est plus que suffisant pour de nombreuses applications. Si cryo-LM imagerie et les transferts de grille de l&#39;échantillon sont effectuées avec prudence comme décrit dans le texte et la vidéo, l&#39;imagerie entièrement libre de contamination qui peut être accompli. Cette méthode permet une corrélation directe des données de microscopie à fluorescence et électronique de la même cellule, organite ou complexes macromoléculaires dispersé sur le support de carbone ou contenus dans une section de tissu mince<sup&gt; 7</sup&gt;. Il faut noter que la valeur de cette étape cryogénique s&#39;étend au-delà cryo-LM/cryo-EM études corrélatives au domaine de la microscopie optique dans son ensemble. Cette étape cryogénique est bien adaptée pour les deux échantillons délicats et colorants fluorophore / taches<sup&gt; 8</sup&gt;, Les points quantiques, ou de protéines par fluorescence taggés<sup&gt; 9</sup&gt; Qui peut être instable lors de la fixation chimique à température ambiante et l&#39;intégration avec le glutaraldéhyde et le paraformaldéhyde. En conséquence, nous espérons que ce stade cryogénique fournira un meilleur accès à ceux qui s&#39;intéressent à la cryo-LM, qui ont déjà été dissuadés par les coûts d&#39;accès et insuffisante.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Dépannage Cryo-Light Microscopy</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Exemple d&#39;adsorption:</em&gt; Différents échantillons peuvent présenter des caractéristiques variables d&#39;adsorption à l&#39;aide de carbone. Vous trouverez peut-être nécessaire d&#39;utiliser d&#39;autres types de grilles de support tels que le carbone continue, de carbone troué, ou formvar grilles recouvertes de soutien de l&#39;échantillon. De plus, si l&#39;échantillon est contraignant pour les barres de cuivre de la grille et non la surface du carbone, il peut être nécessaire d&#39;ajuster la chimie de surface de carbone par incubation de la grille avec un agent mouillant ou par éclat de décharge avant l&#39;addition de l&#39;échantillon.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. La stabilité scène:</em&gt; Si vous remarquez des vibrations, il est probablement dû à l&#39;étape de l&#39;échantillon étant surchargé par le poids plutôt que le bouillonnement de LN2. Le poids supplémentaire de l&#39;étage cryotechnique, peut parfois provoquer des vibrations à basse fréquence pour transmettre le long de la norme 3-axes platine du microscope de voyage, et nuire à l&#39;imagerie par le flou. Cela peut facilement être corrigée en soutenant l&#39;étape de voyage du microscope par le dessous avec soit un mini-lift réglable ou un adaptateur réglable avec double vis de bras, comme le montre la vidéo. Ces deux mécanismes de soutien réglables interagir avec une partie non mobile de la phase de déplacement et permet donc encore X et Y-axe de translation tel que requis pour l&#39;imagerie.</p

Table des réactifs spécifiques et les équipements: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Catalogue # </th><th> Commentaires </th><th> Coût </th></tr><tr><td> 1 à 22,86 cm (9 &quot;) moule à tarte avec bord en pente </td><td> Bon cuisinier </td><td></td><td> Épicerie locale </td><td> 4,39 $ </td></tr><tr><td> 1 à 22,86 cm moule à gâteau (9 &quot;) </td><td> Bon cuisinier </td><td></td><td> Épicerie locale </td><td> 4,93 $ </td></tr><tr><td> 4 paires de baguettes </td><td></td><td></td><td> Épicerie locale </td><td> 0,50 $ </td></tr><tr><td> 1 - Grande pulvérisation de mousse Stuff </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 5,98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm x1cm bloc d&#39;aluminium </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale ou dans la cour de ferraille </td><td> 10,00 $ </td></tr><tr><td> 5 - n ° 10 de 1,91 cm (3 / 4 &quot;) à tête plate fendue boulons w / noix </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0,95 cm (3 / 8 &quot;) ronde fendue boulons w / noix </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 rondelles </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 2 - planchettes en plastique transparent </td><td></td><td></td><td> Magasin de bureaux locaux </td><td> 6,84 $ </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM case de la grille support </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM tige de manipulation grille de la boîte </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 film de carbone troué, 400 mailles de support en cuivre cryo-EM </td><td> Fournitures SPI </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Matériaux expérimentaux <ol><li> La souche de levure: Hta1-PCP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-PCP:: KanMX6 du laboratoire Kaplan à l&#39;UC Davis). </li><li> Cryo-microscopie Lumière: images de microscopie cryo-légers ont été prises sur un microscope Leica DM4000M reflétant avec un Leica DFC310 FX caméra CCD. Champ clair, fond noir et des images de fluorescence ont été acquises en utilisant soit une HCX Fluotar PL 5x 0,15 NA aérienne objectif, un HCX Fluotar PL 10x 0,30 NA aérienne objectif, un PL Fluotar 50x 0,55 NA de l&#39;air ou d&#39;un objectif 100x NPLAN 0,75 NA l&#39;air objectif. Champ lumineux et images utilisés sur le terrain foncé une lampe au tungstène 12V 100W comme source de lumière. Pour la fluorescence, une source EL6000 lampe UV a été utilisé en conjonction avec un Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 et LP 580) Cube filtre. </li><li> Electron Microscopy Cryo-Transmission: Cryo-EM images ont été acquises sur un microscope JEM-2100-FEG électronique à transmission (JEOL, Japon) fonctionnant à 200 keV en utilisant un Gatan 626 cryo-transfert titulaire (Gatan, USA). Micrographies ont été enregistrées à des grossissements nominale de X 50, 200, 1200 et 4000 sur un 4096 x 4096 pixels Tietz caméra CCD (TVIPS, Gauting, Allemagne). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

Le couplage de la cryo-microscopie à la lumière (la cryo-LM) et la cryo-microscopie électronique (la cryo-ME) pose un certain nombre d&#39;avantages pour la compréhension de la dynamique cellulaire et l&#39;ultrastructure. Tout d&#39;abord, les cellules peuvent être visualisées dans un environnement proche natif pour les deux techniques. Deuxièmement, en raison du processus de vitrification, les échantillons sont conservés par l&#39;immobilisation physique rapide plutôt que la fixation chimique lente. Troisièmement, l&#39;imagerie du même échantillon à la fois avec la cryo-LM et cryo-EM offre de corrélation des données provenant d&#39;une seule cellule, plutôt que d&#39;une comparaison des &quot;échantillons représentatifs&quot;. Bien que ces avantages sont bien connus à partir d&#39;études antérieures, l&#39;utilisation généralisée des corrélative cryo-LM et cryo-EM reste limitée en raison de la dépense et la complexité de l&#39;achat ou la construction d&#39;un étage cryogénique convient microscopie optique. Ici nous démontrons l&#39;assemblée, et l&#39;utilisation d&#39;un stade peu coûteuse cryogénique qui peut être fabriqué dans n&#39;importe quel laboratoire pour moins de 40 $ avec des pièces trouvées dans les quincailleries et les épiceries locales. Cette étape cryo-LM est conçue pour une utilisation avec reflétée microscopes optiques qui sont équipés de longues travailler objectifs de l&#39;air à distance. Pour corrélative cryo-ML et cryo-EM études, nous nous adaptons à l&#39;utilisation du carbone revêtu standard de 3 mm cryo-EM grilles comme supports spécimen. Après adsorption de l&#39;échantillon à la grille, les protocoles précédemment établies pour la vitrification de l&#39;échantillon et le transfert / la manipulation de la grille sont suivies pour permettre multi-technique d&#39;imagerie. En conséquence, cette configuration permet à n&#39;importe quel laboratoire avec un microscope à lumière reflétée d&#39;avoir accès à l&#39;imagerie corrélative direct des échantillons congelés hydratés.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Nous démontrons la fabrication d&#39;une scène à faible coût cryogénique conçu pour s&#39;adapter à la plupart des microscopes optiques réfléchie. Cette étape de laboratoire construit cryogénique permet efficace et fiable d&#39;imagerie corrélative entre la Cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.3K vues.  University of California Davis. Nous démontrons la fabrication d'une scène à faible coût cryogénique conçu pour s'adapter à la plupart des microscopes optiques réfléchie. Cette étape de laboratoire construit cryogénique permet efficace et fiable d'imagerie corrélative entre la Cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Microscopie à balayage vidéo confocale et à taux Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Recherche

Bio-ingénierie

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Prototypage rapide et à faible coût des dispositifs médicaux utilisant 3D Imprimé moules pour injection de liquide

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Conception d’une imprimante 3D Open-Source, Low-Cost Bioink et Food Melt Extrusion

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...