Je tiens à remercier le Dr Jennifer Curtiss pour les photos dans la Fig. 1 et Jeremy Fagan et Dr Florence Marlow pour la lecture critique du manuscrit. Notre travail est soutenu par NIH 1R01GM088202.

1. Volez une dissection tête <ol><li> Assurez vous d&#39;avoir tous les matériaux à portée de main (y compris la gélatine lames revêtues). Préparer le glutaraldéhyde et fixateurs d&#39;osmium (voir ci-dessous). Par génotype d&#39;intégrer, aliquot solution de 200 ul corriger glutaraldéhyde dans des tubes de 1,5 ml sur glace. </li><li> Anesthetize mouches sur le CO 2 pad (d&#39;habitude nous dissèquent sept têtes volent à intégrer six par génotype dans le cas d&#39;une tête est détruite pendant la procédure). </li><li> Tenir et appuyez légèrement le thorax de la mouche, face dorsale en place, avec des pincettes et l&#39;utilisation d&#39;un scalpel pointu pour couper la tête. </li><li> Stabiliser la tête volée en touchant le cou avec la pince à épiler et soigneusement Couper une petite partie d&#39;un œil. Cela améliore la pénétration du fixateur (si vous avez l&#39;intention d&#39;utiliser vos sections oeil pour analyse clonale, couper l&#39;œil avec des clones pas ou plus petit). Évitez de toucher et d&#39;endommager l&#39;œil intact qui seront ensuite sectionné. </li><li> Toucher la tête avec des ciseaux ou le bistouri à la surface de l&#39;oeil coupé et le transfert de la tête dans le glutaraldéhyde / phosphate fixatif sur la glace (les têtes flottent souvent sur le dessus du fixateur) Les chefs disséqué devrait pas être conservés dans fix glutaraldéhyde pendant de plus longues de 15 minutes avant l&#39;ajout de l&#39;osmium. Répétez les étapes 1.2 à 1.5 avec les autres mouches du même génotype. </li></ol> 2. Fixation et enrobage (utiliser des gants pour toutes les étapes!) <ol><li> Faites tourner la flyheads de centrifugeuse Eppendorf pendant 1 minute à 10000 rpm. Continue même si les têtes ne tombent pas. </li><li> Ajouter 200 ul de OsO 4 solution et correctif pour au moins 30 minutes et jusqu&#39;à 1 heure sur la glace. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur, enlever la solution de glutaraldéhyde / osmium (assurez-vous de la bonne utilisation des procédures d&#39;élimination des déchets!) Et les remplacer avec une solution d&#39;osmium 200 pl. Incuber dans la glace pendant 1-6 heures. Toujours s&#39;assurer que les têtes sont entièrement recouvert de liquide et de ne jamais supprimer l&#39;ensemble des solutions que les chefs ou les yeux pourrait s&#39;effondrer! </li><li> En utilisant une pipette Pasteur, jetez fixateur, ajouter de l&#39;éthanol 0,5-1ml 30% et incuber pendant au moins 5 minutes sur la glace (assurez-vous de la bonne utilisation des procédures d&#39;élimination des déchets depuis l&#39;éthanol contient maintenant Osmium!). </li><li> Répétez l&#39;étape ci-dessus avec 50%, 70%, (80%), 90% et deux fois 100% d&#39;éthanol. Inclure l&#39;étape éthanol à 80% si on utilise les yeux pour analyse microscopique des électrons. Après l&#39;étape de lavage à 70%, les échantillons peuvent être retirés de la glace. </li><li> Remplacer l&#39;éthanol avec un volume égal d&#39;oxyde de propylène (volatiles, continuer à travailler dans la hotte). Incuber 10 minutes à température ambiante. </li><li> Répétez laver l&#39;oxyde de propylène. Les travaux en lots si le traitement en parallèle de nombreux génotypes afin d&#39;éviter l&#39;effondrement des yeux due à l&#39;évaporation de l&#39;oxyde de propylène. </li><li> Enlever la plupart de l&#39;oxyde de propylène et de l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique, ajouter environ 500μl d&#39;une résine 01h01: solution d&#39;oxyde de propylène. Equilibrer la nuit à température ambiante. </li></ol> 3. Intégration et l&#39;arrangement dans des moules <ol><li> Assurez-vous que toutes les moules sont étiquetés pour garder trace de vos différents génotypes, puis remplir les moules avec de la résine 100%. Ne remplissez pas trop (pas de &quot;hautes collines&quot; sur la surface des moules en regardant droit dans la surface du moule). Utilisez résine dure pour l&#39;analyse des EM. </li><li> En utilisant une pipette de transfert, retirer la résine de 50% par les chefs, le remplacer par une résine 100%, et incuber pendant 3-4 heures à température ambiante. Comme les têtes sont infiltrés avec de la résine, ils vont tomber au fond du tube. </li><li> Utiliser un cure-dent qui a été frappé sur une surface dure une fois pour créer un petit crochet, le transfert d&#39;une tête à la fois dans un moule. </li><li> Placez une feuille d&#39;aluminium sur la zone de travail de votre champ de dissection pour le protéger contre les déversements de résine. </li><li> En utilisant une aiguille à dissection et en regardant si votre champ, tourbillon de la tête légèrement dans la résine et soigneusement le déplacer vers le fond du moule à proximité de l&#39;extrémité pointue. </li><li> Alignez soigneusement la surface de la intacts (!) Oeil (ou votre futur avion de sectionnement, si vous voulez avoir des sections) du cou vers le bas avec la paroi avant du moule, en veillant à garder la surface tangentielle de l&#39;œil à peu près une demi-tête Diamètre loin de la paroi du moule. Dans de rares cas, une effondrements oeil qui peut être vu comme un espace vide entre la surface de l&#39;œil et la cuticule tête. Si vous avez un oeil s&#39;est effondré, le remplacer par le 7 ème oeil de rechange. </li><li> Répétez l&#39;opération avec toutes les têtes. Une fois fait avec tous les alignements, re-vérifier tous les yeux pour s&#39;assurer qu&#39;ils ne bouge pas lorsque vous avez retiré l&#39;aiguille de la résine. </li><li> Si vous avez des problèmes avec les yeux bouger lorsque vous retirez l&#39;aiguille de dissection, la position de l&#39;oeil comme vous le souhaitez, rentrer rapidement l&#39;aiguille un peu loin de la tête et puis, lentement, retirez l&#39;aiguille complètement. </li><li> Cuire les moules nuit à 70 ° C. </li></ol> 4. Découper et sectionnement <ol><li> Retirez les blocs durcis à partir des moules en pliant les moules, ksuivre eeping dont bloc correspond à ce qui génotype (par exemple en magasin de petits flacons de scintillation). </li><li> Pour couper, utilisez un mandrin approprié pour votre microtome qui est monté sur la face visible d&#39;un bloc de plexiglas ou en aluminium. Monter le bloc à l&#39;assiette, l&#39;œil en place, dans le mandrin. </li><li> Sous le champ de dissection en utilisant un revêtement en téflon de rasoir ordonna, soigneusement coupé seule la couche supérieure de votre bloc. Cela laissera une surface clair cependant que vous devriez voir l&#39;oeil et peut ainsi prédire le futur avion de sectionnement. Évitez de couper les doigts! </li><li> Coupez l&#39;excédent de plastique sur les deux côtés de la tête et sur le front (c&#39;est à dire ce qui était autrefois le haut du moule lors de l&#39;alignement des yeux) jusqu&#39;à ce que la plupart des plastiques autour de la tête est coupée. Il est préférable de l&#39;approche lentement la tête en coupant plusieurs fines couches de plastique. </li><li> En utilisant une lame de rasoir propre, retirez soigneusement les couches minces à partir du haut de l&#39;œil dans le plan exact que vous voulez section ultérieure (généralement tangentiellement à l&#39;œil, avec un léger angle de la surface du moule original). </li><li> Continuez jusqu&#39;à ce que vous venez de commencer à réduire l&#39;écart de la surface externe de l&#39;œil. Assurez-vous que vous utilisez des zones propres de la lame pour obtenir un brillant, surface transparente, ce qui rend plus facile l&#39;alignement dans le microtome. </li><li> Pour économiser sur les lames de rasoir, utiliser les anciennes lames pour la coupe brute sur les côtés du bloc et de l&#39;utilisation d&#39;une lame de frais pour la garniture fines (d&#39;abord coupé et 4.6). En fin de compte, vous aurez une pyramide à trois côtés avec un peu inclinée, de coupure supérieure qui correspond à votre plan de coupe à venir. </li><li> Monter le bloc dans le microtome. Sectionnement réelles peuvent varier selon le type de microtome et ne sera pas décrite en détail ici. Nous utilisons un Sorvall MT5000 avec un couteau de diamant de qualité Histo de couper 0,5 à 1 um sections. Pour l&#39;analyse microscopique de lumière, de légères variations dans l&#39;épaisseur section ne compte pas. Si les clones de sectionnement marquée par une section Blanc + transgène, 1 um sections pour s&#39;assurer d&#39;avoir suffisamment de granules pigmentaires à côté de la rhabdomeres par section (fig. 2). </li><li> Les articles vont flotter sur l&#39;eau. Première levée de 20 à 30 sections avec une extrémité aplatie d&#39;un Q-tip bois par-dessous la surface de l&#39;eau dans un mouvement de rotation et les transférer dans une goutte d&#39;eau sur une lame de verre enduit de gélatine (conservé sur une plaque chauffante à environ 100 ° C ). </li><li> Répétez l&#39;opération avec une autre de 20 à 30 sections. Attendez que l&#39;eau soit évaporée et les sections coller à la diapositive. Habituellement, des sections de trois yeux disposés en trois colonnes (trois yeux) par des rangées canton (en haut / en bas des sections) cadrent bien sur une lame. </li></ol> 5. Coloration et l&#39;analyse microscopique <ol><li> À moins que des clones de sectionnement, les articles tache. Placer la lame avec des sections sur un bloc chauffant réglé à 90 ° C. Répartir la solution de coloration bleu-toluidine d&#39;une seringue de 30 ml attaché à un filtre à 0.22μm sur la lame et colorer pendant 10 secondes. Rincer immédiatement abondamment avec de l&#39;eau distillée. Air sec. </li><li> Avec une pipette de transfert en plastique, de distribuer 3 gouttes de milieu de montage DPX sur la lame et couvrir avec une lamelle. Haut avec 3 dimes et laisser le milieu de montage durcir (par exemple la nuit à température ambiante). </li><li> Image avec un microscope optique. Utilisez un objectif 5x ou 10x de trouver une bonne section et ensuite passer à un objectif à immersion 63x pour une analyse détaillée et à photographier. Nous utilisons habituellement les paramètres de contraste de phase, mais l&#39;optique darkfield travail aussi bien. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Le plus souvent, les yeux sont intégrées dans le plastique pour une analyse détaillée des phénotypes oculaires externes rugueuse détecté dans le cadre d&#39;un dépistage génétique ou dans le processus de test des interactions génétiques avec des gènes connus pour affecter la structure des yeux soit en général ou la polarité. Les résultats typiques des sections yeux sont présentés dans la figure 3. De type sauvage ommatidies (figure 3A) montrent le complément photorécepteur pleine entouré par un réseau de cellules pigmentaires. En revanche, dans un strabisme (stbm, alias Van-Gogh 7) mutant, la polarité ommatidial est perdu et, même si le complément photorécepteur complète est présente, la rotation et la chiralité sont randomisées (figure 3B). En outre, depuis l&#39;allèle stbm sectionné était en aw - fond, les granules pigmentaires sont manquants dans la Fig. 3B. La figure 3C montre un exemple d&#39;une analyse clonale. Drosophile Rho kinase (Drok) est nécessaire pour la rotation ommatidial ainsi que pour l&#39;intégrité structurale de l&#39;œil 8. Homozygote Drok deux clones peuvent être identifiées par l&#39;absence de pigment dans les cellules pigmentaires et les rhabdomeres (typiquement, les clones sont induits en utilisant eyeless-FLP et un P-élément avec un gène marqueur blanc fortement exprimée en complétant une w fond - la mutation à l&#39;état sauvage type et le tissu hétérozygote). Il est ainsi possible d&#39;identifier les domaines mutant par leur absence de pigment. En raison de la cellule-autonomie de la pigmentation de la R-CELLS mentionné précédemment, les génotypes individuels des R-cellules peuvent être déterminées (voir flèches sur la Fig. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. L&#39;œil de drosophile est un excellent modèle pour les biologistes, car, contrairement à la surface lisse d&#39;un oeil de type sauvage (A), la surface d&#39;un oeil extérieur mutant est fréquemment rugueuse (B), indicatif de phénotypes oculaire sous-jacente . Dans toutes les figures, antérieure est à gauche et dorsale est en place. Images courtoisie de Dre Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, Etats-Unis. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Lumière images microscopiques du simple ommatidies sectionné en utilisant la méthode décrite. Seuls sept R-cellules sont visibles à la fois par ommatidie, puisque R7 réside sur le dessus de R8. (A, A &#39;) Sur le plan R7, le corps cellulaire du R7 est détecté entre R1 et R6 (flèche jaune en A&#39;). En revanche, au niveau R8 (B), le corps cellulaire du R8 est détecté entre R1 et R2 (flèche jaune en B &#39;). Flèches bleues marquent les granules pigmentaires qui peut être utilisé comme marqueur de cellules pigmentaires-autonome. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Sections tangentielles travers de type sauvage (A), stbm (B) et Drok (C) yeux mutant de drosophile adulte. Schémas ci-dessous les sections indiquent la polarité des ommatidies (voir (A) pour les flèches). Les cercles représentent ommatidies avec des défauts dans le complément de photorécepteur. Les lignes jaunes représentent la ligne dorsale / ventrale de symétrie (équateur). Contrairement à l&#39;ommatidies bien orientée de type sauvage (A), l&#39;organisation planaire est perdu dans le mutant stbm (B). Notez que la section du mutant stbm montré manque de pigments en raison de sa w - fond mutant. (C) Parce que les mutations Drok sont mortels, ils doivent être analysés dans les clones. Ainsi, les cellules pigmentées sont de type sauvage ou hétérozygote (pointes de flèche bleue remplie), tandis que R-cellules pigmentaires manquent (ouvert flèches bleues) sont mutant homozygote. En plus de défauts de rotation, les mutants Drok montrent aussi les défauts structurels y compris les numéros manquants ou excès de R-cellules. Notez que pour l&#39;analyse clonale, les sections ne sont pas tachés d&#39;éviter d&#39;obscurcir les granules pigmentaires.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

En utilisant la drosophile comme organisme modèle, cribles génétiques ont conduit à l&#39;identification de la plupart des membres fondateurs de familles de gènes essentiels à la plupart des voies de signalisation hautement conservée chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains. Puisque, en vertu des conditions de laboratoire, un œil fonctionnel est dispensable pour la survie, l&#39;oeil est un tissu particulièrement bien adapté pour la découverte des fonctions des gènes roman et l&#39;évaluation des réseaux génétiques. Analyse ultrastructurale de l&#39;œil de la mouche à l&#39;aide de la méthode décrite ainsi conduit à des découvertes fondamentales pertinentes pour le développement et la maladie. Initialement, l&#39;analyse seule cellule clonale a été réalisée à l&#39;aide de rayons X induite combiné avec des clones connus étroitement associé cellulaire autonome marqueurs récessifs. Plus récemment, la disponibilité du système FLP / FRT pour générer des clones a grandement facilité l&#39;analyse phénotypique de mutations létales dans les sections 6,9 oeil. Analyse des sections œil n&#39;est pas limité aux sections tangentielles décrites ici. Si désiré, les têtes peuvent être alignés dans n&#39;importe quelle orientation dans les moules et les sections transversales peuvent être obtenus à l&#39;étude des couches plus profondes dans la tête, comme la lame et la moelle. Le protocole décrit ici est donc une méthode polyvalente pour les analyses d&#39;adultes tête et des yeux chez la drosophile structures.

Equipement général: <ul><li> Pour l&#39;élevage volée général, voir 10 </li><li> Microscope à dissection standard (par exemple Nikon SMZ-645 Microscope zoom stéréo), de préférence avec une source lumineuse anneau pour empêcher une ombre de tes mains. </li><li> Pavé de CO 2 Fly, couvert de papier Whatman 3MM pour fournir une protection contre la saleté lors de la dissection. </li><li> Gélatine lames revêtues: dissoudre 10g de gélatine et 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O dans 1 litre d&#39;eau sur une plaque chauffante (amener presque à ébullition, il faut environ 2 heures). Trempez glisse bien lavés (savon) et rincés (dH 2 O) dans détenteurs en solution de gélatine et sécher à l&#39;air recouvert d&#39;une feuille pendant la nuit. </li><li> Four de chauffage (70 ° C; fours sous vide anciens qui ont été utilisés pour le séchage du filtre de nitrocellulose sont bien adaptés à cet effet). </li><li> Capable de sectionner ultraminces (0,5-1 um sections épaisses) microtome, par exemple, ceux utilisés par les installations microscopie électronique. Nous utilisons un Sorvall MT5000 Ultramicrotome avec un couteau de diamant de qualité Histo. Couteaux de verre également. </li></ul> Solutions de fixation: <ul><li> Préparer une solution stock de 0,2 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,2. </li><li> Préparer glutaraldéhyde à 2% dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2 (peut être conservé à 4 ° C pendant 4 semaines). Faire au moins assez pour avoir 200 pl par génotype que vous souhaitez intégrer. Restez sur la glace. </li><li> Solution de l&#39;osmium: 2% OsO 4 dans le tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2. Faire juste assez pour avoir 200 pl par génotype que vous souhaitez intégrer, car la solution ne peut pas être stockée. Restez sur la glace. </li></ul> Glutaraldéhyde et OsO 4 sont très toxiques et doivent être manipulés avec un soin extrême dans une hotte bien ventilée. Utilisez bouts filtres lors de la manipulation OsO 4 pour empêcher le noircissement de votre pipette. Déshydratation: Faire 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, et des solutions d&#39;éthanol à 100%. De préférence fraîche 30%, 50%, 70% d&#39;éthanol sur la glace avant utilisation. Solution de coloration: 1% de toluidine-bleu dans Borax 1%. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Doux </th><th> Dur </th></tr><tr><td> Résine A </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> B Durcisseur </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Accélérateur C </td><td> 2.5g </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Plastifiant D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Préparation de résine Pour préparer la résine, avec soin, mais bien mélanger tous les ingrédients dans un récipient en plastique avec un agitateur magnétique avec un agitateur grande. Eviter les bulles. Après mélange, aliquote dans des flacons de scintillation standard ou contenants similaires et congeler à -20 ° C. Utilisez résine souple pour toutes les applications, sauf si votre installation EM demande la plus difficile la formulation. Utilisez des gants pour manipuler la résine (cancérigène, dans sa forme non polymérisée). À polymériser la résine sur l&#39;équipement et des déchets, cuire au four à 70 ° C pendant la nuit. Les déchets peuvent alors être jeté et l&#39;équipement nettoyé et réutilisé. Renversé en résine non polymérisée peuvent être nettoyées avec de l&#39;isopropanol. <table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs </th><th> Fournisseur </th><th> Le numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Fly pad </td><td> par exemple, Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO 4 </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propylene </td><td> Fisher </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Poignées de scalpel, pour # 3 </td><td> Fisher </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Les lames de bistouri n ° 11 </td><td> Fisher </td><td> 08 à 916-5B </td></tr><tr><td> Pipettes de transfert </td><td> Fisher </td><td> 13 à 711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) de résine ACM </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> Aiguilles en acier dissection </td><td> Fisher </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> Moisissures BEEM intégration plat </td><td> Electron Microscopy Sci. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Lames de rasoir revêtement Teflon </td><td> Electron Microscopy Sci. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-tip (tampons stériles) </td><td> Fisher </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Lames de verre </td><td> Fisher </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Couverture glisse n ° 1, 22X60 mm </td><td> Fisher </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Fisher </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodécahydraté </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Diamant Histo couteau, 6mm </td><td> Diatome américain </td><td> 60-Son </td></tr><tr><td> Bleu de toluidine O </td><td> Fisher </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Borax (Na-Tétraborate) </td><td> Fisher </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX milieu de montage </td><td> Sigma </td><td> 44581-100ML </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Matériaux

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophile a longtemps été utilisé comme système modèle pour étudier le développement, principalement en raison de la facilité avec laquelle il est génétiquement maniable. Au fil des ans, une pléthore de souches mutantes et des astuces techniques ont été développées pour permettre à des questions complexes pour être posées et répondues dans un délai raisonnable. Aperçu fondamentaux dans le jeu de composants de toutes les voies de signalisation majeures connues a été obtenue en marche avant et arrière études génétiques chez la drosophile. L&#39;œil de la mouche s&#39;est avérée être exceptionnellement bien adapté pour l&#39;analyse mutationnelle, puisque, dans des conditions de laboratoire, les mouches peuvent survivre sans les yeux fonctionnelle. Par ailleurs, la surface de l&#39;œil des insectes est composé de quelque 800 yeux unité individuelle (facettes ou ommatidies) qui forment une base régulière, surface lisse quand on les regarde sous un microscope à dissection. Ainsi, il est facile de voir si une mutation pourrait affecter le développement des yeux ou de croissance externe par la recherche de la perte de la surface lisse («œil rugueux phénotype; Fig 1.) Ou la taille des yeux ensemble, respectivement (pour des exemples d&#39;écrans basés sur la morphologie externe de l&#39;œil voir par exemple 1). Après des analyses détaillées des phénotypes oculaires nécessitent une fixation, d&#39;inclusion plastique et de fines coupes d&#39;yeux d&#39;adulte. L&#39;œil de drosophile se développe à partir du disque oeil dits imaginale, un sac de cellules épithéliales qui prolifèrent et se différencient au cours des stades larvaires et la nymphe (pour revue, voir deux, par exemple). Chaque ommatidie se compose de 20 cellules, dont huit photorécepteurs (PR ou R-cellules;. Fig 2), quatre cellules de cône cristallin sécrétant, les cellules pigmentaires (&#39;hexagone &quot;autour de R cellule cluster) et un poil. Les photorécepteurs de chaque ommatidie, plus facilement identifiés par leur lumière organites sensibles, le rhabdomeres, sont organisés dans un trapèze composée de six &quot;extérieur&quot; (R1-6) et deux &quot;intérieure&quot; photorécepteurs (R7 / 8; R8 [Fig 2.] est au-dessous R7 et donc seulement vu dans les sections à partir des zones plus profondes de l&#39;œil). Le trapèze de chaque facette est précisément alignées sur celles de ses voisins et les axes antéropostérieur et dorsoventral globale de l&#39;œil (figure 3A). En particulier, les ommatidies de la dorsale et ventrale (flèches noires et rouges, respectivement) moitiés de l&#39;œil sont des images miroir les uns des autres et correspondent à deux formes chirales établi au cours de la signalisation cellulaire polarité planaire (pour revue, voir par exemple 3). La méthode pour générer des sections oeil semi-fines (comme celles présentées dans la Fig. 3) décrit ici est légèrement modifiée de celle initialement décrite par Tomlinson et Ready 4. Il permet l&#39;analyse morphologique de toutes les cellules sauf pour les cellules de cône transparent. De plus, le pigment de la R-cellules (flèches bleues sur la Fig. 2 et 3) peut être utilisé comme un marqueur de cellule autonome pour le génotype d&#39;un R-cellulaires, les exigences ainsi génétique de gènes dans un sous-ensemble de R-cellules peuvent aisément être déterminée 5,6.

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Une approche standard pour préparer les adultes<em&gt; Drosophile</em&gt; Les yeux pour les semi-minces et légers sectionnement analyse microscopique est présentée ici. Le protocole peut être utilisé pour l&#39;analyse morphologique brut de défauts oculaires, ou avec les réglages indiqués peuvent être utilisées pour déterminer les exigences génétiques des gènes dans des types cellulaires spécifiques de l&#39;œil (par exemple, l&#39;analyse clonale des photorécepteurs) ou pour l&#39;analyse microscopique des électrons.

Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

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Research

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Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

16.0K vues.  Albert Einstein College of Medicine. Une approche standard pour préparer les adultes Drosophile Les yeux pour les semi-minces et légers sectionnement analyse microscopique est présentée ici. Le protocole peut être utilisé pour l'analyse morphologique brut de défauts oculaires, ou avec les réglages indiqués peuvent être utilisées pour déterminer les exigences génétiques des gènes dans des types cellulaires spécifiques de l'œil (par exemple, l'analyse clonale des pho...

Vidéo: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sectionnement des préparations minces tranches d&#39;immunohistochimie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Recherche

Biologie

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Enregistrements à partir de cellules entières du cerveau d&#39;adulte drosophile

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection de l&#39;hippocampe gyrus denté de souris adulte

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Préparation de développement et de l&#39;adulte Drosophile Cerveaux et la rétine d&#39;imagerie en temps réel

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Cartographie automatisée de l’espace visuel des yeux composés de mouches domestiques

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Évaluation de la toxicité chimique chez la drosophile melanogaster adulte

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...