Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Welch (I-1657) et le NIH (RO1EY18884). PRH est un chercheur Eugene McDermott dans la recherche biomédicale.

1. Présentation Dans cette vidéo, nous allons montrer comment préparer les cerveaux drosophile et la rétine pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;immunohistochimie avec un accent sur ​​les cellules photoréceptrices. Tout d&#39;abord, nous allons montrer comment se préparer pour les dissections du cerveau. Ensuite, nous allons démontrer deux dissections de base couramment utilisé pour l&#39;immunohistochimie qui forment la base pour les préparations en direct. Ces deux préparations sont le cerveau adulte et des dissections oeil. Ensuite, nous allons démontrer les dissections utilisés pour l&#39;imagerie en direct du cerveau adulte et le développement en mettant l&#39;accent sur ​​leur utilisation pour l&#39;imagerie en direct de photorécepteurs. Enfin, nous allons décrire l&#39;image du tissu façon dont nous vivons et de montrer quelques exemples de l&#39;imagerie de résonance en direct en utilisant la microscopie confocale. 2. La préparation de dissection <ol><li> Pour les dissections de bonnes, vous avez besoin d&#39;une pince forte. En utilisant un bloc à aiguiser ou du papier de verre très fin (&gt; 1500), doucement passer la pince avant et en arrière de chaque côté jusqu&#39;à ce que les deux bouts à une fine pointe. Nous utilisons une pierre à aiguiser la norme. Nous ne couvrons pas la technique d&#39;affûtage, mais sachez que le forceps forte sont indispensables pour les dissections vivre. Nous affûter pince avant chaque dissection. </li><li> Pour les dissections cerveau adulte, placer les mouches sur un pad CO 2 pour les anesthésier et trier le génotype désiré. Pour les dissections nymphe, il suffit de rejoindre dans le flacon et retirez soigneusement une nymphe avec votre pince, en prenant soin d&#39;éviter de casser le cas chrysalide. </li><li> Imbibez un Kimwipe avec de l&#39;eau. Vous utiliserez ce lors de la dissection d&#39;enlever les débris de votre pince. Position d&#39;un plat de dissection sur la scène d&#39;un stéréoscope et remplissez-le avec HL3 solution 1. Tous les dissections seront menées dans HL3 pour s&#39;assurer que le tissu reste vivante et en bonne santé lors de la procédure de dissection. Aussi, nous utilisons un plat dissection qui a une couverture inférieure de Sylgard pour protéger pince lors de la dissection. </li><li> Maintenant, préparez la fixation solution si vous prévoyez d&#39;effectuer immunohistochimie. 180μL Lieu de HL3 dans un microtube 500μL. Ajouter 20 pi de formaldéhyde à 37% pour obtenir une solution de formaldéhyde de 3,7%. </li><li> Enfin, la position des mains est important pour les dissections bon. Avec la position bonne main, votre pince sera stable et capable de contrôler les mouvements subtils. D&#39;abord, placez la pince sur le côté de votre pouce. Puis mettre l&#39;index droit vers le bas de sorte que le bout du doigt repose sur le dessus. Maintenant reste le côté de la pince sur le côté de votre doigt du milieu et de passer à l&#39;antenne de dissection. Prenez contact physique avec le plat de votre pouce et le majeur. Tout en se reposant de votre pouce et le majeur sur le plat, plantez votre poignet sur la platine du microscope. De cette façon, vous avez trois points fermement plantés sur des surfaces lors de la dissection et il est maintenant possible de faire des manipulations très subtiles de la pince. Cette technique peut sembler un peu bizarre au début, mais avec la pratique, vous allez bientôt être un maître de dissections cerveau. </li></ol> 3. Cerveau adulte <ol><li> Sur le CO 2 pad, orienter un adulte volée face ventrale avec la tête loin de votre main. Prenez le thorax juste en dessous de la tête. Si c&#39;est fait correctement, les jambes et le proboscis se prolonger. Pendant l&#39;affichage dans un stéréoscope, prenez la trompe étendue avec votre pince pour enlever la tête. Jeter le corps et plonger la tête. Recentrer sur la tête immergée. La dissection sera entièrement réalisée sous solution. Il est très important de tenir sur la tête avec une pince à tout moment. Sinon, la tête va flotter et sont difficiles à récupérer. Si la tête se déplace pas au point lors de la dissection, il suffit de revenir s&#39;installer dans le plan focal sans ajuster le microscope. Cette tâche apparemment simple peut être difficile au début, mais en gardant la tête dans accent sera devenu plus facile au fil du temps. </li><li> Commencez d&#39;abord par la dissection de déchirer le tissu conjonctif entre les trompe et les yeux. Larme à travers l&#39;oeil tout en tenant fermement avec au moins une pince à tout moment. Soyez certain que la pointe de la pince est tout juste sous la rétine ou cuticule, pour éviter d&#39;endommager le dessous du cerveau. Alternativement à gauche et à droite, utilisez votre pince pour arracher la rétine, en travaillant vers l&#39;arrière de la tête. Arrachement de la rétine va augmenter les chances que la lame reste attaché à la lobe optique au long de cette dissection. Continuer à l&#39;arrière de la tête, déchirant la cuticule le long du chemin. Larme à travers les yeux d&#39;autres et de commencer écartant cuticule. Tant que vous êtes saisissant cuticule, vous savez que vous n&#39;êtes pas écraser le cerveau! Dans cet esprit, continuer à tirer la cuticule et de la rétine suite jusqu&#39;à ce que le cerveau est révélé. </li><li> Une fois que le cerveau est visible, vous pouvez commencer à retirer la trachée rattachés au cerveau (figure 1A). Continuez à tirer sur la trachée et les cuticules jusqu&#39;à ce que le cerveau est isolé. À ce stade, vous devriez recentrer vers le bas de votre plat pour tIl étapes restantes. Retirez la trachée reste parce que votre cerveau peut autrement flottent au cours lave d&#39;anticorps pendant la nuit. Pour l&#39;imagerie des terminaux de photorécepteur, il est souhaitable de conserver la lame, mais vous devez retirer la rétine, qui contient les corps cellulaires et des pigments vivement autofluorescente. Pour ce faire, tirez délicatement au reste touffue et pigmentées cellulaires sans endommager la lame. C&#39;est une compétence plus fine et de la pratique. </li><li> Le cerveau adulte peut être maintenu en vie pendant des heures voire des jours à l&#39;aide des conditions que nous allons discuter dans la section 6. Pour l&#39;immunohistochimie, le cerveau adulte est maintenant prêt à être fixé dans du formol. 2 Utilisez un pipetteman P20 mis à 5uL pour déplacer le cerveau adulte à la solution de fixation vous avez déjà préparé. Continuer à disséquer les cerveaux adulte pour 20 minutes, ce qui devrait donner 4-10 cerveau. Laisser les cerveaux de correctif pour un 40 minutes supplémentaires, mais cette durée peut varier pour la coloration des anticorps primaire optimale. Retirer la solution de formaldéhyde et laver les cerveaux 3 fois pendant 5 minutes chacun dans 400μL d&#39;une solution contenant du PBS et 0,4% TritonX-100, ci-après dénommé PBS-Triton. Après avoir complètement lavage de la solution de correction, vous pouvez ajouter la solution d&#39;anticorps primaire. </li></ol> 4. Oeil pour adultes <ol><li> Commencez cette dissection comme décrit pour le cerveau adulte. Après submergeant la tête et le recentrage du microscope, commencer par déchirer le tissu conjonctif entre les trompe et les yeux. Au-dessus de la trompe, séparée la cuticule de l&#39;œil. Maintenant, séparer la cuticule de la face inférieure de l&#39;œil, en travaillant vers l&#39;arrière de la tête. Avec une pince, saisir le centre de l&#39;arrière de la tête. Avec l&#39;autre, attraper l&#39;oeil et tirez. Autoriser l&#39;œil à se déposer au fond du plat (Fig. 1B). Le limbe seront probablement encore attachée à l&#39;œil et peut être utilisé pour l&#39;imagerie en direct de bornes de cellules photoréceptrices complètement intact en ce moment. Pour continuer avec l&#39;imagerie en direct de corps cellulaires des photorécepteurs, allez à la section 4.5. Les trois sections suivantes expliquent immunohistochimie oeil fixe. </li><li> Pour l&#39;immunohistochimie, de déplacer l&#39;œil à la fixation solution en utilisant un pipetteman P20 mis à 5uL. Poursuivre la dissection des yeux d&#39;adulte pour un total de 10 minutes. Laissez les yeux dans les fixer pour 30 minutes supplémentaires. Retirer la solution fixer et réaliser lave comme décrit dans la dissection du cerveau adulte. </li><li> Si vous souhaitez finalement l&#39;image de la structure de l&#39;oeil ommatidial la lame doit être retiré maintenant. Retourner le regard fixé à votre plat disséquer et enlever toutes les cellules trachée ou la graisse qui peuvent encore être fixé. Ensuite, tout en maintenant l&#39;extérieur de l&#39;œil avec une pince, retirer la lame avec l&#39;autre. Il faut se détacher en un seul morceau, ce qui expose l&#39;cellbodies dessous (Fig. 1B). Soyez prudent de saisir la lame seulement! Sinon, vous risquez de détacher les photorécepteurs de la rétine. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pipetteman P20, bouger les yeux à 400uL PBS-Triton dans un tube 500uL. Doucement les roches à 4 degrés durant la nuit pour enlever le pigment rouge de la autofluorescente photorécepteurs. Le jour suivant, vous pouvez jeter la solution de lavage et ajouter une solution d&#39;anticorps primaire. </li><li> Pour l&#39;imagerie en direct de yeux d&#39;adulte, nous n&#39;utilisons que les mouches adultes pharate, c&#39;est à dire les nymphes stade tardif, peu avant l&#39;éclosion. A ce stade, les corps cellulaires des photorécepteurs séparés à partir de terminaux dans la lamina lors de la dissection. </li><li> Adulte Pharate nymphes ont des ailes bien définies, les yeux, et la cuticule visibles à travers la coque de nymphose. Sélectionnez une nymphe et retirez la partie antérieure de la coque de nymphose pour exposer la région de la tête. Retirer délicatement la membrane interne mince qui renferme en outre à la volée en développement. Prenez la base de la tête avec votre pince et tirez. Jeter le reste de la nymphe tout en gardant la tête immergée. </li><li> Procédez comme démontré dans la dissection des yeux pour l&#39;immunohistochimie. Au stade adulte pharate, cependant, les corps cellulaires des photorécepteurs se détache plus facilement de la lame, vous permettant de l&#39;image du corps cellulaire niché dans la rétine. En outre, la lame reste attaché au lobe optique, vous permettant de l&#39;image de la lamina distale. Si vous souhaitez l&#39;image de la lamina proximale, où les cartouches terminale photorécepteur peut être vu, puis effectuer la dissection oeil sur une mouche adulte, où la lame est plus fortement attaché à l&#39;œil. </li></ol> 5. Développer l&#39;œil-cerveau disque complexes <ol><li> Le disque oeil en développement au développement des pupes de 20% (P 20%) est devenu un favori pour l&#39;imagerie vivre dans notre laboratoire, en raison de cette seule couche de cellules en développement relativement important est facilement observable par microscopie confocale 3. </li><li> Pour sélectionner une nymphe de 20%, cherchez l&#39;tubes de Malpighi, un point vert apparaît sous la nymphe le cas, et d&#39;éviter les nymphes qui ont un «corps noir» 4. Après avoir sélectionné un submerger P 20% nymphe, il en HL3 dans votre plat de disséquer et enlever soigneusement une partie antérieure du sac pupe, en faisant attentionde ne pas pénétrer la membrane interne mince. Saisissez la membrane interne avec votre pince et tirez. </li><li> Soigneusement rechercher dans le contenu publié à trouver le cerveau en développement et les disques yeux qui sont assez importants (Fig. 1C). L&#39;œil de disque cérébrale complexe est facilement séparé à ce stade de la métamorphose. Isoler le cerveau au fond du plat à dissection. Soigneusement séparés le cerveau central du lobe optique. L&#39;optique du lobe / œil disque sera utilisé en imagerie en temps réel. </li></ol> 6. En direct d&#39;imagerie: A la loupe <ol><li> Si vous souhaitez l&#39;image pour une courte période de temps dans seulement un ou deux solutions, vous pouvez l&#39;image de votre tissu sur une lame de verre. Dans ce cas, préparer la diapositive en première couche de la surface avec l&#39;aide de Sylgard les instructions du fabricant. Placer 20 pi HL3 dans le milieu de la diapositive. Transport de vos tissus disséqués dans 20 ul supplémentaires de HL3 à la diapositive. Le tissu doit jamais être exposé à l&#39;air. En outre, tout le stress ou la souche de la manipulation pipette ou tension superficielle solution doit être évitée. </li><li> Pour l&#39;imagerie en direct, le tissu doit être solidement fixé avec un minimum de manipulation et de contact. Nous solidement la position du cerveau en utilisant l&#39;eau GluShield polymérisation de la colle chirurgicale appliquée à travers une microélectrode, une technique couramment utilisée pour les préparations embryonnaires pour électrophysiologie 5. Procurez-vous un verre de l&#39;électrode comme ceux tirés des enregistrements électrophysiologiques. Brisez la pointe et de remplir la fin avec GluShield utilisant une pression négative générée par la bouche. Casser juste assez de l&#39;électrode qui colle peut entrer. Vous pouvez maintenant utiliser une pression positive d&#39;appliquer une petite quantité de colle sur la Sylgard dans une goutte de HL3. Maintenant, rapidement mis le tissu sur la colle, le maintien de l&#39;orientation désirée pour l&#39;imagerie en direct. Une lentille d&#39;eau d&#39;immersion peuvent désormais être utilisés pour l&#39;imagerie. Si vous voulez ajouter un colorant membrane perméable, vous pouvez l&#39;ajouter au bain tout en imagerie. </li><li> Nous utilisons un microscope à balayage confocal résonance qui permet d&#39;imagerie rapide avec 6 réduits photoblanchiment. Pour l&#39;imagerie sur de longues périodes de temps ou d&#39;échanger des solutions complètement ou plusieurs fois, nous utilisons une chambre de perfusion (Harvard IC30 imagerie confocale de chambre) qui se connecte à une pompe péristaltique qu&#39;il perfuse lentement solution de culture sur les tissus vivants (figure 2A). Mouvement de change constant et de liquide de contact GluShield minimale de réduire l&#39;aplatissement du tissu qui a été observé sur de plus longues périodes de temps 7. Notez que pour l&#39;imagerie des périodes de temps de développement, l&#39;œil-cerveau disque complexe doit rester intact et devrait avoir un contact minimal avec la colle. </li><li> Utiliser une lamelle recouverte d&#39;une goutte de Sylgard qui est rasé pour le rendre mince et plat. Distribuer 20 pi HL3 sur le centre de la lamelle et coller les tissus vivants à l&#39;Sylgard. Générer un joint qui va permettre aux bulles de passer à travers la chambre sans exposer les tissus vivants à l&#39;air (figure 2B). Le joint doit être assez épaisse pour éviter d&#39;écraser le tissu, mais assez mince pour porter le tissu proche de l&#39;objectif du microscope confocal, nous utilisons 250μm dans notre configuration. Assemblez la chambre de perfusion, en faisant attention de garder le tissu complètement submergé en tout temps. Commencez la perfusion initialement à un taux proche de 100 ul par minute en utilisant une pompe péristaltique. Cette vitesse est assez rapide en fonction de l&#39;épaisseur du joint qui définit la hauteur de la chambre. Pour l&#39;imagerie à l&#39;échelle des heures, vous pouvez avoir besoin d&#39;ajouter 20 hydroxyecdysone et antibiotiques, mais pas antifongiques, et effectuer la perfusion à une vitesse beaucoup plus faible autour de 10 ul par minute. Enfin, l&#39;oxygène que nous bulles dans le milieu de culture qui alimente la chambre de perfusion. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: A la fin de notre protocole de vidéo, nous montrent un exemple pour l&#39;imagerie vivent dans des cellules photoréceptrices de développement en utilisant la préparation présenté dans la section 5. Cette préparation prend avantage de la drosophile transgénèse à la cellule-expriment spécifiquement aux journalistes fluorescentes. Dans l&#39;exemple illustré, deux journalistes fluorescentes sont exprimés sous le contrôle du photorécepteur spécifique GMR-Gal4 pilote 8: la membrane-taggés myrRFP et le marqueur endosomal 2xFYVE-GFP 9. Deux canaux ensembles de données 3D avec une boîte englobante de 70x70x17.5μm et une taille de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) ont été obtenues toutes les 1 min. Le film montre un plan sélectionné au fil du temps dans ce jeu de données 4D qui révèle la dynamique du trafic intracellulaire des endosomes et des événements de fusion des vésicules. Images représentant des préparations de tissu fixe de l&#39;œil et de la lame sont présentés sur la Fig. 3.

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Sondes fluorescentes utilisés pour l&#39;imagerie Nous décrivons ici les forces et les limites de la préparation drosophile système visuel pour une sélection de sondes fluorescentes de trois classes: (1) Les sondes qui sont ajoutés à une préparation des tissus vivants de manière exogène, (2) les protéines fluorescentes qui sont génétiquement codés pour les deux vivent et imagerie fixe; (3) des colorants fluorescents qui sont ajoutés aux tissus fixés pour l&#39;immunohistochimie. 1. Sondes exogènes: Lysotracker vert MDN-26 ou Red MDN-99 (Invitrogen, Inc) Ce sont disponibles dans le commerce fluorescentes membrane perméable à des composés qui s&#39;accumulent dans les compartiments fortement acidifié dans la cellule, le plus en évidence les lysosomes, endosomes tardifs, et autophagosomes. Lysotracker à des concentrations nanomolaires (nous utilisons généralement 50 nm) pénètre le disque L3 et P oeil 20% totalement en moins d&#39;une minute. Depuis Lysotracker s&#39;accumule en permanence et exerce un effet alcalinisant, nous avons l&#39;image en moins de 5 minutes. Contrairement aux disques oeil, Lysotracker ne pénètrent dans le cerveau sans perturbation du tissu. Cependant, attention déchirure de la membrane externe permet la pénétration d&#39;un diamètre de quelques cellules dans le lobe optique. Lysosensor MDN-189 (Invitrogen, Inc) Contrairement à Lysotracker, Lysosensor ne s&#39;accumule pas dans les compartiments acidifié, mais présente augmentation de fluorescence à pH acide. Lysosensor a des caractéristiques de pénétration qui sont très semblables à Lysotracker. Nous utilisons Lysosensor à une concentration de 1 uM. 2. Sondes génétiquement codés: Pour de nombreuses expériences d&#39;imagerie vivons, nous expriment les gènes marqués avec différentes molécules fluorescentes comme la GFP, TagRFP 10 ou le pHluorin sensibles au pH 11 sous le contrôle du système Gal4/UAS expression binaire 12. Gal4-lignes qui expriment dans les photorécepteurs de développement comprennent GMR-Gal4 (tous les photorécepteurs) 8 et mDelta0.5-Gal4 (développement R4 et R7) 13. Plusieurs sous-types spécifiques Gal4-pilote lignes existent qui utilisent différents promoteurs Rhodopsin 14. Particulièrement utile sondes fluorescentes dans l&#39;imagerie en direct sont des protéines photoconvertible. Nous avons utilisé avec succès Dendra2, un monomère verte à rouge protéines photoconvertable 15. Notez que Dendra2 est conçu pour être photoconvertible utilisant un laser Argon 488nm ligne. Cependant, nous sommes incapables de réaliser la conversion en utilisant une lumière bleue visible à l&#39;aide de notre set-up en mode de numérisation conventionnelles ou de résonance confocale. En revanche, la conversion avec le laser UV 405nm est efficace. 3. Immunohistochimie: Pour l&#39;œil adulte fixe, nous avons souvent le choix entre la rhodamine phalloïdine (Invitrogen, Inc) ou anti-Chaoptin (un anticorps spécifique des photorécepteurs 16) pour visualiser la structure rhabdomeric (figure 1A). Une bonne façon d&#39;analyser la structure cartouche limbe est de combiner anti-chaoptin 16, le marqueur glial anti-ébène 17, et anti-sec6 18 (Fig 1B). Comme le montre la Fig. 3, cette combinaison d&#39;anticorps qui distingue les grands présynaptique (chaoptin) et post-synaptiques (sec6) des processus ainsi que la GLIA épithéliales (ébène) dans la lamina 19. Assemblage de la chambre de perfusion Pour l&#39;imagerie en direct, nous employons une chambre de perfusion qui permet l&#39;échange lente de solutions sans déranger la préparation des tissus. Une démonstration de l&#39;assemblage chambre de perfusion est inclus dans la vidéo et schématisé à la figure 2. Assemblée de la chambre de perfusion est illustré dans la Fig. 2A. Commencez par la pose du joint sur le premier échantillon, et ensuite poursuivre l&#39;assemblage, comme indiqué. Le but de la garniture est de créer un espace entre la base de la chambre et le couvercle, un espace à l&#39;intérieur duquel le tissu est scellé et à travers lequel la solution de flux. L&#39;espace à l&#39;intérieur du joint doit inclure l&#39;entrée (solution pénètre ici), la préparation des tissus, et la sortie à travers laquelle la solution quitte la chambre. Deux caractéristiques de la garniture sont essentiels: d&#39;abord, le joint doit être suffisamment épaisse pour que le cerveau encore assez mince pour permettre l&#39;imagerie avec une lentille à haute résolution. L&#39;épaisseur du joint idéal dépend de configuration des paramètres spécifiques. Deuxièmement, une encoche dans le joint fournit un compartiment qui permet une bulle de passer à travers sans contact avec l&#39;échantillon (figure 2B). Imagerie au microscope Nous utilisons un 63x (ouverture 1,3) lentille à immersion de glycérine pour la chambre de perfusion ou d&#39;une lentille d&#39;eau par immersion 63x directement dans le milieu de culture sur une diapositive. Glycérine lentilles fournir plus de travail à distance que les lentilles de pétrole. Nous utilisons un microscope à balayage confocal à résonance qui scanne à des taux beaucoup plus rapide qu&#39;un scanner conventionnel (8000 Hz 1400 Hz par rapport, respectivement). Resonant permet la numérisation en 3 dimensions des enregistrements au fil du temps au fastdes taux de trame ER. En outre, les vitesses de numérisation plus rapide de réduire considérablement la phototoxicité laser 6 qui est une préoccupation majeure pour les scans répétés de tissus vivants. Un équilibre entre l&#39;intensité du laser et la tension PMT (gain) doit être réalisé afin de maximiser le signal, tout en minimisant le bruit et photoblanchiment. Une considération importante est que la quantité d&#39;impact laser sur une région donnée est déterminée par la résolution et le zoom. Par exemple, une région de choix est scanné à la même résolution à 256x256, un zoom 2x au 512x512, un zoom 1x, mais la vitesse maximale possible d&#39;imagerie en direct est 4 fois plus rapide à 256x256, un zoom 2x. Pour enregistrer l&#39;activité de déplacer rapidement des compartiments intracellulaires, nous avons réussi a enregistré avec les paramètres suivants: 5 images par Z-stack au rythme d&#39;un Z-stack par 10 secondes avec une vitesse de balayage de 8000 Hz et moyenne gamme 2x. Pour les sessions d&#39;imagerie longue à l&#39;échelle de l&#39;heure, nous avons souvent de réduire le taux de trame à un pour plusieurs minutes et choisissez grands domaines comme la préparation est plus susceptible de changement. Anatomie drosophile Visual System La figure 3 montre l&#39;anatomie de l&#39;œil adulte drosophile (figure 3A), le cerveau adulte (figure 3B), et les 20% -25% des yeux nymphe disque / complexe du cerveau (figure 3C). La figure 3A illustre l&#39;œil adulte à la fois avec et sans la lame et les cellules graisseuses en annexe. Lors de la dissection des yeux des adultes, le limbe, qui est au centre de l&#39;oeil niché dans une cuvette formée par les corps cellulaires des photorécepteurs (à gauche), doit être retiré sans perturber les corps cellulaires en dessous (à droite). Pour la dissection du cerveau adulte, on doit être capable de distinguer les corps cellulaires des photorécepteurs, la lame, le lobe optique, le cerveau central, et de la trachée (figure 3B). Les photorécepteurs et de la trachée ont besoin d&#39;être retiré pour cette dissection, tout en laissant la lame attachée au lobe optique. Pour aider à l&#39;identification de l&#39;œil à 20-25% du disque / cerveau nymphe complexe, une image en direct est présenté dans la figure 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cerveau adulte (A). Œil adulte (B). (C) 20% -25% nymphe eye-disc/brain complexes. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. (A) Assemblée chambre de perfusion et (B) joint positionnement par rapport à l&#39;échantillon. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Figure 3" /> La figure 3 (A). Coloration adultes rhabdomere utilisant des anticorps anti-chaoptin. (B) coloration lamina adultes utilisant des anticorps anti-chaoptin (vert, les photorécepteurs), anti-ébène (rouge, cellules gliales), et sec6 (bleu, interneurones).

Équipement spécial: <ol><li> Portée Dissection: Leica Mz12.5 avec appareil photo numérique </li><li> Leica TCS SP5 confocale tandem scanner à balayage Microscope pour conventionnel et résonnante direct microscope d&#39;imagerie, y compris le bleu (488nm), vert (561nm), orange (594nm) et rouge lointain (633nm) lasers ainsi que 63x spéciale, 1,4 glycérine et un 63x, 1,3 verres immersion dans l&#39;eau. </li><li> Harvard Instruments modèle de pompe imagerie confocale Chambre RC-30 et péristaltique 720 </li><li> Sutter pipette extracteur P-97 </li><li> Logiciel: Amira 5.2, imagerie Visage </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Du cerveau et du système visuel sont largement utilisés pour étudier des systèmes modèles neuronaux développement, la fonction et la dégénérescence. Ici, nous montrons trois préparations du cerveau et du système visuel qui couvrent la gamme de l&#39;œil de disque complexe du cerveau en développement dans les chrysalides en développement à l&#39;œil et la dissection du cerveau individuels de mouches adultes. Tous les protocoles sont optimisés pour la culture vivante de la préparation. Cependant, nous présentons également les conditions pour l&#39;immunohistochimie tissus fixés, le cas échéant. Enfin, nous montrons les conditions d&#39;imagerie vivre pour ces préparations à l&#39;aide conventionnelle et résonnante 4D imagerie confocale vivre dans une chambre de perfusion. Ensemble, ces protocoles fournissent une base pour l&#39;imagerie en direct sur différentes échelles de temps allant de fonctionnelles dosages intracellulaires à l&#39;échelle de minutes pour les processus de développement ou dégénératives sur l&#39;échelle de plusieurs heures.

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Ce protocole décrit trois<em&gt; Drosophile</em&gt; Les préparations: 1) la dissection du cerveau adulte, 2) la dissection rétine adulte et 3) développer l&#39;œil-cerveau disque de dissection complexes. L&#39;accent est mis sur les techniques de préparation et des conditions particulières pour l&#39;imagerie en direct, bien que toutes les préparations peuvent être utilisées pour l&#39;immunohistochimie tissus fixés.

Préparation de développement et de l&#39;adulte Drosophile Cerveaux et la rétine d&#39;imagerie en temps réel

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.2K vues.  University of Texas Southwestern Medical Center. Ce protocole décrit trois Drosophile Les préparations: 1) la dissection du cerveau adulte, 2) la dissection rétine adulte et 3) développer l'œil-cerveau disque de dissection complexes. L'accent est mis sur les techniques de préparation et des conditions particulières pour l'imagerie en direct, bien que toutes les préparations peuvent être utilisées pour l'immunohistochimie tissus fixés.

Vidéo: Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

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Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L&#39;imagerie du développement Drosophile</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imagerie cellulaire en direct d&#39;extrusion de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Préparation individuelle Drosophila Œuf Chambres pour l&#39;imagerie en direct

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Le / GFP-FLP Méthode tomate / FRT pour l&#39;imagerie en direct de mosaïque adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; cellules photoréceptrices

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...