Cette étude est soutenue par le NIH et DC052256 DC006015, et NSF 0324769 au QG et T32-DC008072 à BS.

1. Préparation Cette procédure est la biosécurité de niveau 2, donc toutes les préparations suivantes sont faites dans une hotte Biohazard où la procédure de micro-injection est réalisée. <ol><li> Préparer et préchauffer à 37 ° C à eau: Remplissez un sac de rangement en plastique avec de l&#39;eau - joint et mis sur un bloc de chauffage vidé incubateur. Cela permettra de récupérer les souris après l&#39;injection. </li><li> Remplissez un récipient avec les déchets biologiques dangereux Javel à 10% à un volume adapté à l&#39;immersion de tous les déchets de cette procédure. </li><li> Préparer un petit plat ouverte de 70% d&#39;éthanol et d&#39;un second plat avec ddH2O stérilisés et les placer dans l&#39;enceinte de sécurité biologique. </li><li> Stériliser une capacité 5uL seringue Hamilton avec une aiguille de calibre 33 par pulvérisation bas du corps et de l&#39;aiguille avec de l&#39;éthanol à 70% avec le plongeur a sorti tout le chemin. À plusieurs reprises aspiration d&#39;éthanol à partir du plat et d&#39;éjecter tout le chemin au moins 5 fois. </li><li> Rincer la cartouche seringue en aspirant l&#39;eau stérile et l&#39;éjection d&#39;au moins 5 fois. Placez la seringue en toute sécurité de côté dans le capot de la culture et de lui permettre de sécher. </li><li> Retirer des stocks viraux de -80 stockage ° C et congélateur placer sur la glace pour permettre à la décongélation. Microinjection nécessite 2μL du stock de virus par souris à un titre de 10 9 unités infectieuses / ml. Les lentivirus peuvent être obtenus auprès de sources commerciales ou produites dans le laboratoire selon le protocole établi (Loïs et al., 2002). </li><li> Préparer une étape d&#39;injection qui fournit une zone surélevée au-dessus de la surface du capot - peut utiliser une boîte de culture 10cm recouvert d&#39;une feuille de Kimwipe. </li><li> Organiser des lingettes alcoolisées à proximité de la station d&#39;injection. </li></ol> 2. Microinjection de particules lentiviral dans l&#39;épithélium olfactif Toutes les procédures réalisées sur l&#39;animal dans cette méthode sont faites conformément aux lignes directrices approuvées IACUC. Le Mus musculus souche C57BL/6J est le modèle animal utilisé dans toutes les expériences ont démontré ici. <ol><li> Anesthésier souriceaux par hypothermie en prenant une souris chiot (P0-P3) hors de la cage et mettre le chiot sur un gant de coupe ouverte sur la glace pendant 5 minutes. </li><li> En attendant que le chiot à être entièrement anesthésié, 2μL aspiration du stock viral dans la seringue stérilisée Hamilton. </li><li> Placez la souris chiot au sommet de la phase d&#39;injection. Tirez doucement sur la peau loin du sommet de la tête à l&#39;oreille vers le haut de la nuque. Cela devrait fournir une surface de peau appris au cours de la cavité nasale et la facilité d&#39;injection. </li><li> Insérez l&#39;aiguille à travers la partie supérieure de la cavité nasale environ 3mm en dessous de la surface de la peau pour atteindre l&#39;épithélium olfactif. Microinject 0.5μL de solution virus par coup, en choisissant deux sites de chaque côté, à gauche et à droite (quatre injections au total par la souris = 2μL de virus nécessaire). Les sites d&#39;injection doivent être décalés les uns des autres. Pour cibler des sites d&#39;injection, de rechercher la surface du crâne dorsale pour le contour du bulbe olfactif. Cette ligne est à peine visible à la naissance par la peau semi-translucide et le crâne. Pour faire deux injections par côté, l&#39;objectif d&#39;une injection juste rostrale à un aperçu ampoule à un axe médian. Faire de l&#39;insertion latérale secondes au contour ampoule, assurez-vous encore à l&#39;angle de l&#39;injection médiale afin que vous puissiez atteindre l&#39;épithélium olfactif qui réside ventralement au-dessous de l&#39;ampoule. Éviter de pénétrer le bulbe olfactif! </li><li> Sécher toute solution virale résiduelle ou de sang qui peut s&#39;échapper du site d&#39;injection ou les ouvertures de la narine avec un Kimwipe. Jeter immédiatement Kimwipes dans le récipient eau de javel diluée Biohazard. </li><li> Placez la souris injectées sur le lit à eau incubateur. </li><li> Répétez les étapes 1-4 pour toutes les souris pour être injecté, se souvenant que vous aurez besoin d&#39;environ 2μL du stock de virus par souris. </li><li> Laissez-souris de récupérer sur le matelas d&#39;eau incubateur pendant 30 minutes avant de les retourner dans leur cage de ponte d&#39;origine. </li><li> Disposer de l&#39;étape de micro-injection, lingettes désinfectantes et tous les produits du papier de nettoyage supplémentaire dans l&#39;élimination de Javel risque biologique. </li><li> Nettoyer la seringue Hamilton par aspiration répétée et l&#39;éjection de l&#39;éthanol, puis l&#39;eau comme cela se fait dans les étapes de préparation. Laisser la seringue à sécher. </li><li> Pour une efficacité maximale de transduction répéter cette procédure à nouveau en 4 heures. ARS infectés peuvent être visualisées sur toute la longueur de la cellule en aussi peu que trois jours. </li></ol> 3. L&#39;immunohistochimie de flotter sections bulbe olfactif <ol><li> Sacrifice de la souris injectées au point dans le temps désiré et la perfusion fixer le tissu avec du paraformaldéhyde 4%. Disséquer l&#39;OB. Incuber dans paraformaldéhyde nuit, puis saccharose à 30% en PBS pendant une nuit. Intégrer dans les PTOM sur milieu d&#39;inclusion de la glace sèche. </li><li> Coronales sections OB sont obtenus à un 60μm d&#39;épaisseur en utilisant un cryostat. Balayer sections ampoule dans une boîte de culture 10cm avec 5mL 1x PBS (pH 7,4). Les articles doivent être conservés flottant dans du PBS pour permettre PTOM dissolve. Transfert sections flottantes et PBS dans un flacon de 50 ml conique. </li><li> Autoriser sections pour se déposent au fond du flacon. Vide hors PBS sans aspirer toutes les sections. Rincer les coupes de tissus avec 20 ml de PBS. Répétez les étapes s&#39;installer et passer l&#39;aspirateur. Resuspendre tissus avec 10 mL de PBS et de transfert de sections flottantes dans un flacon de 15 ml conique pour immunocoloration. Une fois les coupes de tissus sont installés, aspirateur hors du PBS surnageant sans déranger les tissus. Sections Resuspendre avec 0,3% de Triton X-100 dans du PBS 1X, pH 7,4 (PBS-Tx) permettant de détergent pour perforer les membranes cellulaires. Incuber 10 minutes à température ambiante. Vide le surnageant et l&#39;incubation répéter avec PBS-Tx deux fois. </li><li> Incuber les coupes de tissus dans 10 ml de solution de blocage (sérum de cheval à 5% dans du PBS-Tx) pendant deux heures à température ambiante. </li><li> Rincer la solution de blocage d&#39;au moins deux fois avec du PBS-Tx de 15 minutes chacune à la température ambiante. </li><li> Préparer 2mL d&#39;une solution d&#39;anticorps primaire dans du PBS-Tx. Voir la section Réactifs et équipements pour les anticorps utilisés dans cette expérience. </li><li> Remplacer seconde PBS-Tx lavez blocage avec une solution d&#39;anticorps primaire. Incuber sur une plate-forme à bascule lentement (~ 30rpm) à 4 ° C pendant 24-48 heures pour assurer une pénétration en profondeur dans les sections 60μm flottant. </li><li> Après incubation, la solution d&#39;anticorps primaires peuvent être récupérées avec soin en utilisant une pipette et conservés à 4 ° C pour les réutiliser jusqu&#39;à deux fois plus dans les deux semaines sans aucune perte significative de l&#39;intensité de la coloration. </li><li> Lavez sections à trois reprises dans du PBS-Tx de 20 minutes chacune à température ambiante avec une légère rotation (~ 30rpm). </li><li> Préparer 2mL de dilution anticorps secondaire dans du PBS-Tx. Aspirer le dernier lavage et ajouter une solution d&#39;anticorps secondaire à des coupes de tissus. Enveloppez l&#39;extérieur du flacon coloration dans du papier aluminium pour bloquer la lumière, qui peut causer photoblanchiment fluorophore. Placez enveloppé flacon sur une plate-forme à bascule lentement et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Jeter la solution d&#39;anticorps secondaire par aspirateur loin. Lavez sections fois avec du PBS-Tx de 20 minutes chacune à la température ambiante. Rincer deux fois supplémentaires avec du PBS (pH 7,4) pendant 20 minutes chacune à la température ambiante. Montez les sections de tissu taché sur des lames de verre à l&#39;aide Fluoromount G. </li><li> Ecran à travers des sections colorées pour les axones OSN positive infectés et Termini axone avec un microscope à fluorescence. </li><li> Pour construire une vue en trois dimensions d&#39;une étiquette axone OSN et le terminal tonnelle, faire une série de sections optiques grâce à la profondeur de la tranche de 60μm tissu cible OB (le long de l&#39;axe z) en utilisant la microscopie confocale. </li><li> Cet empilement de Z-section des images peuvent ensuite être projetées ensemble pour reconstruire une perspective de 360 ​​° de rotation d&#39;un seul axone étiquetés OSN, dont la borne tonnelle en détail dans son intégralité. Toute l&#39;angle d&#39;une rotation unique peut être capturé et exporté comme un fichier image (par exemple JPG, TIFF) pour la présentation format 2D. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Avec les méthodes décrites ici, nous pouvons transduire des neurones sensoriels olfactifs par les lentivirus in vivo. Nous avons jusqu&#39;ici visualisés ARS infectés avec la GFP et les journalistes mCherry fluorescente, aussi bien avec un myc-taggés protéine de fusion via immunocytochimie. Cette technique fournit une abondance d&#39;ARS infectés. Pourtant, la transduction survient sporadiquement suffisante pour fournir ARS étiquetées individuellement, permettant ainsi l&#39;analyse de la morphologie cellulaire unique. Axones et terminaisons axonales sont imagés dans les coupes de tissus au milieu OB leur environnement naturel par microscopie confocale (figure 1). L&#39;ensemble du SVO axone terminal de tonnelle peut généralement être captivé dans une section de 40 50 microns optique. Fort grossissement d&#39;infectés terminaisons axonales OSN permet une analyse détaillée de la morphologie axonale tonnelle à la couche glomérulaire. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figure 1. Trajectoire de simples olfactifs sensoriels axone des neurones et sa tonnelle terminal. A) une coupe coronale du bulbe olfactif de souris P7 montrant la couche nerf olfactif (ONL) immunocolorées pour OMP (rouge) et la couche glomérulaire (GL) immunocolorées avec deux OMP et Vglut2 (gris). Un seul axone des neurones sensoriels olfactifs exprimant la GFP (vert) se déplace au sein de l&#39;ONL et pénètre dans la structure glomérulaire. B) L&#39;axone terminal de la morphologie Arbor dans le glomérule clairement mis en évidence par expression de la GFP. Vglut2 co-coloration en gris illumine la surface totale glomular dans lequel la GFP-positives axone élabore une avor terminal. C) lentiviraux ARS infectées exprimant la GFP (green) pour l&#39;ENP. Le cytostructure de l&#39;épithélium olfactif est montré avec coloration DAPI (bleu). Expression de la GFP permet de visualiser les corps cellulaires OSN et leur processus cellulaires pour l&#39;ENP. D) Un axone OSN et sa morphologie terminal avec l&#39;expression Rap1GAP2 le knock-down par shRNA. Les lentivirus portant une cassette d&#39;expression double avec Rap1GAP2 shRNA sous le promoteur U6 et la souris GFP sous unePromoteur CMV ont été appliqués à l&#39;ENP. Infected terminaisons axonales olfactifs présentaient un terminal plus simplifiée tonnelle par rapport à celle du contrôle GFP seule. Barre = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Ce protocole est bio-sécurité de niveau 2 conforme. Toutes les mesures appropriées espace de travail, la protection personnelle, et virales de confinement des déchets ont été établis en conséquence. Toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées conformément aux directives du IACUC.

Microinjection des résultats lentivirus dans le transfert permanent de constructions de gènes dans l&#39;ADN génomique OSN. Cette approche nous permet d&#39;effectuer des manipulations à court terme ou à long terme de gènes candidats par surexpression ou la médiation shRNA le knock-down. En outre, nous pouvons par fluorescence étiquette ARS unique dans une lignée de souris transgéniques existantes pour observer la co-localisation des populations de récepteurs olfactifs. La microinjection est requis pour la tr...

Microinjection: souriceaux nouveau-nés ont été microinjectés l&#39;aide d&#39;une seringue Hamilton 5uL (Hamilton # 7647-01) munie d&#39;une aiguille de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Réactifs immunocytochimie: les anticorps primaires: GFP anticorps polyclonal de lapin (Molecular Probes # A-6455), l&#39;anticorps polyclonal dirigé contre le poulet OMP (personnalisé) (Chen et al, 2005.), La Guinée cochon anticorps polyclonal contre VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorps secondaire: Cy2 conjugué d&#39;âne anti-lapin (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3 conjugué âne anti-poulet (Jackson Immunolab # 703-165-155) et Cy5-conjugués de chèvre anti-Guinée porc (Jackson Immunolab # 106-175-008). Les sections ont été montées sur des lames de verre avec Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) avec 50ng/mL DAPI chromatine solution de teinture. Imagerie confocale: Z-stack images ont été prises en utilisant un Olympus FV1000 Flouview microscope confocal et d&#39;images collectées et traitées dans les projections en 3D en utilisant Olympus FV10-ASW 2.01 acquisition confocale et des logiciels d&#39;analyse.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Développement d&#39;un circuit précis olfactive repose sur la projection précise de olfactifs sensoriels neurone (SVO) axones vers leurs cibles synaptiques dans le bulbe olfactif (OB). Les mécanismes moléculaires de l&#39;OSN axone de croissance et de ciblage ne sont pas bien comprises. L&#39;expression des gènes Manipulation et après la visualisation des axones OSN unique et leur terminal tonnelle morphologie ont été jusqu&#39;à présent difficile. Pour étudier la fonction des gènes au niveau cellulaire unique dans un délai déterminé, nous avons développé une technique basée lentiviraux de manipuler l&#39;expression des gènes dans les ARS in vivo. Particules Lentivirales sont livrés à ARS par microinjection dans l&#39;épithélium olfactif (EO). Des cassettes d&#39;expression sont alors définitivement intégré dans le génome des ARS transduites. Vert l&#39;expression des protéines fluorescentes identifie ARS infectés et expose leur morphologie entier, y compris la tonnelle axone terminal. Grâce au temps de retournement court entre la micro-injection et la détection journaliste, les études de fonction du gène peut être porté dans un délai très étroite du développement. Avec cette méthode, nous avons détecté expression de la GFP dans aussi peu que trois jours et aussi longtemps que trois mois après l&#39;injection. Nous avons atteint deux sur-expression et de médiation shRNA le knock-down par microinjection lentiviraux. Cette méthode fournit des morphologies détaillées des corps cellulaires et des axones OSN au niveau cellule unique in vivo, et permet ainsi la caractérisation de la fonction de gènes candidats au cours du développement olfactif.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Nous présentons une technique lentiviraux pour la manipulation génétique et la visualisation de simples axone neurone olfactif sensorielle et son arborisation terminale<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

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Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K vues.  University of California, Davis. Nous présentons une technique lentiviraux pour la manipulation génétique et la visualisation de simples axone neurone olfactif sensorielle et son arborisation terminale In vivo.

Vidéo: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.