Ce travail a été soutenu par la compagnie d&#39;assurance vie &quot;Novalis Taitbout-&quot;, l&#39;Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), l&#39;Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; dans le cadre de «ERA-NET NEURON» de programme FP7 de la Commission européenne, «Fondation pour la Recherche Médicale&quot;, la Fondation Letten et de la Fondation Pasteur.

1. Stéréotaxique injections <ol><li> Le virus utilisé dans ces expériences est un vecteur lentiviral réplication déficiente basée sur le virus du VIH à exprimer Channelrhodopsine2-YFP (Yellow Fluorescent Protein) construction de fusion piloté par un promoteur synapsine 6. Le plasmide a été généreusement fourni par K. Deisseroth «groupe de recherche ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Les lentivirus peuvent être obtenus auprès de sources commerciales ou produites dans le laboratoire selon des protocoles établis 7. Les titres ont été vecteur moyen de l&#39;ordre de 10 10 unités de transduction / ml. Aliquotes virale sont stockés à -80 ° C et doivent être décongelés juste avant le chargement de la pipette. Plusieurs cycles gel / dégel doivent être évités. Jamais l&#39;exposition de la solution de virus directement à la glace sèche. </li><li> Préparer les pipettes en verre à l&#39;aide de verre borosilicate capillaires sur le standard pipette extracteur (Sutter P-97 Pipette extracteur). Le réglage en tirant doit être correctement étalonnés pour donner une pipette de long et rigide. Ensuite, coupez l&#39;extrémité de la pipette à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux pour obtenir un pourboire de 30 à 40 um de diamètre. Boutique tiré des pipettes dans une boîte sans poussière. </li><li> Configuration du Nanoject II microinjecteur aux instructions du fabricant pour la livraison de 50 nL. Préparer la pipette d&#39;injection par l&#39;arrière-remplissage avec de l&#39;huile minérale et l&#39;insérer dans le plongeur microinjecteur. Fixez le microinjecteur sur un cadre stéréotaxique. L&#39;huile partiellement vides de la pipette en verre avant de le remplir avec la solution de virus </li><li> Avec une micropipette, transfert de 2 pi de solution de virus sur un morceau de parafilm stérile. Abaissez délicatement la pipette en verre dans la goutte de solution de virus et de remplir la pipette avec 1-2 pi. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles d&#39;air dans la pipette. </li><li> Anesthetize une souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine, dilué dans une solution saline stérile. Retirez les cheveux du cuir chevelu de l&#39;animaux en utilisant des rongeurs tondeuses, rasoirs, ciseaux, ou de l&#39;agent depilitory chimiques. Désinfecter le cuir chevelu avec trois applications de l&#39;alternance 70% d&#39;éthanol et de la bétadine. Tous les instruments chirurgicaux doivent également être autoclavé puis désinfectée avec de l&#39;éthanol à 70%. Placez l&#39;animal dans le cadre stéréotaxique avec des barres d&#39;oreilles et d&#39;un bar nez, assurant que la tête est sécurisé. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée. </li><li> Avec un scalpel, découper le cuir chevelu d&#39;entre les yeux entre les oreilles. Tirez la peau de côté pour exposer le crâne et la peau d&#39;ancrage avec une paire de pinces. Nettoyer la surface du crâne. L&#39;appareil stéréotaxique est remis à zéro avec la pointe de la pipette en verre au bregma. Puis la pointe est positionnée au site d&#39;injection (antéro-postérieur, 3,30; médio-latérale, ± 0,82, pour les deux hémisphères droit et gauche, respectivement). La position de la barre de nez doit être ajustée selon le calcul des coordonnées stéréotaxiques. Dans notre expérience, la barre de nez est ajustée uusqu&#39;à bregma et le site d&#39;injection sont alignés à la même hauteur. </li><li> Identifier le site d&#39;injection. Utiliser une perceuse haute vitesse chirurgicaux, soin de percer des trous dans le crâne. Avec une aiguille de seringue plié accroché à la pointe, retirez les restes d&#39;os minces pour exposer la dure-mère. Vérifiez que le trou est centré à la position correcte. Prenez soin de ne pas rompre les vaisseaux sanguins sur la surface du cerveau pendant le forage. Si les vaisseaux sanguins se rompent, appuyez doucement sur la surface du cerveau avec un coton-tige ou un tissu de petites pendant plusieurs secondes jusqu&#39;à ce flux de sang s&#39;arrête. </li><li> Basse de la pipette et le zéro de la hauteur dorso-ventrale lorsque l&#39;extrémité de la pipette touche la surface du cerveau. Puis, inférieure à la profondeur correcte dorso-ventrale (dorso-ventral, 2,9 de la surface du cerveau) et attendre 30 secondes pour que l&#39;équilibre de pression. Injecter 4 fois 50 nl de virus pour un total de 200 nl. Attendre 30 secondes entre chaque injection. </li><li> Une minute après la dernière injection, retirer lentement le tuyauTTE. Répétez les points 01.06 à 01.08 pour l&#39;autre hémisphère. Retirer l&#39;animal de appareil stéréotaxique, nettoyer l&#39;incision et coudre la peau coupés à l&#39;aide fils chirurgicaux. Permettre à l&#39;animal de retrouver sur le pavé réchauffement avant de revenir à la cage. En outre, les animaux peuvent être donnés un non-stéroïdiens anti-inflammatoires analgésiques (par exemple, carprofène 4mg/kg) immédiatement après et 3 jours après la chirurgie. </li></ol> 2. Chronique d&#39;implantation de LED pour la stimulation optogénétique vivo dans le bulbe olfactif <ol><li> Animaux injectés avec des particules lentiviraux bilatérale sont la prochaine chronique implantés avec une LED bleue en miniature (Osram, LED CMS 4,6 W en bleu). Soudez les broches de LED à un connecteur électrique femelle miniature, de sorte que le connecteur est placé sur le côté opposé de la LED. Vérifiez qu&#39;il n&#39;y ait pas coupé court-circuit et d&#39;identifier les pôles positifs et négatifs sur le connecteur. Test de la LED en le connectant à un régulateur de courant pour les LED si un câble adéquat. </li><li> Pour mesurer et / ou définir la puissance lumineuse de la LED absolue, montez la LED sur un micromanipulateur et la position de la LED en contact direct avec le photodétecteur d&#39;un mesureur de puissance d&#39;une intensité lumineuse maximale à 470 nm. Percez un trou d&#39;épingle de 3 mm de diamètre dans un conseil en PVC opaque. Apposez ce trou d&#39;épingle pour le wattmètre et de construire une courbe standard de puissance optique par rapport courant d&#39;entrée pour calculer la puissance par mm 2. </li><li> Pour mesurer la propagation de la lumière à travers le cerveau, couper des blocs de tissu cérébral frais de 300, 500, 1000, 1500 et 2500 micron d&#39;épaisseur de 0-4 ° C en utilisant un ACSF 14 vibratome. Placez un morceau de crâne avec une craniotomie identique à celle réalisée chez la souris vivent sous la LED. Tout d&#39;abord, de mesurer la puissance lumineuse sans tissu centrée sur le DEL. Ensuite, placez chaque bloc de tissu entre le LED et le photodétecteur du compteur d&#39;électricité, et de mesurer la puissance. Construire une courbe de l&#39;épaisseur du tissu par rapport fraction de transmission relative, calculée comme le rapportentre la puissance mesurée à travers les tissus et sans tissus. </li><li> Anesthetize une souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine, dilué dans une solution saline stérile. Nettoyez et désinfectez la LED avec 70% d&#39;éthanol. Retirez les cheveux du cuir chevelu de l&#39;animal et de désinfecter le cuir chevelu avec trois applications de l&#39;alternance 70% d&#39;éthanol et de la bétadine. Ensuite, placez l&#39;animal dans le cadre stéréotaxique. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée. Fixez le connecteur à un titulaire de stéréotaxie. La position de la barre de nez doit être ajusté jusqu&#39;à ce que la surface du crâne au-dessus du bulbe olfactif est parfaitement horizontal et parallèle à la surface de la miniature à LED. </li><li> Avec un scalpel, découper le cuir chevelu à partir de 3 mm en avant pour les yeux à 3 mm en arrière des oreilles. Tirez la peau de côté et de l&#39;ancrer avec une paire de pinces. Grattez les membranes à la surface du crâne à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir. Nettoyez et séchez le crâne. Appliquez une mince couverture de colle cyanoacrylate pour permettre ad ultérieurescohésion de l&#39;acrylique dentaire. </li><li> Utiliser une perceuse haute vitesse chirurgicale, effectuer une craniotomie rectangulaires (1 mm et 3 mm caudale latérale; centrée sur 5,1 mm caudale, 0 mm latéral du bregma) au cours des bulbes olfactifs. Pour ce faire, soigneusement fine du crâne jusqu&#39;à ce qu&#39;une fine couche de restes osseux. Retirer délicatement l&#39;os restant avec l&#39;aide d&#39;une aiguille de seringue plié. Des précautions particulières doivent être prises pour éviter la perforation de la dure-mère et de la rupture des vaisseaux sanguins principaux qui se situent entre les deux hémisphères et dans le bord caudal du bulbe olfactif. L&#39;accumulation de sang et de coagulation à la surface du cerveau empêche la pénétration optimale de la lumière dans le tissu. Rincer la craniotomie et la surface du cerveau avec une solution saline stérile et sécher ensuite le crâne. </li><li> Fixez la miniature à LED sur le connecteur. Abaissez la miniature à LED sur le dessus des bulbes olfactifs. L&#39;axe principal de la miniature à LED doit être parallèle à l&#39;axe rostrale-caudale de la souris, nettoyer avec une solution saline stérile et dry le crâne. Fixez ensuite la LED sur le crâne avec une première couche d&#39;acrylique (c&#39;est à dire, le ciment polycarboxylate), suivie par une deuxième couche d&#39;acrylique dentaire. L&#39;ajout de deux petites vis peut être nécessaire de fixer la LED. Les vis doivent être insérés sur le crâne (postérieure à la position LED) et couvert à la fois avec l&#39;acrylique. Alors que l&#39;acrylique est encore liquide, replier et coller les bords libres du cuir chevelu sur la surface de l&#39;acrylique dentaire. Prenez soin de ne pas appliquer l&#39;acrylique sur le connecteur. Après l&#39;acrylique a durci, enlever l&#39;animal de appareil stéréotaxique et le laisser récupérer sur un pad réchauffement avant de revenir à la cage. Les animaux sont laissés isolés dans leur cage pour récupérer de la chirurgie pour au moins sept jours. En outre, les animaux peuvent être donnés un non-stéroïdiens anti-inflammatoires analgésiques (par exemple, carprofène 4mg/kg) immédiatement après et 3 jours après la chirurgie. LED doit être testé avant l&#39;implantation et après la fin des expériences. </li><li> Une lumière éleccal câble est utilisé pour attacher l&#39;animal à un régulateur de courant pour LED couplée à un générateur d&#39;impulsions (Master-8) pour contrôler le moment et l&#39;intensité de la LED. Le câble mince permet une totale liberté de mouvement. Prenez soin de respecter la polarité du connecteur. Inversion de la polarité peut casser la LED. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: CHR2-YFP est exprimée dans les neurones transduites environ 48 heures après l&#39;injection, et reste stable pendant plusieurs mois 7. La figure 1 est une image représentative d&#39;une coupe sagittale d&#39;un animal de paraformaldéhyde-fixe de 15 jours après l&#39;injection. Notez l&#39;étiquetage dense et la taille du site d&#39;injection dans le RMS. Un grand nombre de cellules-nés ont migré le long de la RMS pour coloniser les différentes couches du bulbe olfactif (fig. 1). La protéine de fusion est exprimée dans tous les compartiments de neurones, dont le soma, les dendrites et des épines. Miniature à LED impla<html> ntation permet à grande échelle et peu coûteux stimulation optique d&#39;une vaste région d&#39;intérêt. L&#39;animal est attaché au contrôleur LED avec un câble de lumière électrique qui permet une totale liberté de mouvement. En caractérisant la diffusion de la lumière dans le tissu cérébral et le seuil d&#39;activation CHR2, nous estimons que l&#39;activation optique pourrait être déclenchée à une profondeur de ~ 2mm en dessous de la surface de la diode (figure 2A). Pour surveiller l&#39;activation fonctionnelle de CHR2-neurones exprimant in vivo, l&#39;expression de c-fos, un marqueur de l&#39;activité neuronale, peuvent être analysées après stimulation lumineuse répétitives (figure 2B). Comme alternative, dans les enregistrements électrophysiologiques in vitro des neurones exprimant CHR2-couplée à une stimulation lumineuse focale peut être effectuée 14. Enfin, à deux photons ciblées lâche-patch enregistrements ont été utilisés pour étudier l&#39;activation fonctionnelle de CHR2-exprimant les neurones corticaux par des miniatures semblables LED in vivo 9. ntent &quot;&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> Figure 1. CHR2-YFP l&#39;expression de l&#39;injection lentiviral dans le flux migratoire rostrale. Représentant images confocale d&#39;une des sections sagittales du bulbe olfactif de souris 15 jours après les injections d&#39;un lentivirus dans la rostrale RMS. Notez la présence de nouveaux neurones dispersés YFP migration depuis la fin de la RMS pour les différentes couches de l&#39;OB. La plupart des cellules-nés (95%) sont des cellules granulaires, qui se trouvent soma dans la couche de cellules granulaires (GCL) et des dendrites s&#39;arborisent dans la couche externe plexiformes (EPL). Une petite population de nouveaux neurones migrent jusqu&#39;à la couche la plus superficielle de l&#39;OB, dans la couche glomérulaire (GL). La barre d&#39;échelle, 100 microns. En médaillon, fort grossissement d&#39;une cellule de granules nouveau-né, montrant l&#39;expression membranaire de CHR2-YFP dans les dendrites ainsi que dans les épines. La barre d&#39;échelle, 20μm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; Figure 2. Schéma d&#39;implantation LED sur le dessus du bulbe olfactif et de lumière évoque l&#39;expression de c-fos dans CHR2-YFP cellules exprimant des granules de nouvelles. A, Schéma de la LED implanté au-dessus des bulbes olfactifs. B, représentant des images montrant confocale doublement marquée CHR2-YFP + c-fos cellules granulaires + une heure après la stimulation lumineuse du bulbe olfactif. C-fos expression est révélé en utilisant un anticorps de lapin anti-c-fos anticorps primaire (Calbiochem, 1:5000) et A568-anti-lapin conjugué anticorps secondaire (Invitrogen, 1:1000). La barre d&#39;échelle, 10 microns.

<ol>
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Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. 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Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Des outils optogénétique ont récemment augmenté notre contrôle sur sélective populations neuronales, y compris les adultes neurones né dans le système olfactif. Nous décrivons ici comment effectuer une injection stéréotaxique d&#39;un vecteur lentiviral exprimant CHR2-YFP dans une population spécifique de neurones adultes-né. En surveillant la période post-injection, nous sommes capables d&#39;analyser et de manipuler l&#39;activité d&#39;une cohorte d&#39;adultes-né des neurones avec un âge relatif hom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériel </td><td> Société </td><td> No de catalogue </td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0,2% </td></tr><tr><td> Pipeter Puller </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Capillaires en verre (3,5 &quot;) </td><td> Drummond scientifique </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II microinjecteur </td><td> Drummond scientifique </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Forage à grande vitesse chirurgicale </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Percer Micro acier de diamètre 0,7 mm pointe de bavures </td><td> Outils Fine Science </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED CMS bleue 4,6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Femme connecteur électrique (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Régulateur de courant pour les LED (maxi: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Le générateur d&#39;impulsions </td><td> AMPI </td><td> Maître-8 </td></tr><tr><td> Mesureur de puissance optique </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Colle cyanoacrylate </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Ciment polycarboxylate (première couche de ciment) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Méthacrylate de ciment (ciment deuxième couche) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Trad - Liquid (# 339292) Unifast Trad - Poudre (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofène </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Interneurones locaux sont continuellement régénéré dans le bulbe olfactif des rongeurs adultes 1-3. Dans ce processus, appelé neurogenèse adulte, les cellules souches neurales dans les murs du ventricule latéral donner lieu à des neuroblastes qui migrent pour plusieurs millimètres le long du ruisseau rostrale migrateurs (RMS) à atteindre et à intégrer dans le bulbe olfactif. Pour étudier les différentes étapes et l&#39;impact de l&#39;intégration des neurones adultes nés dans les circuits préexistants olfactif, il est nécessaire de manière sélective l&#39;étiquette et de manipuler l&#39;activité de cette population spécifique de neurones. Le développement récent des technologies de l&#39;optogénétique offre la possibilité d&#39;utiliser la lumière pour activer précisément cette cohorte spécifique de neurones sans affecter les neurones entourant 4,5. Ici, nous présentons une série de procédures visant à exprimer de manière virale Channelrhodopsin2 (CHR2)-YFP dans une cohorte temporellement limitée des neuroblastes dans le RMS avant qu&#39;ils atteignent le bulbe olfactif et devenir adulte-né neurons. De plus, nous montrons comment l&#39;implant et calibrer une miniature à LED pour les maladies chroniques dans la stimulation in vivo de neurones exprimant CHR2-.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l&#39;aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l&#39;injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K vues.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l'aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l'injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Etudier l&#39;intégration des adultes-né Neurones

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Recherche

Neurosciences

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibre optique d&#39;implantation pour la stimulation chronique optogenetic de tissu cérébral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimulation optogenetic de comportement de fuite en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimulation optogenetic du nerf auditif

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...