Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH 1R21AG031965-01A1. MK est une Ellison Medical Foundation New Scholar liés au vieillissement.

Partie 1: Préparation des cultures de vieillissement <ol><li> Streak souches d&#39;intérêt des stocks congelés sur des plaques de gélose YEPD (extrait de levure 1%, 2% de bacto-peptone, 2% d&#39;agar, 2% de glucose). </li><li> Incuber les cellules à 30 ˚ C pendant 48 heures ou jusqu&#39;à ce que des colonies isolées apparaissent. </li><li> Prélever des colonies unique et inoculer dans 5 ml de milieu liquide YEPD (extrait de levure 1%, 2% de bacto-peptone, 2% de glucose) dans des tubes à essai. </li><li> Cultivez des cultures nuit à 30 ˚ C, tout en maintenant une agitation constante en utilisant soit un shaker ou à tambour à rouleaux. </li><li> Inoculer 5 ml de synthèse complet (SC) moyen (Tableau 1) avec 50 uL de la culture de la nuit. Généralement trois cultures SC sont préparés pour chaque souche de fournir réplication triple biologiques de l&#39;analyse de la durée de vie pour chaque souche à l&#39;étude. </li><li> Maintenir les cultures à 30 ˚ C avec agitation constante sur un tambour à rouleaux pour toute l&#39;expérience (en général 2 semaines ou plus). </li></ol> Partie 2: Prendre une viabilité à l&#39;âge points Après deux jours de culture dans les médias SC, les cellules doivent être en phase stationnaire et le premier point de l&#39;âge est prêt à prendre. Après l&#39;âge de points doivent être pris tous les 2-3 jours pour un minimum de deux semaines. Pour chaque point de l&#39;âge: <ol><li> Préparer le Bioscreen 100 des plaques en nid d&#39;abeille pour l&#39;inoculation en remplissant chaque puits avec 145 ul de YEPD. Soyez sûr de laisser au moins un bien rempli avec seulement YEPD et non des cellules pour une analyse ultérieure des données. </li><li> Retirez les cultures du vieillissement de l&#39;incubateur. </li><li> Brièvement au vortex la première culture à être inoculés dans la plaque en nid d&#39;abeille, tout en faisant attention à ne pas répandre de la culture. </li><li> Retirer 5 pi de la culture mixte et il pipette dans le premier puits de la plaque en nid d&#39;abeille. Flamme de l&#39;embouchure de chaque tube à essai, avant et après le retrait du aliquote de 5 ul. </li><li> Répétez cette procédure pour chaque culture de vieillissement en étant sûr de noter la position bien correspondant à chaque culture. Identique positions bien doit être utilisé pour chaque période d&#39;âge tout au long point de toute l&#39;expérience. </li><li> Remplacer les cultures dans l&#39;incubateur à 30 ˚ C lorsque vous avez terminé avec les inoculations. </li></ol> Partie 3: Chargement du Bioscreen C MBR machines <ol><li> Exposer le compartiment incubateur en soulevant le couvercle et retirez le couvercle sur le plateau de l&#39;échantillon. </li><li> Insérez la plaque nouvellement ensemencé Honeycomb dans le bac de l&#39;échantillon (utiliser l&#39;emplacement de gauche si vous êtes la seule lecture une plaque). </li><li> Remettre le couvercle sur le plateau de l&#39;échantillon et abaisser le couvercle du compartiment incubateur. </li><li> Assurez-vous que le fluide caloporteur est au-dessus du niveau de remplissage minimum. Si elle est basse, ajouter plus de 1000 en utilisant une pipette uL avec le fluide caloporteur fourni. </li><li> Utilisation du logiciel Bioscreen &quot;EZExperiment&quot;, définir les paramètres suivants pour obtenir des courbes de croissance approprié pour Saccharomyces cerevisiae: <ul><li> Nombre d&#39;échantillons: Entrez le nombre de puits avec des médias ou 200 </li><li> Filtre: 420-580nm, Wideband </li><li> Température: 30 ˚ C </li><li> Longueur Expérience: 1 Jour, 0 heures, 0 secondes </li><li> Intervalle de mesure: 30 minutes </li><li> Secouer: Sur, agitation continue, haute </li></ul></li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer&quot; pour commencer les lectures. </li></ol> Partie 4: Analyse des données Typiquement, six ans-points sont pris au cours de deux semaines. Les points à l&#39;âge sont prises au jour 2, 4, 6, 9, 11 et 13. Selon la conception expérimentale et les souches testées, il peut être souhaitable de prendre des points à l&#39;âge plus ou moins fréquemment ou pendant plus de deux semaines. Il est important de charger la plaque en nid d&#39;abeilles dans le même ordre pour chaque âge un tel point que chaque culture le vieillissement correspond à la même position et à tout âge-là, car cela fera l&#39;analyse de données beaucoup plus facile. <ol><li> Obtenir les fichiers de sortie de la machine Bioscreen C MBR. Le logiciel &quot;EZExperiment&quot; va afficher les données dans un fichier Bioscreen délimité par des tabulations qui est compatible avec Microsoft Excel ainsi que d&#39;autres logiciels. La première colonne indique à quel moment la mesure OD a été prise pendant l&#39;expérience, avec des colonnes suivantes représentent chaque puits dans les plaques en nid d&#39;abeille Bioscreen (figure 1). </li><li> Supprimer la première lecture OD de chaque colonne. Cette lecture est un «bruit». </li><li> Normaliser les données en soustrayant la valeur de DO du puits avec YEPD seul de toutes les valeurs OD dans chaque colonne. Cela supprime l&#39;absorbance de fond par les médias. </li><li> Tracer les courbes excroissance. Les courbes se déplacera en fonction de l&#39;âge (figure 2). Par exemple, en traçant les courbes excroissance de la colonne 1 (puits 1 de la plaque en nid d&#39;abeille) sur les six points du temps, il ya un déplacement vers la droite distinctes des courbes au cours du temps. </li><li> Calculer le temps de doublement (δ) pour chaque puits basée sur la cinétique de croissance de l&#39;âge de 2 jours-point. L&#39;équation utilisée pour calculer le temps de doublement is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Équation" /> où OD 1 et OD 2 mesures successives représentent DO et T 1 et T 2 étant le temps entre les mesures. Calculer des temps de doublement seulement entre les valeurs de DO de 0,2 à 0,5. La moyenne de ces valeurs est le temps de doublement de ce bien. Calculer des temps de doublement seulement entre les valeurs de DO de 0,2 à 0,5. La moyenne de ces valeurs est le temps de doublement de ce bien. La plupart des souches de levures de type sauvage doit donner une valeur temps de doublement compris entre 85 à 90 minutes. </li><li> Pour chaque âge-point, calculer le décalage de temps (At) dans les courbes excroissance par rapport à l&#39;âge de départ-point (jour 2). Un moyen facile de le faire est de déterminer la différence dans la longueur du temps qu&#39;il a fallu pour chaque puits pour atteindre une DO de 0,3 entre les initiales d&#39;âge et chaque point de l&#39;âge subséquentes points. Le temps qu&#39;une particulière ainsi atteint une DO de 0,3 peut être calculée à partir de l&#39;équation de régression linéaire correspondant à ln (DO) en fonction du temps entre les deux points de bracketing temps DO = 0,3. </li><li> Calculer la fraction survivante à chaque âge-point afin de générer une courbe de survie (figure 3). Définir le point de départ à l&#39;âge (jour 2) à la viabilité de 100%. Pour chaque âge successifs point de calculer la survie pour cent en utilisant l&#39;équation: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="Deuxième équation" width="245" height="115" /> où s n est le pourcentage de survie, At n est le décalage dans le temps, et δ n est le temps de doublement. </li><li> Générer les courbes de survie (figure 3B) comme souhaité pour chaque bien (ou puits répliquer) en traçant la fraction (ou pour cent) de cellules viables en fonction de l&#39;âge. </li><li> Calculer la survie (SI) solidaire de chaque puits. SI est définie comme l&#39;aire sous la courbe de survie et peut être estimée par la formule: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Équation 3" width="400" height="79" /> l&#39;âge où n est le point de l&#39;âge (par exemple 2, 4, 6, 9, 11 et 13) et s n est la valeur de survie à cet âge-point. </li><li> Déterminer des paramètres statistiques des puits de reproduire à partir des données du SI et de survie. Commune paramètres statistiques d&#39;intérêt comprennent moyenne, médiane, et la variance pour chaque ensemble de biologiques répétitions. Un t-test ou une analyse similaire peut être utilisée pour la comparaison par paires des SI à des fins expérimentales et différents groupes de contrôle. Il peut être également souhaitable de générer des courbes de survie, comme décrit dans 4.8 de moyenne biologiques répétitions. </li></ol> Partie 5: Les résultats représentatifs À la fin de l&#39;expérience, vous aurez tracé la courbe de survie et effectué une analyse de données suffisantes pour déterminer le potentiel de vieillissement chronologique des différentes souches ou des conditions. Si effectué correctement, les courbes de croissance obtenus à partir de la machine Bioscreen C MBR devrait ressembler à ceux de la figure 2 et les courbes de survie résultant devrait ressembler à ceux de la figure 3. Généralement, les cellules de type sauvage cultivées dans les conditions décrites ici aura une durée médiane de la vie chronologique de l&#39;ordre de 7 jours. Variation importante du taux de survie est observée dans différentes souches et sous certaines conditions, telles que la croissance dans les médias de glucose 0,05%, la médiane de survie peut dépasser 30 jours. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Figure 1. Sortie des données du programme &quot;EZExperiment&quot; Bioscreen. Colonne A affiche l&#39;heure à laquelle une lecture de l&#39;absorbance a été prise. Colonnes successives représentent les puits de la plaque en nid d&#39;abeille inoculées avec des cellules prélevées à partir des cultures de vieillissement. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Figure 2. Courbes Excroissance d&#39;une réplique biologique unique au cours d&#39;une expérience. Il ya une nette évolution dans les courbes au fil du temps que les cellules dans la culture du vieillissement perdent leur viabilité. La longueur de temps entre le point de temps initial (jour 2) et un point de temps successifs détermine la viabilité à cet âge en particulier. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Figure 3. A) Une courbe de survie en utilisant les données générées excroissance de la figure 1. Le point 2 est temps de jour défini comme le point de la viabilité de 100%. B) Les courbes de survie final de deux souches testées dans l&#39;expérience même. Ces courbes de survie représentent les viabilités moyenne de trois répétitions pour chaque biologiques souche. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type au sein biologiques répétitions. La zone hachurée sous la courbe de survie représente la survie (SI) pour la souche intégrante 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tableau 1. Synthétique milieu défini Utilisé pour des études de vieillissement chronologique (souche backgrouND BY4743) </td></tr><tr><td> Composante </td><td> Concentration (g / L) </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Base azotée de levure (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> Adénine </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-arginine </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Acide L-aspartique </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-acide glutamique </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-histidine </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-Lysine </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Méthionine </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-phénylalanine </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-sérine </td><td> 0,375 </td></tr><tr><td> L-Thréonine </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-tryptophane </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> La L-Tyrosine </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Valine </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> Note: Cette recette représente auxotrophies dans diploïde BY4743 souche. Auxotrophies acides aminés doit être compensée par l&#39;ajout d&#39;une concentration 5X final au milieu synthétique complet.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

Le test à haut débit chronologique la durée de vie décrit ici est une méthode efficace pour quantifier le potentiel de vieillissement d&#39;un grand nombre de souches avec une grande précision et de précision. L&#39;avance principal de cette méthode par rapport aux méthodes classiques pour déterminer la survie en comptant unités formant colonie (voir par exemple 3) est l&#39;utilisation d&#39;un dispositif de lecture secoueur / incubateur / plaque telles que la machine Bioscreen C MBR afin d&#39;ob...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

La levure bourgeonnante<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; S&#39;est avérée être un organisme modèle important dans le domaine de la recherche sur le vieillissement<sup&gt; 1</sup&gt;. La durée de vie réplicative et chronologique, sont deux paradigmes établis utilisés pour étudier le vieillissement chez la levure. Le vieillissement réplicative est définie comme le nombre de cellules filles une cellule de levure unique mère produit avant la sénescence, le vieillissement chronologique est définie par la longueur des cellules de temps peut survivre dans un non-séparation, la quiescence-état<sup&gt; 2</sup&gt;. Nous avons développé une méthode à haut débit pour la mesure quantitative de la durée de vie chronologique. Cette méthode implique le vieillissement des cellules dans un milieu défini sous agitation et à température constante. À chaque âge-point, une sous-population de cellules est retiré de la culture du vieillissement et inoculé dans un milieu de croissance riche. Une courbe de croissance à haute résolution est alors obtenue pour cette sous-population de cellules âgées utilisant un Bioscreen C MBR machine. Un algorithme est ensuite appliqué pour déterminer la proportion relative de cellules viables dans chaque sous-population basée sur la cinétique de croissance à chaque âge-point. Cette méthode exige beaucoup moins de temps et de ressources par rapport aux autres tests chronologiques durée de vie tout en préservant la reproductibilité et la précision. La nature à haut débit de ce test devrait permettre de grands écrans génétiques et chimiques pour identifier les modificateurs de longévité roman pour des tests supplémentaires dans les organismes plus complexes.

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Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Vieillissement chronologique dans la levure se réfère à la perte de la viabilité cellulaire associée avec le temps dans la phase stationnaire. Nous décrivons ici une méthode à haut débit pour déterminer quantitativement la durée de vie de la levure chronologique.

Quantifier Life Span levure chronologique par excroissance de cellules âgées

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K vues.  University of Washington. Vieillissement chronologique dans la levure se réfère à la perte de la viabilité cellulaire associée avec le temps dans la phase stationnaire. Nous décrivons ici une méthode à haut débit pour déterminer quantitativement la durée de vie de la levure chronologique.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Une technique rapide pour la visualisation de Live cellules de levure immobilisées

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Recherche

Biologie

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> sur des milieux solides

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purification des mitochondries de cellules de levure

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> à 96 plaques de microtitration bien

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Quantification temporelle d&#39;expression MAPK induite en simples cellules de levure

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.