Ce travail a été financé en partie par la subvention R00AG031911 de l&#39;Institut national sur le vieillissement des Instituts nationaux de la santé pour PHM Le contenu de cet article ne reflètent pas nécessairement la position officielle de la National Institutes of Health.

1 Préparation des milieux et solutions <ol><li> Cultiver des cellules à l&#39;aide de l&#39;extrait de levure-peptone-glucose (YPD) de milieu riche pour le protocole standard. Préparer une Bacto-peptone à 2%, 1% d&#39;extrait de levure, une solution de glucose à 2% de milieu YPD et ajouter Bacto-agar à 2% de milieu solide 19. Autoclave pour stériliser. Utiliser un autre milieu, si nécessaire, pour tester une condition particulière de croissance ou de la souche de levure mutante. </li><li> Faites un milieu complet synthétique solide manque arginine 60 mg / L canavanine (SC-arg + canavanine) pour sélectionner pour canavanine mutants résistants. Préparer une solution qui est de 0,67% bacto-base azotée de levure sans acides aminés, 2% de glucose, mélange de supplément complet de 0,2% sans l&#39;arginine (abandon mix), et 2% bacto-agar 19. Autoclave et refroidir avant d&#39;ajouter d&#39;un canavanine / ml solution stock de 20 mg (stérilisée par filtration, stockée à 4 ° C) 19. <ol><li> Faites un milieu complet synthétique solide contenant de l&#39;acide 5-fluoro-(5-FOA). Préparer 500ml d&#39;une solution 1,34% de Bacto-base azotée de levure sans acides aminés, glucose 4%, mélange de complément complet de 0,4%, et 0,2% de 5-FOA et stériliser par filtration 19. Autoclave de 500 ml d&#39;une solution de bacto-agar à 4%, brièvement refroidir, puis mélanger avec la solution nutritive stérilisée par filtration de 500 ml. Utiliser les médias alternative appropriée pour d&#39;autres essais de mutation. </li></ol></li><li> Pour le marquage à la biotine, faire 500 ml 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) contenant du chlorure 137 mM de sodium, 2,7 mM de chlorure de potassium, 10,14 mM de phosphate de sodium dibasique, et 1,77 mM de phosphate de potassium dibasique, pH 8 Conserver à 4 ° C et continuer glace pendant l&#39;utilisation. </li><li> Prenez un nouveau 5 mM biotine actions dans de l&#39;eau ultra-pure stérile. </li><li> Pour étancher marquage à la biotine, faire 500 ml de PBS 1x, glycine 100 mM. Stocker à 4 ° C et garder sur la glace pendant l&#39;utilisation. </li><li> En fonction du nombre de cellules utilisées et de la durée de l&#39;expérience, faire 1-2 L de tampon de marquage contenant bourrelet PBS 1x, 2 mM EDTA, 0,5% Bovialbumine sérique ne. Stériliser par filtration et le tampon de gaz. Stocker à 4 ° C et garder sur la glace pendant l&#39;utilisation. </li><li> Préparer une solution à 0,4% de bleu trypan dans PBS 1x, stériliser par filtration, et conserver à la température ambiante pour une utilisation dans des mesures de viabilité cellulaire. </li><li> Aliquotes de petits volumes (~ 100 pi) d&#39;une agglutinine de germe de blé (WGA) conjugué fluorescent de stocker à -20 ° C dans du papier enroulé (ou opaque) microtubes pour une utilisation dans la détermination de l&#39;âge de la cellule. </li></ol> 2 Détermination de mutation taux et la fréquence <ol><li> Établir un taux de mutation de base par la génération de cellule en utilisant des tests de fluctuation pour les cellules cultivées dans des conditions de culture standard. Cultiver sept à onze répliquent cultures de 1 ml à partir d&#39;une densité initiale de 1.000-5.000 cellules / ml au début de la phase stationnaire (~ 10 8 cellules / ml). <ol><li> Pour chaque culture répliqué, diluer les cellules 1: 2000 et répandre 1-4 pi sur un milieu non sélectif (YPD) pour déterminer formant colonie unités / ml. Culot restant cellules à ~ 2400 xg pendant 1 min dans une microcentrifugeuse et remettre en suspension dans 100 ul d&#39;eau étalé sur un milieu sélectif pour identifier des mutants. Incuber les plaques pendant trois jours à 30 ° C avant de comptage des colonies (ajuster le temps d&#39;incubation nécessaire en fonction du taux de cellules de croissance). </li><li> Déterminer le nombre de mutations indépendantes (m) qui ont eu lieu dans le procès sur la base du nombre de colonies mutantes (r) obtenus sur un milieu sélectif. Utilisez l&#39;estimateur médian Lea-Coulson à trouver m en remplaçant le nombre médian de colonies mutantes pour r dans la formule ci-dessous 9. Puis, pour remplacer des valeurs m jusqu&#39;à ce que le côté gauche de l&#39;équation est quasiment nul. <img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> Pour déterminer le taux de mutation, d&#39;abord calculer le nombre moyen de cellules viables, réparties sur un milieu sélectif en multipliant la moyenne formant colonie unités / ml des cultures répliquées et le volumede la culture dans la propagation ml sur un milieu sélectif. Diviser la valeur de m à l&#39;étape 2.1.2 par ce nombre moyen de cellules viables pour obtenir le taux de mutation par génération cellulaire. </li></ol></li><li> Calculer individuellement le nombre de cellules viables répartis sur un milieu sélectif pour chaque culture répliqué dans un essai tel que décrit à l&#39;étape 2.1.3. Diviser le nombre de colonies mutantes (r) obtenues pour une culture par le nombre de cellules viables répartis sur un milieu sélectif pour obtenir la fréquence de la mutation. Utilisation de la moyenne ou de la médiane des fréquences individuelles de mutation de la culture dans l&#39;étape de rééchantillonnage de 2,1 en tant que fréquence de mutation de base. </li><li> Faire des mesures de fréquence avant et après que les cellules de l&#39;étiquetage de la biotine (étapes 3.2 et 3.4) pour déterminer si les résultats de l&#39;étape d&#39;étiquetage dans tout changement dans la fréquence des mutations qui devront être pris en considération lors de l&#39;essai des changements selon l&#39;âge de l&#39;accumulation de mutations. </li></ol> 3. biotine étiquetage <ol><li> Streak S. cerevisiae à partir d&#39;un stock de glycérol à -80 ° C sur un milieu YPD et incuber à 30 ° C pendant 1-3 jours. </li><li> En utilisant une pointe de pipette stérile, les cellules de transfert de la plaque de série de 1 ml (ou plus) de la tenue de l&#39;eau à l&#39;esprit que de 1-1,5 cm d&#39;une partie très développés de la série donneront environ 10 8 cellules. Déterminer la densité de cellule exacte à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Étiquette 10 8 cellules par la souche (ou une condition de traitement) par point de collecte à laquelle la fréquence de mutation est déterminée ou une taille de population suffisante pour obtenir au moins 5 à 10 colonies mutantes par prélèvement sur ​​un milieu sélectif (par rapport à la fréquence de mutation de l&#39;étape 2.2). Inclure un 10 8 cellules supplémentaires pour les mesures de base par souche / état. </li><li> étiquette de biotine selon la procédure standard du fabricant, sauf utiliser un 5 mM réactif de biotine stock et secouez-la délicatement pendant l&#39;incubation. Spin pendant 5 min à 4 ° C à 3000 g pendant toutes les étapes de centrifugation, sepuis tournant à des températures supérieures à 4 ° C peut entraîner une augmentation de la perte de cellules. Après le lavage final, suspendre les cellules à une concentration de 10 8 cellules / ml marqués dans l&#39;eau. </li><li> Vérifiez la viabilité des cellules à l&#39;aide de la coloration au bleu trypan. Diluer 10 pi de cellules avec 23 pi d&#39;eau et 67 pi de 0,4% au bleu trypan en 1x PBS. Incuber pendant au moins 40 minutes à température ambiante avant de marquer cellules vivantes (non colorées) et mortes (colorées) en utilisant un hématimètre. </li><li> Mesurer les valeurs de référence pour l&#39;instabilité du génome, l&#39;âge de la cellule, et d&#39;autres caractéristiques pertinentes (voir les sections 5, 6 et 7). </li><li> Transfert des cellules marquées à la biotine pour 20 ml de milieu YPD pour 10 8 cellules dans une fiole d&#39;Erlenmeyer (environ 5 x 10 6 cellules / ml). Développer la culture (s) 16-18 h à 20 ° C à une densité d&#39;environ 10 8 cellules / ml (quatre à cinq générations de portables), mais ne permettent pas de cellules pour atteindre la phase stationnaire. Utilisez un temps d&#39;incubation plus courte pour la croissance à 30 ° C. Gardez marqué à la biotine caunes à 4 ° C pendant plusieurs heures avant l&#39;addition au milieu, si nécessaire pour optimiser le moment de la période de croissance et de la collecte. </li></ol> 4. Perle étiquetage et le stockage magnétique <ol><li> Après la phase de croissance, dilué une partie aliquote de la culture pour déterminer la densité de cellules en utilisant un hématimètre. cellules de pellets par centrifugation pendant 5 min à 4 ° C à 3000 x g. Verser le surnageant. </li><li> Laver les cellules par vortex de suspendre le culot dans 30 ml de tampon cordon d&#39;étiquetage, puis centrifugation et verser le surnageant de l&#39;article 4.1. Répéter lavage. </li><li> Cellules complètement remettre en suspension dans un tampon cordon d&#39;étiquetage 50 pi par 10 8 cellules totales au vortex. Ajouter 2 ul billes magnétiques par 10 8 cellules totales et vortex brièvement pour mélanger. Incuber sur de la glace pendant 10 min, en inversant périodiquement à mélanger (modifié à partir d&#39;un protocole en ligne à <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;). </li><li> Laver les cellules trois fois avec 30 ml de tampon de marquage bourrelet. </li><li> Ajouter 0,5 ml de tampon cordon d&#39;étiquetage pour 10 8 cellules totales et vortex brièvement pastille sur le réglage moyen jusqu&#39;à ce que les cellules sont remises en suspension. Verser à travers un tamis cellulaire de 40 um dans un tube de 50 ml pour éliminer les grumeaux de cellules restantes. Si nécessaire, laisser les cellules sur de la glace pendant 1-2 heures avant le chargement sur la colonne. </li><li> Suivez le protocole recommandé par le fabricant pour les colonnes magnétiques se lient, se laver, et sont élues les cellules mères de perles marqué magnétiques. Pour accroître la récupération de cellules marquées, utiliser au moins une colonne par 2 x 10 9 cellules totales. <ol><li> Retirer les bulles qui se produisent lors du chargement de colonnes, comme ils bloquer la circulation. Retirer et remplacer la colonne de séparation entre les lavages à empêcher les cellules de coincement entre les billes (modifiés à partir d&#39;un protocole en ligne à <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> Sauf s&#39;écouler à travers de la liaison et des étapes de lavage à analyser les jeunes cellules produites par les cellules-mères, le cas échéant. Concentrer les cellules comme décrit dans l&#39;étape 4.7. </li><li> Utilisez des séparateurs multi-colonnes pour le traitement de plusieurs échantillons à la fois. Éluer plusieurs colonnes d&#39;un même échantillon dans le même tube de collecte afin de réduire le temps de traitement et diminuer la perte de cellules. </li></ol></li><li> Concentré cellules mères éluées par centrifugation à 3000 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer tout mais 1 ml de tampon par 10 8 cellules marquées à la biotine originaux. Vortex brièvement à suspendre les cellules dans du tampon restant. </li><li> Diluer une aliquote de cellules et colorer au bleu trypan pour déterminer la densité de cellules et la viabilité des cellules en utilisant un hémocytomètre (voir étape 3.5). Calculer le nombre total de cellules récupérées. <ol><li> Si le nombre de cellules est sensiblement plus élevé que prévu, passer l&#39;échantillon d&#39;élution à travers une autre colonne pour essayer d&#39;enlever la contamination des cellules jeunes.Si le nombre de cellules est sensiblement plus faible que prévu, passer le flux sauvé par échantillon à travers une autre colonne pour essayer d&#39;améliorer le rendement des cellules mères. </li></ol></li><li> Utiliser des cellules pour d&#39;autres analyses, comme décrit dans les sections 5 et 6 Alternativement, cultiver les cellules dans un bouillon YPD à nouveau pour accroître leur âge réplicative (étape 3.7) et de suivre par l&#39;étiquetage de perles et de tri (étapes 4.1-4.8.1), sans la besoin de répéter le marquage à la biotine. </li></ol> 5 Détermination de réplicative Âge <ol><li> Spin cellules pendant 2 min à 5000 g à la température ambiante pendant toutes les étapes de cette section. Mettez 25 pi de cellules récupérées (~ 10 8 cellules / ml) dans un tube de 1,5 ml de la centrifugeuse et laver deux fois avec 1 ml de PBS 1X. Aspirer le surnageant. <ol><li> Décongeler une aliquote de WGA-conjugué, vortex pour mélanger, et tourner brièvement pour éliminer les agrégats de protéines. Suspendre les cellules dans 180 ul de 1 x PBS et 20 ul de WGA conjugué à une molécule fluorescente pour marquer cicatrices bourgeon sur la surface de thcellules de e. Couvrir le tube de 1,5 ml centrifugeuse avec une feuille et incuber avec doux balancement à 30 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver trois fois avec 1 ml de PBS 1X. </li></ol></li><li> Pour la microscopie à fluorescence, diapositives sur l&#39;étiquette et monter selon le protocole standard utilisant un agent anti-fade. Durcir complètement les diapositives dans le noir (jusqu&#39;à quelques jours) avant la lamelle d&#39;étanchéité pour éviter les mouvements de la cellule lors de l&#39;imagerie. Comptez cicatrices bourgeon sur au moins 50 cellules par échantillon pour obtenir une mesure représentative de l&#39;âge de la cellule. Stocker les lames pour un maximum de 1 mois pour la visualisation des cicatrices de bourgeons, si nécessaire. <ol><li> En variante, déterminer l&#39;intensité du signal fluorescent provenant de la WGA conjugué en effectuant cytométrie en flux sur des cellules en suspension dans 1 ml de PBS 1x, après l&#39;étape 5.1.2. Utilisez un laser d&#39;excitation de 405 nm et 530/30 nm filtre d&#39;émission d&#39;un filtre longue passe de 505 nm pour WGA-Alexa 488 Inclure un témoin non coloré pour chaque point de collecte. </li></ol></li><li> Graphique cicatrices de bourgeons sur les jeunes et les cellules âgées comptés par microscopie sur laaxe des ordonnées à l&#39;encontre de la moyenne géométrique normalisée (moyenne géométrique coloré / moyenne géométrique non coloré) de la fluorescence de WGA conjugué à partir des mêmes populations de cellules sur l&#39;axe des x. Obtenir l&#39;équation d&#39;une ligne de tendance linéaire de cette relation. Pour les expériences ultérieures, substituer la moyenne géométrique normalisée de WGA conjugué intensité de fluorescence d&#39;une population de cellules de x dans l&#39;équation pour résoudre et y afin de déterminer l&#39;âge moyen des cellules d&#39;un échantillon. </li></ol> 6. Mutation Fréquence <ol><li> Propagation triée cellules mères remises en suspension dans le tampon de l&#39;étape 4.7 sur milieu YPD et milieu sélectif tel que décrit à l&#39;étape 2.1.1. Utiliser 1 ml de cellules remises en suspension mère de cellules dérivées de moyennes et sélectives à 5000 g pendant 1 min. REMARQUE: Propagation des volumes plus importants de cellules diluées dans du milieu YPD comme cellules augmentent en âge de compenser l&#39;augmentation du nombre de cellules viables et non-sénescentes dans les populations âgées. <ol><li> Incuber le milieu YPD et moyennes de plaques sélectivesl&#39;étape 6.1, à 30 ° C pendant 3 à 4 jours, respectivement. Augmenter la durée d&#39;incubation jusqu&#39;à une semaine pour les cellules souches très anciennes ou à croissance lente. Calculez la fréquence de mutation tel que décrit à l&#39;étape 2.2. </li></ol></li></ol> 7 Calcul prévue fréquence de mutation pour un âge donné réplicative <ol><li> Calculer l&#39;augmentation de l&#39;âge moyen réplicative des cellules marquées à la biotine au cours de l&#39;essai en soustrayant la moyenne d&#39;âge de la population initiale de cellules à partir de la moyenne d&#39;âge des cellules mères triés pour le tri correspondante. Utilisez les âges de cellules calculées à l&#39;étape 5.2 ou 5.2.2 étape. </li><li> Multipliez le taux de mutation obtenue à l&#39;étape 2.1.3 par l&#39;augmentation de l&#39;âge de la cellule moyenne calculée à l&#39;étape 7.1. Ajouter cette valeur à la fréquence de mutation de base de la population initiale calculée à l&#39;étape 2.2 pour déterminer la fréquence de la mutation prévue pour les cellules de l&#39;âge réplicative pertinent. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Ce protocole combine plusieurs procédés pour activer les ressources disponibles et les approches dans les Saccharomyces cerevisiae système modèle pour être efficacement appliquée à l&#39;étude du génome de l&#39;instabilité au cours du vieillissement cellulaire mitotique. Une grande variété de dosages pour quantifier les différentes formes d&#39;instabilité du génome par sélection phénotypique peut être combiné avec le tri magnétique pour étudier les changements possibles en fonction de l&#39;âge de l&#39;accumulation des formes particulières de mutations ou de remaniements chromosomiques. Bien que les approches de séquençage entier du génome pourraient fournir plus d&#39;informations sur les types d&#39;ensemble de changements qui se produisent dans un génome avec l&#39;âge, la capacité d&#39;utiliser des systèmes de sélection phénotypique pour obtenir des mesures de taux de mutation et d&#39;isoler préférentiellement certains types de modifications génétiques sont des atouts importants pour l&#39;étude mécaniste aspects de liées au vieillissement instabilité du génome. La rationalisation de la détermination de l&#39;âge de la cellule et le potentiel de faire des mesures parallèles de physiologiques modifications au moyen des flux fournissent cytométrie moyens efficaces pour corréler l&#39;instabilité du génome avec d&#39;autres modifications cellulaires au cours de gammes spécifiques d&#39;âge. Détermination des changements potentiels dépendant de l&#39;âge dans les taux de mutations qui s&#39;accumulent, il faut: 1) la détermination minutieuse des taux dans les populations de cellules jeunes, 2) la détermination précise de l&#39;âge de la cellule, et 3) la capacité d&#39;enrichir de manière fiable des populations suffisamment importantes de cellules mères pour mesurer de manière reproductible l&#39;instabilité du génome dans la vieillesse. Cette approche permet au système de modèle de levure de contribuer à la définition des mécanismes sous-jacents responsables des changements dépendant de l&#39;âge du taux et / ou des fréquences de l&#39;instabilité du génome dans les cellules activité mitotique. En outre, les facteurs génétiques et environnementaux peuvent être évalués rapidement des contributions au dépend de l&#39;âge de l&#39;instabilité génomique. En fin de compte, ces caractérisations pourraient conduire au développement de modèles qui tiennent compte de la manière dont les mutations s&#39;accumulent au cours du vieillissement réplicatif. Cette méthode repose sur la capacité à détecter des mutations ou d&#39;autres types de l&#39;instabilité du génome par l&#39;apparition de phénotypes sélectionnables pour mesurer les taux de ces événements. Cependant, la créativité dans la conception de l&#39;essai peut permettre de nombreux aspects de l&#39;instabilité du génome à étudier. Par exemple, les gènes URA3 et CAN1 peuvent être placés à des endroits différents du génome de tester toute influence de la localisation génomique de résultats. Réversion des allèles de gènes spécifiques non fonctionnels à des allèles de gènes fonctionnels pourrait tester certains processus de mutation. En outre, l&#39;introduction de plusieurs allèles d&#39;un gène inactif ou flanquant un gène avec des séquences répétées peut être utilisée pour étudier des événements de recombinaison par la restauration ou la perte de la fonction du gène, respectivement. des tests de fluctuation sont l&#39;approche standard pour déterminer les taux de ces divers événements génome d&#39;instabilité 9. Le protocole est écrit en utilisant l&#39;estimateur médian Lea-Coulson bien accepté et relativement simple de déterminer mutataux de tion pour le rendre plus accessible aux divers chercheurs, même si la méthode d&#39;estimation de la probabilité MSS-maxi est considéré comme la meilleure approche pour déterminer les taux de mutation 9. L&#39;estimateur du maximum de vraisemblance MSS-a déjà été examinée en détail 9, et peut être utilisé comme une méthode alternative, mais nécessite des calculs plus sophistiqués. Sinon, le logiciel libre pour calculer les taux de mutation de cette méthode a été mis à la disposition 22. Obtenir des mesures reproductibles des taux de mutation exige une attention à quelques aspects de la conception expérimentale, y compris en utilisant des cultures de répliques suffisantes, l&#39;inoculation de cultures à suffisamment de densités cellulaires initiales faibles que la taille de la population augmente de volume de culture appropriées 10.000 fois ou plus, et le choix de telle sorte que l&#39;ensemble du population de cellules peut être étalé sur un milieu sélectif. Pour ce dernier point, une formule décrite précédemment peut être utilisée pour ajuster le taux de mutation sur la base de la fraction de culture tested 9. Variation du taux de croissance des cultures peut compliquer la détermination d&#39;un taux de mutation reproductible, et un estimateur basé médiane-modifié qui peut donner des résultats plus reproductibles dans de telles situations, ont été décrites récemment 23. La capacité de mesurer avec précision l&#39;âge de la cellule est un autre facteur qui est important pour établir si les fréquences génome d&#39;instabilité dans les vieilles cellules sont différentes des valeurs attendues en raison du taux d&#39;événements dans les jeunes cellules. Nous avons trouvé WGA coloration préférable à calcofluor coloration blanche, à la fois en termes de fond et de flexibilité, car WGA est disponible conjugué à différentes molécules fluorescentes. Cette flexibilité peut fournir plus de possibilités pour des mesures simultanées des autres caractéristiques des cellules avec des réactifs fluorescents. Le travail initial d&#39;établir une relation entre l&#39;intensité du signal pour la coloration WGA et le nombre correspondant de cicatrices de bourgeons sur les cellules peut alors conduire à une plusdétermination rapide de l&#39;âge de la cellule par cytométrie de flux. Cette approche permet aussi d&#39;utiliser de plus grandes tailles de population seraient généralement examinées au microscope pour une meilleure reproductibilité des mesures. Alors que toutes les déterminations d&#39;âge pourraient être faites par l&#39;examen microscopique des cellules, nous pensons que la cytométrie en flux approche facilite le dépistage rapide des facteurs qui influencent dépendant de l&#39;âge de l&#39;instabilité génomique. En plus de la mesure de l&#39;âge de la cellule de façon fiable, il convient de tenir compte du nombre de divisions cellulaires des cellules mères sont autorisés à subir à chaque cycle successif de la croissance et le tri des cellules. Utilisez une taille de population initiale plus faible ou un volume de grande culture pourrait permettre aux cellules de se soumettre à plusieurs divisions cellulaires avant d&#39;atteindre la densité cellulaire désirée. Par exemple, d&#39;autres chercheurs ont utilisé seulement deux cycles de tri d&#39;obtenir de très anciennes cellules de levure 16, ce qui a l&#39;avantage évident d&#39;obtenir des cellules âgées de moins experimeétapes NTAL. Pour déterminer si pour augmenter le volume de la culture pour permettre aux cellules de compléter plusieurs divisions cellulaires avant le tri, garder à l&#39;esprit la limite sur le nombre total de cellules qui peuvent être traités dans une seule colonne. L&#39;utilisation d&#39;un plus grand volume de culture peut nécessiter l&#39;utilisation de plusieurs colonnes pour trier un population de cellules. En outre, si les cellules subissent moins de cycles de division cellulaire entre les points sortes / de collecte, alors il ya plus d&#39;occasions d&#39;observer des écarts de fréquence des mutations attendues à des moments distincts pendant la durée de vie. Par exemple, l&#39;échantillonnage seulement au début et les points de temps pendant la durée de vie peut fin de produire des données indiquant une augmentation constante de la fréquence des mutations, mais d&#39;échantillonnage à temps intermédiaires supplémentaires au cours de la durée de vie peut montrer rapidement, puis les plateaux que la fréquence de mutation augmente. Cependant, depuis ce protocole isole cellules mères anciennes, il est possible d&#39;obtenir une mesure plus directe de l&#39;évolution des taux de mutation avec l&#39;âge. des tests de fluctuation pourrait be effectuée à l&#39;aide de cellules mères d&#39;âges différents afin de déterminer si le taux de mutation sera différent de celui obtenu en utilisant des cellules jeunes. Alors que les cultures de ces tests de fluctuation seront un mélange de cellules jeunes et vieux à mesure qu&#39;ils grandissent, les écarts de taux obtenus à partir de cellules jeunes pouvaient être attribués à l&#39;utilisation d&#39;une population de départ plus. La capacité à obtenir de façon reproductible une grande population assez de cellules mères âgées de mesurer avec précision l&#39;instabilité du génome est essentiel à la réussite de cette approche. Alors que le protocole décrit l&#39;utilisation d&#39;un système de tri magnétique particulier à cette fin, d&#39;autres groupes ont trié les cellules-mères de levure avec d&#39;autres systèmes 14,18 (voir le tableau des matériaux). Ces systèmes alternatifs devraient également travailler avec cette méthode, bien que certains l&#39;optimisation des protocoles des fabricants pourrait être nécessaire. Quel que soit le système particulier utilisé, la taille de la population nécessitentd varie en fonction de la fréquence de la mutation ou le type de réarrangement du génome choisie pour l&#39;étude. Au minimum, il doit y avoir suffisamment de cellules mères pour obtenir au moins une colonie de mutants par population pour calculer une fréquence de mutation. Dans la pratique, les résultats peuvent être très variables si ce n&#39;est que de zéro à cinq colonies mutantes sont attendus à partir de la taille de la population, et même une petite augmentation de la taille de la population, de sorte que cinq à dix colonies mutantes sont attendus, peut grandement améliorer la reproductibilité. Lorsque la biotine, l&#39;identification d&#39;une population de départ, le rendement de récupération pour chaque type doit être pris en compte pour aider à identifier la taille appropriée de la population nécessaire pour mesurer la fréquence de mutation dans les cellules mères âgées. Avec 90% de récupération de cellules mères après chaque sorte, seulement 59% de la population d&#39;origine serait récupéré après cinq tours de la croissance et de tri. Cette chute à ~ récupération de 33% de la population d&#39;origine après cinq tours de la croissance et de tri si seulement 80% des cellules mères sont étiquetés récupéreré au cours de chaque sorte. Mesurer et optimiser la récupération est crucial lors de la mesure des événements de faible fréquence, depuis deux à trois fois diminution de la taille de la population pourrait facilement conduire à des chiffres fiables de colonies mutantes par la population. Il existe de nombreuses options pour se développer ou modifier ce protocole pour obtenir une meilleure compréhension de l&#39;instabilité du génome au cours du vieillissement cellulaire mitotique. Voici quelques exemples simples d&#39;analyser comment des altérations de la fonction des gènes, les changements de médias, ou d&#39;autres changements de conditions environnementales modifient l&#39;accumulation de mutations avec l&#39;âge. Les taux de mutation de cellules jeunes ayant une fonction de gène altérée ou à l&#39;état approprié seraient mesurés et utilisés pour déterminer si les mutations s&#39;accumulent différente de celle prédite par les valeurs de débit et différemment que dans les populations de cellules de contrôle. Les populations de cellules à différents moments au cours du vieillissement réplicatif pourraient être exposés à des facteurs de stress spécifiques, telles que les espèces réactives de l&#39;oxygène ou des agents endommageant l&#39;ADN. Aexposition transitoire et d&#39;intensité légère à un stress oxydatif ne modifie pas sensiblement la capacité d&#39;effectuer le tri cellulaire (Figure 3), mais les contraintes plus sévères peut compliquer la récupération des cellules. Des expériences préliminaires seraient nécessaires pour vérifier que les cellules mères peuvent encore être récupérées de manière efficace après des contraintes spécifiques. En outre, les caractéristiques cellulaires de cellules mères isolées ont pu être analysés en détail, y compris les niveaux d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène, de la morphologie mitochondriale et vacuolaire, et d&#39;autres caractéristiques physiologiques associés au vieillissement 3. En outre, les cellules-mères peuvent être une population de départ pour un autre traitement ou manipulation. Comme les cellules mères et filles sont physiquement séparés au cours de la procédure, les cellules filles sont également toujours disponibles pour l&#39;analyse. Par exemple, des changements dans les caractéristiques physiologiques de cellules filles ou l&#39;héritage asymétrique des macromolécules endommagées entre la mère de la levure et des cellules filles <sjusqu&#39;à&gt; 24 pourrait être comparé à la synchronisation des changements intéressants dans la mutation des fréquences / taux. fréquences de mutation pour les populations de cellules fille pourraient aussi être obtenus afin d&#39;essayer de modéliser s&#39;il existe héritage asymétrique des mutations au cours du vieillissement réplicatif. En résumé, la combinaison de l&#39;enrichissement de cellules mères à travers le tri cellulaire magnétique avec des tests de fluctuation permet les avantages de la S. système modèle cerevisiae pour être efficacement appliquée à des mécanismes responsables de l&#39;accumulation de changements génétiques au cours du vieillissement cellulaire mitotique enquête.

Les micro-organismes, tels que la levure Saccharomyces cerevisiae, sont d&#39;excellents modèles pour enquêter sur les taux de mutation, mais ces modèles n&#39;ont pas été pleinement utilisés pour étudier l&#39;accumulation de mutations au cours du vieillissement mitotique des cellules. l&#39;accumulation de mutations dans le génome nucléaire a émis l&#39;hypothèse de contribuer à un vieillissement en entraînant une perte progressive de la (ou variation) dans une des fonctions des gènes. La possibilité d&#39;utiliser un système microbien d&#39;étudier les mécanismes et les conséquences de l&#39;accumulation des mutations au cours du vieillissement pourrait grandement accélérer l&#39;identification de facteurs génétiques et environnementaux qui influent sur ce processus, car des systèmes génétiques faciles et la facilité de quantifier les changements phénotypiques rares dans les micro-organismes. Facteurs de réparation d&#39;ADN et de protéines de réponse de lésion de l&#39;ADN sont bien conservées entre les espèces diverses 2, et les similitudes fondamentales dans le vieillissement organismal ont été identifiés pour des organismes aussi divers que S. cerevisiae unemammifères d 3, ce qui rend probable que les résultats obtenus à partir des études chez la levure seront pertinents au vieillissement dans de nombreux organismes. Les études de vieillissement en S. cerevisiae faire usage de deux modèles de vieillissement qui mesurent le vieillissement chronologique ou vieillissement réplicatif des cellules. Vieillissement chronologique est caractérisée par la perte progressive de la viabilité des populations de cellules de levure qui sont dans un état ​​(phase stationnaire) ne se divisant pas en raison de l&#39;épuisement des nutriments 3. Le modèle de vieillissement chronologique a été utilisée pour démontrer que les mutations s&#39;accumulent avec l&#39;âge 4, puisque de grandes populations de cellules peuvent être facilement obtenus dans ce modèle pour effectuer des sélections phénotypiques de cellules mutantes. Dans ce cas, l&#39;accumulation de mutation semble être influencée par des voies de signalisation de la croissance et du stress oxydatif 5, et chacun de ces facteurs sont pertinents à la compréhension du vieillissement chez les eucaryotes pluricellulaires 3. Le modèle de vieillissement réplicatif exploite la divisi asymétriquesur entre S. cellules, mère et fille cerevisiae pour enquêter sur le vieillissement qui se produit avec les générations cellulaires successives 3. Levure vieillissement réplicatif a souvent été mesurée par micromanipulation de petites populations de la mère et cellules filles, ou, plus récemment, par vidéo-microscopie de petites populations de cellules de levure dans des dispositifs microfluidiques 6,7. Taille de la population étant limitées, ces approches mal adaptée à l&#39;étude accumulation des mutations au cours du vieillissement mitotique moins que des informations sur le génome entier est obtenu à partir de cellules individuelles ou de modification génétique à très haute fréquence sont mesurées 8. Séquençage complet du génome de cellules individuelles à fournir des ensembles de données importantes pour enquêter sur l&#39;accumulation des mutations, mais les systèmes de sélection phénotypiques ont le grand avantage de fournir un moyen de mesurer les taux de mutation d&#39;étudier les mécanismes d&#39;accumulation de mutation sous-jacente. Des études pour examiner les fréquences et les taux de mutation à travers les sélections phénotypiques dans haploid souches de levure au cours du vieillissement réplicatif n&#39;ont pas encore été rapporté. Les taux de mutation sont généralement mesurés en utilisant des tests de fluctuation 9. des valeurs de fréquence de mutation indiquent le nombre total de cellules présentant une mutation dans une séquence de gène dans une population. Cela comprend des cellules dans lesquelles se produisent des mutations indépendantes et toute la descendance de ces cellules qui héritent simplement mutations préexistantes. En revanche, les taux de mutation mesurées par des tests de fluctuation représentent le nombre de mutations indépendantes qui se posent à chaque nouvelle génération de cellules. Ces essais impliquent typiquement l&#39;inoculation de cultures répétées à des densités cellulaires faibles pour réduire la possibilité d&#39;ajouter des cellules ayant des mutations préexistantes dans une séquence cible, les cultures en croissance à proximité de la saturation, et l&#39;identification des cellules mutantes par croissance sur un milieu sélectif. Le nombre de cellules mutantes identifiés dans les populations répétés sont ensuite utilisés dans l&#39;un des nombreux modèles mathématiques pour estimer le nombre de imutations ndependent qui ont surgi pendant la croissance 9. En comparant le nombre de mutations indépendantes de la taille moyenne de la population est une mesure du taux de mutation. Dans S. cerevisiae, les fréquences et les taux de mutation sont fréquemment mesurée en utilisant les gènes URA3 et CAN1, puisque des mutations perte de fonction de ces gènes produisent des phénotypes sélectionnables. La perte de fonction URA3 rend les cellules résistantes à l&#39;acide 5-fluoroorotique (5-FOA), étant donné que la protéine codée par URA3 convertit 5-FOA en une molécule toxique 10. La perte de fonction de CAN1 permet aux cellules deviennent résistantes à la canavanine, un analogue de l&#39;arginine toxique, car la protéine codée par l&#39;arginine et la transporte CAN1 canavanine dans des cellules 11. Les deux stratégies de tri génétiques et physiques ont été utilisées avec succès pour obtenir de plus grandes populations de S. cellules mères cerevisiae pour faciliter les enquêtes du vieillissement réplicatif. Stratégies génétiques comprennent des approches intelligentes qui sélectionnent contre la survie des cellules de fille dans une population. Le programme d&#39;enrichissement de la mère (MEP) implique bêta-estradiol induction de la recombinase Cre expression que dans les cellules filles, ce qui conduit à des perturbations spécifiques fille de deux gènes essentiels qui ont été modifiées pour contenir des sites loxP 12. MEP souches peuvent être cultivées normalement en l&#39;absence de l&#39;inducteur, mais seules les cellules mères vont continuer à se diviser après l&#39;induction, alors que les cellules filles vont arrêter à la phase M typiquement au cours de leur première progression à travers le cycle cellulaire 12. Bien que ce système n&#39;a pas été utilisé pour étudier globalement l&#39;accumulation de mutations au cours du vieillissement, il a été utilisé pour étudier la perte d&#39;hétérozygotie, une forme relativement fréquente de l&#39;instabilité du génome des souches de levure diploïde, ainsi que des modifications biochimiques dans les cellules de vieillissement mères 13,14. De même, le système pare-fille implique l&#39;expression spécifique-fille de la S. cerevigène siae URA3 15. Souches fille-parafoudre se développent normalement jusqu&#39;à 5-FOA est ajouté au milieu, à laquelle les cellules exprimant le point de fille URA3 mourront, tandis que les cellules mères continuent de croître 15. Ce sont des systèmes utiles pour enrichir les cellules-mères, mais elles dépendent de maintien des fonctions des gènes qui constituent le système de sélection. Des mutations aléatoires dans un ou plusieurs composants du système de sélection peut conduire à des cellules filles qui échappent à la sélection et prolifèrent de façon exponentielle. Au cours du développement des souches de MEP, importance de la population étaient déterminés à éviter l&#39;apparition de cellules filles mutantes qui pourraient échapper à la sélection 12. Toutefois, cette limite de taille de la population compromet la détection des formes rares de l&#39;instabilité du génome au cours du vieillissement réplicatif. Cette limitation de la taille de la population peut être partiellement résolu en utilisant des souches de levure diploïde avec deux copies de chaque gène qui contribue au système de sélection, car la plupartmutations seraient probablement récessive 12. Cependant, l&#39;utilisation de souches diploïdes limite les types d&#39;événements de mutation qui peuvent être facilement détectés par rapport à celles qui peuvent être facilement détectés dans les cellules haploïdes de levure. Stratégies de tri physiques comprennent l&#39;isolement des cellules mères avec une surface cellulaire marqué de cellules filles non marqués pour enrichir en grandes populations de cellules mères. L&#39;observation que les protéines de surface cellulaire (protéines de la paroi cellulaire) de S. cerevisiae cellules filles sont nouvellement synthétisés au cours de bourgeonnement a été exploitée pour marquer les cellules-mères, sans marquage des cellules filles qu&#39;elles produisent 16. Par exemple, une population initiale de cellules de levure marqués sur leur surface avec de la biotine peut être cultivé et ensuite isolé à partir de leurs cellules filles à l&#39;aide des microbilles anti-biotine et magnétique de tri 16, parce que les cellules filles produites par la population initiale ne contiendront pas de la biotine sur leur surface . Croissance de série ettri permet aux populations progressivement âgés de cellules mères à être obtenues et analysées. Cette procédure a été utilisée avec succès pour étudier les changements dans la physiologie cellulaire et l&#39;expression des gènes au cours du vieillissement réplicatif de levure 13,14,17,18. La méthode actuelle adapte cette marquage à la biotine et technique de tri magnétique pour enrichir les cellules mères dans le but de mesurer l&#39;accumulation de mutations potentiellement rares ou d&#39;autres formes de l&#39;instabilité du génome analysés dans les sélections phénotypiques. Croissance de série et le tri physique permettent une analyse de l&#39;accumulation de mutations dans les cellules-mères progressivement âgées, ainsi que dans les populations de cellules filles. Détermination du taux de mutation par génération permet une fréquence de mutation prévu pour être calculée pour les cellules mères qui ont subi un nombre particulier de divisions cellulaires. Comme les valeurs de fréquences prévues sont basées sur l&#39;augmentation prévue en raison de cycles supplémentaires de la division cellulaire, des écarts importants dans les Mutati observéssur les fréquences par rapport aux valeurs prédites fournir des preuves des changements selon l&#39;âge du taux de mutations qui s&#39;accumulent. En utilisant ce protocole, fluorescence des cicatrices de bourgeons qui correspondent à des sites de divisions cellulaires sur des cellules-mères couplés avec l&#39;analyse par cytométrie en flux peut être utilisé pour déterminer rapidement la répartition par âge des populations triées et non triées. Réactifs fluorescents supplémentaires, tels que ceux qui sont utilisés pour détecter des espèces réactives de l&#39;oxygène, peuvent également être utilisées au cours de ce protocole. Dans l&#39;ensemble, ce protocole permet une analyse efficace des changements dépendant de l&#39;âge de l&#39;instabilité du génome ayant le potentiel pour la corrélation de cellules changements physiologiques liés à l&#39;âge dans un organisme modèle bien adapté à l&#39;étude des facteurs génétiques et environnementaux qui influent sur l&#39;instabilité du génome liées au vieillissement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:359px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:359px;">100mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Biotin Microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td style="width:359px;">2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS LS columns</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:359px;">25 columns suitable for QuadroMACS separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuadroMACS separator</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td style="width:359px;">Separator Only</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">QuadroMACS Starting Kit</td>
			<td style="width:108px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-051</td>
			<td style="width:359px;">Includes:&#160; QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD Falcon Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:359px;">40 &#181;m for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes.&#160; 50 per pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td style="width:359px;">Powder, filtering after dissolving important to remove particulates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">W11261</td>
			<td style="width:359px;">Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>10 ml, other antifade reagents could also be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining magnetic sorting of mother cells and fluctuation tests to analyze genome instability during mitotic cell aging in saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae a été un excellent modèle pour les mécanismes et les conséquences de l&#39;instabilité du génome d&#39;instruction. Les informations obtenues à partir de ce modèle de levure est pertinente pour de nombreux organismes, dont les humains, puisque les facteurs de réparation de l&#39;ADN et réponse aux lésions de l&#39;ADN sont bien conservées entre espèces différentes. Cependant, S. cerevisiae n&#39;a pas encore été utilisé pour répondre pleinement si le taux d&#39;accumulation des mutations changements avec l&#39;augmentation réplicative (mitotique) l&#39;âge en raison de contraintes techniques. Par exemple, les mesures de levure durée de vie réplicative par micromanipulation impliquent de très petites populations de cellules, qui interdisent la détection des mutations rares. Les méthodes génétiques pour enrichir de cellules mères dans les populations en induisant la mort des cellules filles ont été développés, mais la taille de la population sont encore limitées par la fréquence avec laquelle des mutations aléatoires qui compromettent les systèmes de sélection se produisent. Le protocole actuel profite de Sorti magnétiqueng de cellules de levure mère surface marquée d&#39;obtenir une population suffisamment large du vieillissement des cellules mères de quantifier mutations rares dans les sélections phénotypiques. Les taux de mutation, mesurées par des tests de fluctuation, et la fréquence des mutations sont d&#39;abord établis pour les jeunes cellules et utilisés pour prédire la fréquence des mutations dans les cellules mères de différents âges de réplication. les fréquences de mutation sont ensuite déterminés pour les cellules-mères triées, et de l&#39;âge des cellules mères est déterminé par cytométrie de flux par coloration avec un réactif fluorescent qui détecte les cicatrices de bourgeons formés sur les surfaces des cellules pendant la division cellulaire. Comparaison de la fréquence des mutations prévues en fonction du nombre de divisions cellulaires aux fréquences observées expérimentalement pour cellules mères d&#39;un âge donné réplicatif peut alors identifier s&#39;il ya des changements liés à l&#39;âge du taux de mutations qui s&#39;accumulent. Des variantes de ce protocole de base fournissent les moyens d&#39;étudier l&#39;influence des altérations des fonctions spécifiques de gènes oudes conditions environnementales spécifiques sur l&#39;accumulation de mutation à traitent des mécanismes de l&#39;instabilité du génome sous-jacente au cours du vieillissement réplicatif.

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Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Les taux de mutation chez les jeunes Saccharomyces cerevisiae cellules mesurées par des tests de fluctuation sont utilisés pour prédire la fréquence des mutations de cellules mères de différents âges de réplication. Tri magnétique et la cytométrie en flux est ensuite utilisé pour mesurer la fréquence des mutations réelles et l&#39;âge des cellules mères afin d&#39;identifier les écarts par rapport à la fréquence des mutations prévues.

La combinaison de tri magnétique des cellules mères et Tests de fluctuation à Analyser instabilité du génome cours mitotique vieillissement cellulaire dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

12.4K vues.  Rensselaer Polytechnic Institute.  Les taux de mutation chez les jeunes Saccharomyces cerevisiae cellules mesurées par des tests de fluctuation sont utilisés pour prédire la fréquence des mutations de cellules mères de différents âges de réplication. Tri magnétique et la cytométrie en flux est ensuite utilisé pour mesurer la fréquence des mutations réelles et l'âge des cellules mères afin d'identifier les écarts par rapport à la fréquence des mutations prévues. 

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Etudier Instabilité génomique fonction de l&#39;âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).