Nous tenons à remercier Laura Schippers pour écrire les premières versions du protocole de chargement de cellules et Marcus de Goffau et Guille Zampar pour marquer morphologies mitochondriales.

1. Production et la préparation d&#39;une plaquette moule en silicone Puces microfluidiques sont créés à partir d&#39;un moule de plaquette de silicium produite par lithographie douce. Ces plaquettes peuvent être réutilisés plusieurs fois pour produire des puces microfluidiques. Il est souhaitable que la production d&#39;une tranche respective est réalisée par un groupe spécialisé dans la microfluidique 6. La plaquette est réalisée par un procédé de photolithographie deux étapes au moyen de deux couches différentes de résine photosensible négative, SU-8 7. La couche de fond est utilisée pour générer la zone de piégeage de cellules (SU-8 2002; hauteur 3-4 pm), alors que les canaux sont réalisés avec la couche supérieure (SU-8 2010; hauteur 10 pm). Une impression du processus de production de plaquettes peut être trouvée dans Huang et al 8. Les dessins des puces microfluidiques peuvent être obtenus auprès des auteurs ainsi que des conseils sur la façon d&#39;obtenir une plaquette respective. <ol><li> Une fois la plaquette est obtenue, couper un morceau de int Tough-Tago minces bandes d&#39;environ 0,5 mm par 3 mm avec un scalpel et les placer soigneusement sur ​​la plaquette légèrement sur ​​le dessus de la structure de canal entre les canaux d&#39;entrée et le réseau Micropad (figure 2A). Cela se traduira par la formation d&#39;un grand canal supplémentaire dans chaque puce, qui permettra non seulement être utilisé pendant le chargement de la cellule, mais il est également important pour le fonctionnement stable du dispositif microfluidique. </li><li> Couvrir la boîte de Pétri en verre avec une double couche de papier d&#39;aluminium et mettre la galette dans la boîte de Pétri. La feuille d&#39;aluminium permet d&#39;éviter PDMS de fonctionnement entre la plaquette et la boîte de Pétri. Si PDMS ne se glisser entre la plaquette et la boîte de Pétri en verre, la plaquette devient fixé de façon permanente dans la boîte de Pétri. Bien que la plaquette est encore utilisable, il ne sera pas possible de remplacer la boîte de Pétri en verre si ça casse et le PDMS devra être coupé par la suite. </li></ol> 2. La production de puces microfluidiques <ol><li> Placez un plastique videtasse sur la balance et tarer la balance. Verser 40 g de base PDMS dans le gobelet en plastique (pour un cm de diamètre en verre de Pétri 12). Ajouter PDMS durcisseur avec une pipette dans un rapport p / p de 1:10, soit environ 4 ml. </li><li> Mélanger le PDMS et durcisseur à fond pendant plusieurs minutes. Cela peut être fait avec la pipette jetables en plastique qui a servi à la pipette l&#39;agent de durcissement. Il est important que le mélange soit bien mélangé avant d&#39;être coulée sur le dessus de la galette. Mauvais mélange fera partie du PDMS ne se polymériser. </li><li> Verser le PDMS sur le dessus de la galette dans la boîte de Pétri en verre. </li><li> Le mélange de PDMS avec l&#39;agent de durcissement va conduire à la formation de bulles dans le mélange PDMS. Ces bulles doivent être retirés avant le PDMS polymérise. Le PDMS peut être dégazé après la coulée sur le dessus de la plaquette en plaçant la boîte de Petri dans un dessiccateur relié à une pompe à vide. Avec cette configuration, il faut environ 30 minutes pour éliminer toutes les bulles du mélange. </li><li> Polymériser ee PDMS en plaçant la boîte de Pétri avec la galette sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 1 h, puis à 65 ° C pendant une heure. </li><li> Retirer la feuille d&#39;aluminium ainsi que la tranche et le PDMS polymérisé à partir de la boîte de Pétri en verre. Enlever la feuille d&#39;aluminium et la couche mince de résidu polymérisé PDMS de l&#39;arrière de la plaquette. La couche de PDMS sur le dessus de la tranche peut alors être séparé de la plaquette en la soulevant avec soin. </li><li> Placez la couche de PDMS à l&#39;envers (avec les canaux vers le haut) sur le banc et découpez les modèles de puce unique imprimé sur le PDMS soigneusement avec un scalpel. Essayer de conserver l&#39;ordre de 3 mm de PDMS autour des bords des canaux afin d&#39;améliorer la fixation de la puce sur le verre de recouvrement par la suite. </li><li> Percer des trous dans le PDMS aux extrémités de la goulotte d&#39;entrée, de sortie et de côté (figure 2A) en poussant un tronçon Luer de calibre 20 tout le long du PDMS de façon rectiligne. </li></ol> Assurez-vous que la puce PDMSest toujours couché à l&#39;envers sur le banc tandis que poinçonnage des trous. Ceci empêche PDMS de coller à l&#39;intérieur du canal, ce qui pourrait provoquer un blocage du canal. <ol start="9"><li> Après avoir percé chaque trou, enlever la colonne de PDMS dans le talon luer avec des pincettes avant de tirer le talon de nouveau. La colonne PDMS pourrait autrement rester derrière et de bloquer le trou juste poinçonné. </li><li> Nettoyer les surfaces de la puce à partir de particules de poussière et PDMS résiduelle en plaçant du ruban adhésif sur elle et enlever immédiatement de nouveau la bande. De même nettoyer le verre de protection à laquelle la puce sera jointe. </li><li> Placez la puce nettoyé et couvercle en verre en dessous de la lampe UV de la paillasse Cleaner UV-Ozone. Les parties qui doivent être liés ensemble doivent faire face à la lampe. </li><li> Exposer le PDMS et couvrir verre à la lumière UV pendant 6-8 min, et directement après, mettre la puce de la vitre de protection en plaçant les surfaces exposées au-dessus de l&#39;autre. </li><li> Tapoter légèrement sur les côtés de la pucefavoriser la participation du PDMS pour le verre de couverture et d&#39;éliminer les bulles d&#39;air. Ne tapez pas sur le dessus de la structure de canal car cela pourrait provoquer des micropads de s&#39;attacher à la vitre de protection ainsi. </li><li> Placez la configuration microfluidique nouvellement faite sur une plaque chauffante à 100 ° C pendant 60 min. Testez la force de la liaison entre le couvercle en verre et puce PDMS en essayant de soulever les bords de la puce PDMS légèrement. Lorsque le bloc PDMS ne peut être levée à partir de la surface du verre, la liaison est réussi et la puce est prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Préparation de la puce pour portable Chargement en cours Défaillance d&#39;un dispositif microfluidique peut potentiellement provoquer des fuites de fluide dans le microscope. Pour éviter cela, il est consultatif d&#39;utiliser un support de métal et / ou sceller les côtés de la puce où le PDMS rencontre le verre avec vernis ou de colle époxy. Cela empêche les fuites de fluide dans le cas où la puce PDMS n&#39;est pas lié assez bien pour le verre de protection. Aussi le tubeconnexions peuvent être fixés autour des points d&#39;insertion de la même manière à éviter toute fuite de fluide. Un capteur d&#39;eau fait maison qui éteint la pompe seringue en cas de fuite peut être utilisé comme une mesure de sécurité supplémentaire. Dessins du support métallique spécialement conçu pour la puce microfluidique peuvent être obtenus auprès des auteurs. <ol><li> Placer la puce microfluidique dans le support en métal, avec un gel de silicone entre la vitre de la puce et les parties métalliques du support pour créer un joint étanche à l&#39;eau. Visser les écrous doucement, pour ne pas briser le verre. </li><li> Connecter des tubes minces (environ 5 à 15 cm de long) vers le canal latéral et le canal de sortie de la puce. L&#39;utilisation de la pince, il est facile d&#39;insérer le tube dans les trous perforés. </li><li> Remplir une seringue de 50 ml Luer-Lok avec un milieu de culture, enlever l&#39;air de la seringue et le connecter de manière séquentielle à un filtre de seringue, un talon Luer de calibre 20, un gros tube court (environ 2 cm de long) et un tube mince. Assurez-vous que la baignoire mincee est suffisamment longue pour couvrir la distance entre la pompe à seringue et la platine du microscope. </li><li> Placer la seringue dans la pompe à seringue, l&#39;avance rapide de la pompe jusqu&#39;à ce que le tube mince est entièrement remplie de fluide. </li><li> Poussez le tube mince relié à la seringue dans le canal d&#39;entrée de la puce et de laisser le débit moyen à travers la puce à 10 pi / min (figure 2B). Recueillir le moyen de quitter la puce (par exemple dans une boîte de Pétri). Le milieu sera épuisé par l&#39;intermédiaire du canal latéral à cause de la différence de résistance entre la dure-Tag fait grand canal latéral et le canal de sortie. </li><li> Placez la puce à l&#39;étape de microscope et mettre l&#39;accent sur le microscope sur les pads. </li></ol> L&#39;utilisation d&#39;objectifs à immersion d&#39;huile est préférable à celle des objectifs à immersion de l&#39;eau parce que l&#39;huile ne sèche pas sur le temps long de l&#39;expérience. Selon le microscope qu&#39;il pourrait y avoir des problèmes avec maintien de la fOCUS pendant les premières heures de l&#39;expérience. Il est donc conseillé de laisser la puce pendant une à deux heures dans la platine du microscope afin qu&#39;il puisse s&#39;installer avant que les cellules de chargement et de commencer l&#39;expérience. 4. Chargement des cellules de levure dans la puce microfluidique <ol><li> Connectez un ml Luer seringue à embout 5 à un talon Luer de calibre 20 et un tube épais (environ 3 cm). </li><li> Prélever un échantillon de la culture cellulaire doit être chargé dans la puce. </li></ol> Le nombre de cellules le plus pratique pour le chargement est entre 1-5 x 10 6 cellules par ml. Cultures avec le nombre de cellules plus élevées doivent être dilués avant le chargement. Lorsque la culture de cellules sur YPD, l&#39;efficacité de chargement de la cellule peuvent être améliorés de nombreuses fois si les cellules sont d&#39;abord lavées et remises en suspension avec dans un milieu minimal contenant un pourcentage de glucose similaire avant le chargement. Pendant le fonctionnement de la puce, milieu YPD peut de nouveau être utilisé en toute sécurité. <ol start="3"><li> Charge d&#39;environ 1 ml de la suspension cellulaire dans ee seringue et retirer tout l&#39;air de la seringue. </li><li> Diminuer le débit de la pompe à seringue à 0,5 ul / min. Le faible débit et continue appliquée par la pompe de seringue pendant le chargement (à l&#39;étape 4.5) va pousser des cellules non attachées par l&#39;intermédiaire de la chaîne latérale (figure 2C). </li><li> Raccorder la seringue contenant la suspension cellulaire sur le tube de la voie de sortie. Charger les cellules en appuyant sur le piston de la seringue en douceur. Respecter les cellules entrent et s&#39;installer sous les micropads via l&#39;oculaire ou via l&#39;écran de l&#39;ordinateur. </li><li> Maintenir la pression sur le piston jusqu&#39;à ce que suffisamment de cellules s&#39;installent sous les patins. La charge optimale est de 1-3 cellules par bloc. Comme les cellules se déposent sous les patins au hasard, il est assez fréquent que quelques blocs ne contiennent pas de cellules et d&#39;autres blocs sont complètement remplis de cellules. </li><li> Déconnecter la seringue utilisée pour le chargement de la pile et le tube épais qui lui est connecté dans le mince tube du canal de sortie, rincer le CH latéraleAnnel pour un couple de minutes à des débits plus élevés (10 pi / min) pour éliminer les bulles d&#39;air et / ou des cellules qui n&#39;ont pas encore sortent de la puce (figure 2B). Si les cellules ne sont pas retirés du canal latéral, ils peuvent commencer à croître dans le canal latéral et interférer avec l&#39;expérience plus tard. </li><li> Mettre le débit de la pompe de la seringue vers le bas à 0,5 ul / min et de fermer le canal de côté large en le connectant à un tube d&#39;épaisseur (environ 5 cm de long) contenant un connecteur de cathéter à son extrémité (figure 2D). </li><li> Augmenter le débit à un débit d&#39;écoulement final de 5.1 pi / min. Les débits peuvent varier en fonction du fluide et de la souche de levure. </li><li> Lancer un film avec les réglages du microscope et de la caméra appropriés pour le but de l&#39;expérience. S&#39;assurer que la vitesse de la platine du microscope est réglé sur une vitesse faible que l&#39;huile peut suivre. Pour la détermination de la durée de vie réplicative, les cellules d&#39;image toutes les 10 min. Pour protéger les cellules contre les infimes quantités de lumière UV émis par l&#39;halogènelampe, qui est utilisé lors de l&#39;acquisition DIC, il est recommandé de placer un filtre UV supplémentaire dans le trajet de la lumière. Lorsque vous utilisez la microscopie à fluorescence, il est préférable d&#39;image, les cellules moins fréquemment (par exemple toutes les 20 minutes) pour éviter les effets phototoxiques. L&#39;expérience est terminée lorsque toutes les cellules chargées au début de l&#39;expérience sont morts, qui dans des conditions normales peut prendre jusqu&#39;à 5 jours. Il est recommandé de vérifier régulièrement la mise au point des images lors de l&#39;expérience et si nécessaire ajuster. </li></ol>

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B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La méthode décrite ici microfluidique est un outil important de roman en recherche sur le vieillissement, car elle permet la production simple et automatisée de levure réplicatif données de durée de vie en combinaison avec l&#39;imagerie en continu à haute résolution. Ces attributs sont les principales améliorations par rapport aux possibilités expérimentales de la méthode de dissection classique, mais il ya quelques limites de la méthode qui doit être pris en compte. Notez que...

Bourgeonnement levure est un organisme modèle important pour recherche sur le vieillissement 1. Jusqu&#39;à une date récente étude réplicative vieillissement des cellules de levure a été un processus laborieux nécessitant une méthode de dissection, dans lequel chaque bourgeon a été enlevé manuellement à partir de la cellule mère 2,3. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment présenté une configuration microfluidique roman en mesure de suivre les cellules mères individuels tout au long de leur durée de vie 4. Dans notre puce microfluidique, les cellules de levure sont piégées sous micropads gazeuses à base d&#39;élastomère (voir Figure 1). Un flux continu de milieu emporte cellules filles nouvellement formés et fournit les cellules avec des nutriments frais. Dans une expérience unique, jusqu&#39;à 50 cellules mères peuvent être contrôlés de manière entièrement automatique pendant toute leur durée de vie réplicative. En raison des excellentes propriétés optiques de la puce microfluidique, il est possible de surveiller simultanément les différents aspects de la biologie de la cellule de levure (par exemple, </em&gt; en utilisant des protéines fluorescentes). Par rapport à la méthode de dissection classique, la configuration microfluidique offre des avantages substantiels. Elle assure un environnement déterminée et constante pendant toute l&#39;expérience de vieillissement. Il ne nécessite aucun équipement spécialisé coûteux et peut être exécuté sur n&#39;importe quel microscope équipé d&#39;orientation automatisé et des capacités time-lapse ainsi que de contrôle de température pour la culture cellulaire. La production et le fonctionnement des puces microfluidiques peuvent être appris en quelques jours. En outre, les cellules peuvent être chargés directement à partir d&#39;une culture en croissance exponentielle, un avantage sur une autre méthode microfluidique récemment publié 5, qui nécessite biotinylation des cellules mères. Une Combiné avec imagerie à haute résolution, la méthode décrite ici peut être utilisé pour mesurer des changements progressifs dans la morphologie cellulaire, l&#39;expression de protéines et de localisation au cours de la levure du vieillissement d&#39;une manière sans précédent. La capacité desuivi à long terme de cellules individuelles offre également des possibilités uniques pour l&#39;étude du cycle cellulaire de la levure. Cette méthode a récemment été optimisée pour enlever la biotinylation du protocole 16, qui a été publié alors que ce manuscrit était à l&#39;examen.

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 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;une configuration microfluidique simple, dans lequel les cellules de levure bourgeonnante simples peuvent être suivis tout au long de leur durée de vie. La puce microfluidique exploite la différence de taille entre les cellules de la mère et la fille en utilisant un tableau de micropads. Lors du chargement, les cellules sont piégées en dessous de ces micropads, parce que la distance entre le Micropad et le verre de couverture est similaire au diamètre d&#39;une cellule de levure (3-4 pm). Après la procédure de chargement, le milieu de culture est constamment balayé par la puce, ce qui non seulement crée un environnement constant et défini tout au long de l&#39;expérience, mais aussi de rincer les cellules filles émergents, qui ne sont pas retenues sous les patins en raison de leur petite taille. La configuration conserve les cellules mères si efficacement que dans une seule expérience jusqu&#39;à 50 cellules individuelles peuvent être surveillés de façon entièrement automatisée pour 5 jours ou, le cas échéant, plus longtemps. En outre, les excellentes propriétés optiques de la puce permettent élevéImagerie de résolution des cellules au cours de la totalité du processus de vieillissement.

Dans ce protocole, les cellules sont chargées dans la puce microfluidique directement à partir de la culture à mi-exponentielle. Pour déterminer si la répartition par âge des cellules piégées dans la puce microfluidique est similaire à celle de la culture avant le chargement, les cellules ont été colorées avec agglutinin de blé conjugué au FITC (WGA-FITC) pour visualiser les cicatrices de bourgeon. Comme on peut le voir dans la figure 3, le piégeage de cellules dans les micropads de la pu...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Nous décrivons ici le fonctionnement d&#39;un dispositif microfluidique qui permet l&#39;imagerie microscopique continu et à haute résolution de cellules de levure en herbe simples lors de leur réplication complète et / ou chronologique durée de vie.

Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K vues.  University of Groningen. Nous décrivons ici le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui permet l'imagerie microscopique continu et à haute résolution de cellules de levure en herbe simples lors de leur réplication complète et / ou chronologique durée de vie.

Vidéo: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Recherche

Bio-ingénierie

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Règlement des éléments nutritifs par l&#39;alimentation continue pour l&#39;expansion à grande échelle de cellules de mammifères en Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

Haute résolution en utilisant deux Modes de Jet électrohydrodynamique le Patterning : Drop on Demand et contigu électrofilage

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Haute résolution Patterned Biofilm dépôts en utilisant pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imagerie à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes sous contrainte de traction uniaxiale

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...