Les auteurs tiennent à remercier Amanda Tardo, Dr Mostafa Bouljihad, Stéphanie Feely, Carol Coyne, le Dr Erin Ribka, le Dr Pete Didier et Dorothy Kuebler pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-DK076653 et 3R01-02S1-DK076653 à KS et la subvention de fonctionnement de base de l&#39;TNPRC RR000164.

1. Collecte des échantillon de biopsie cutanée <ol><li> Avant de biopsie cutanée procédure, anesthésier les animaux par voie intramusculaire avec 2,5 mg / kg de chlorhydrate de tilétamine et le mélange de chlorhydrate zolazépam télazol (Fort Dodge Santé Animale, Fort Dodge, IA). Surveiller les animaux de l&#39;administration de l&#39;anesthésique jusqu&#39;au décubitus puis retirer de leur enclos. </li><li> Enlever les poils de la zone de la peau d&#39;intérêt en utilisant une Oster Golden A5 tondeuse vétérinaire Single Speed ​​avec une taille de 40 lames (Oster Professional Products, McMinnville, TN) et aseptique de préparer avec une alternance de Betadine scrub et l&#39;alcool. Fixez un drapé fenêtrée stérile sur le site choisi biopsie. </li><li> En utilisant une technique stérile, placer un 4,0 mm Miltex punch instrument de biopsie cutanée (Miltex, York, Pennsylvanie) contre la peau tout en tournant l&#39;appareil de 180 degrés dans le sens anti-horaire et avec une légère pression jusqu&#39;à ce que la biopsie des transects à travers les couches dermiques dans le ti-cutanéeUMÉRO. Retirer l&#39;échantillon de biopsie et de saisir la partie sectionnée de la peau avec une pince et libre du tissu sous-cutané. </li><li> Fermer le défaut de peau avec des sutures en nylon 3-0 attachée à une aiguille 3 / 8 cercle coupe (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical Limited, Berkshire, Royaume-Uni) dans un modèle croisé. Donner à tous les animaux 0,01 chlorhydrate de buprénorphine mg / kg (Hospira, Lake Forest, IL) par voie intramusculaire pour l&#39;analgésie post-opératoire. </li></ol> 2. Le traitement des échantillons <ol><li> Travailler avec des échantillons de biopsie de peau de dermatite chronique et de contrôle sain macaques rhésus. Procurez-vous deux à trois (4 mm de diamètre) des échantillons de biopsie de chaque animal. </li><li> Fixer le premier échantillon dans le formol zinc (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) pendant 24 heures, laver à l&#39;eau pendant 30 min, laver rapidement à l&#39;éthanol 70%, et le placer dans la préparation des tissus ASP300 Leica (Leica Microsystems Inc , Buffalo Grove, KS), où le tissu est déshydraté avec des notes ascendantes de 70%, 80%, 95% et 100% d&#39;éthanol 48minutes chacune (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), suivi par deux changements de xylène (Fisher). </li><li> Intégrer dans les médias de paraffine (Fisher) pour stockage à long terme à température ambiante. Place à-20oC pendant 20 minutes avant la coupe. Préparer 6 sections um aide d&#39;un microtome rotatif (HM325, Microm international, Waldorf, Allemagne). Placez sections sur des lames chargées (Fisher) et l&#39;air sec à 60 ° C la nuit. Colorer à l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) méthode standard (décrit ci-dessous). </li><li> Fix deuxième échantillon dans du paraformaldéhyde 2% (USB Corp, Cleveland, OH) pendant 30 min à température ambiante, laver trois fois en tampon phosphate salin (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), dans 30% de sucrose (Fisher) pour 4 heures, et d&#39;intégrer dans un milieu de congélation OCT (Sakura Finetek, Torrence, CA). Conserver à-80oC pendant 20 minutes avant la coupe. Préparer 15 sections um utilisant le cryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. Coloration H &amp; E <ol><li> Déparaffiner intégrersections du DED à travers trois changements de xylènes (Fisher) et réhydrater travers éthanols graduée: trois changements de 100%, deux changements de 95%, un changement de 80% et d&#39;eau distillée, à 2 min chacune. </li><li> Colorer à l&#39;hématoxyline (Richard-Allan scientifique, Kalamazoo, MI) pendant une minute et suivre par un bref lavage à l&#39;eau courante. </li><li> Contre l&#39;éosine (Sigma) pendant 6 min. </li><li> Déshydrater tissus colorés grâce à 95% et d&#39;éthanol absolu, deux changements de 2 minutes chacun, puis clair dans trois changements de xylènes, à 3 min chacune. </li><li> Lamelle en utilisant le mont Cytoseal milieu de montage (Richard-Allan scientifique) sur le H &amp; E-sections de tissus colorés. </li></ol> 4. L&#39;évaluation histopathologique Inspectez H &amp; E des sections colorées biopsie de la peau sous un microscope optique en utilisant les 4 - grossissement 40x et d&#39;un microscope Leica avec une caméra SPOT Digital Insight (Digital Instruments Inc, au Michigan, Etats-Unis). 5. Immunofluorescence staiNing <ol><li> Travailler avec des sections de peau OCT-embarqué pour la coloration par immunofluorescence. Avant coloration, faire tremper pendant 20 min dans du PBS contenant 0,2% de la peau de gélatine de poisson (FSG, Sigma) à 0,1% Triton X-100 (Sigma) pour enlever les PTOM et pour perméabiliser les tissus. </li><li> Après le lavage des lames, incuber avec 10% sérum normal de chèvre (NGS, Sigma), dilués dans du PBS-FSG pendant 1 heure, à température ambiante, dans une chambre de diapositives humidifié. </li><li> Afin de visualiser les dépôts d&#39;IgA et d&#39;anticorps tTG2, incuber des diapositives avec des IgA anti-rhésus et tTG2 anticorps primaires, dilués dans 10% NGS-PBS-FSG pendant 1 heure. </li><li> Laver avec du PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) pendant 10 min, suivie par PBS-FSG pendant 10 min. </li><li> Incuber avec du secondaire, l&#39;isotype des anticorps spécifiques marqués avec un fluorochrome Alexa Fluor 488 (vert), 568 (rouge) ou 633 (bleu) (Molecular Probes, Invitrogen) à 1:1000 dilution. Utiliser le colorant ToPro-3 pour visualiser l&#39;ADN nucléaire. Utilisez les 10% de NGS-PBS-FSG comme diluant des anticorps. </li><li> Utiliser la solution anti-trempe (Sigma) pour monter les coupes de tissu taché. </li></ol> 6. Imagerie confocale Effectuer l&#39;imagerie avec un Leica TCS SP2 microscope confocal à balayage laser vrai (Leica, Wetzlar, Allemagne) équipé de trois lasers (six lignes d&#39;excitation disponibles): un laser argon-krypton à 488 nm (vert), un laser à krypton à 568 nm ( rouge) et un laser hélium-néon à 633 nm (bleu), qui couvrent du visible à l&#39;extrémité rouge du spectre. Enregistrement de contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) des images pour l&#39;évaluation de la non-étiquetés architecture tissulaire. 7. Les résultats représentatifs Un exemple de reconnaissance positive de GTE à la fois par tTG2 et IgA est montré dans la Fig. 3A. Conformément à la situation chez les patients humains et en raison de la prévalence beaucoup plus faible de DH-comme la dermatite que les CD-comme la sensibilité au gluten également dans les macaques rhésus, la plupart des échantillons de biopsie de peau sont censés show la réaction positive avec les anticorps tTG2 mais sans la présence d&#39;IgA tTG2 + + double des cellules positives (Fig. 4). Ces cas DH-indépendantes, y compris les cas dermatites d&#39;origine microbienne, va révéler certaines cellules mono-positif + IgA dispersés sous l&#39;épithélium, mais pas de chevauchement spectral entre l&#39;tTG2 et IgA marqué marqueurs (fig. 3B et 4). Par conséquent, il est important de maintenir l&#39;ordre des procédures d&#39;essai proposées, à commencer par l&#39;examen clinique (Fig. 1), suivie par l&#39;évaluation histopathologique (Fig. 2), et seulement si aucune autre, la dermatite causant plus fréquente des agents peuvent être identifiés, confocale examen au microscope des biopsies de peau colorée pour tTG2 et IgA est justifiée. Des évaluations cliniques et / ou histopathologique ne sont pas suffisants pour le diagnostic positif de cette condition. Dans ces cas lorsque vous double-positifs (+ tTG2 IgA +) les cellules sont identifiés autour de la zone des papilles dermiques, le diagnostic dermatite DH-like peut être délivré. Dans de tels cas, le retrait du glutenet l&#39;administration du régime sans gluten est recommandé afin de soulager les symptômes dermatite. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Région inguinale du EM96 macaque avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 5 semaines. Réintroduction du gluten a coïncidé avec la réapparition de la dermatite (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Coloration HE du EM96 biopsies cutanées macaque collectées avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 9 semaines. A: L&#39;épithélium est épaissi (7-15 couches de cellules épithéliales) avec une croûte épaisse superficielle de cellules infiltrées par des neutrophiles hyperkératosiques dégénérer. Les neutrophiles apparaissent aussi à l&#39;intérieur de l&#39;épithélium et sont mélangés avec un nombre modéré de lymphocytes, de plasmocytes et histiocytes autour des annexes dans la partie supérieure du derme. B: Certains hyperkeratTSO est encore présent, épaisseur de l&#39;épithélium est normalisé (4-7 couches) avec infiltration lymphoplasmocytaire minimal dans la partie supérieure du derme. C: Normal peau abdominale à partir FR56 macaque, sans infiltration lymphoplasmocytaire, est inclus à titre de comparaison. Grossissement 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Images de microscopie confocale du EM96 biopsies cutanées macaque collectées avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 9 semaines. A: coloration des IgA (vert), tTG2 (rouge) et ToPro-3 marqueurs ADN nucléaire (bleu). Co-localisation des IgA et tTG2 apparaît en jaune autour de la zone d&#39;papilae cutanée. B: échantillon de peau prise après 9 semaines de régime sans gluten ne montre aucun IgA dans l&#39;épithélium alors que certains sous-épithéliale IgA est encore présent (vert), tTG2 (rouge) et ToPro-3 marqueurs ADN nucléaire (bleu). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. </strong&gt; les images de microscopie confocale du GI24 biopsies cutanées macaque rhésus recueillies tout animal a été présentant les symptômes de la chronique (DH-indépendantes) dermatite. La coloration des IgA est en vert, en rouge et tTG2 ToPro-3 des marqueurs d&#39;ADN nucléaire est en bleu. Les cellules + tTG2 sont présents à l&#39;intérieur de l&#39;épithélium, quelques cellules IgA + sous l&#39;épithélium, alors qu&#39;aucun chevauchement important entre les marqueurs spectraux rouge et le vert est vu. <table border="1"><tbody><tr><td> Tag animaux </td><td> Sex [M / F] </td><td> Âge [Ans] </td><td> Les symptômes cliniques </td><td> Plasma tTG2 anticorps </td><td> Alimentation [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> Saine </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> Sains, la diarrhée occasionnelle </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> Une diarrhée chronique idiopathique </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5,0 </td><td> Dermatite chronique </td><td> + / - (Borderline) </td><td> 1 et 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> Dermatite chronique </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. TNPRC macaques rhésus utilisées pour la collecte des biopsies de la peau * Alimentation 1 - régulière singe Chow (contenant du gluten); régime 2 - régime sans gluten

<ol>
	<li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+the+adaptive,+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients.">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li><li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+epidemiology,+pathogenesis,+diagnosis,+and+nutritional+management.">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li><li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+transglutaminase+(TGase+3)+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis.">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li><li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet.">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li><li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques.">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li><li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+&#x03B1;-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques.">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from &#x03B1;-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li><li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+from+pathogenesis+to+novel+therapies.">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li><li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response.">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li><li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis.">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Notre nouvellement établie non-humain modèle primate de la sensibilité au gluten a été utilisée récemment pour étudier les modifications de la perméabilité intestinale déclenchée par gluten 5,6. Plasma tTG2 anticorps ainsi que intestinale tTG2 + IgA + dépôts ont été détectés dans certains macaques sensible au gluten. Depuis que nous avons récemment identifié rares incidents de dermatite idiopathique dans la colonie de macaques rhésus, où aucune habitude (infectieuses / métabolique) éti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue de produit / code </td><td> Remarque </td></tr><tr><td> Anti-Human IgA-FITC * </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 dilution de travail </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 dilution de travail </td></tr><tr><td> Anti-Mouse IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A-21124 </td><td> 1:1000 dilution de travail </td></tr><tr><td> ToPro-3 *** sonde ADN </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T-3605 </td><td> 1:1000 dilution de travail </td></tr><tr><td> Zinc formol (Z-fix) </td><td> Anatech Ltd, Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Gel octobre Medium </td><td> Sakura Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal montage Medium </td><td> Richard-Allan scientifique, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Trempe Solution </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (Suture en nylon) </td><td> Ethicon, Johnson &amp; Johnson, Berkshire, Royaume-Uni </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex punch biopsie cutanée Instrument </td><td> Miltex, York, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Oster Golden A5 tondeuse simple Vétérinaire de vitesse avec une taille de 40 lames </td><td> Produits Oster, McMinnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Préparateurs de tissus Leica </td><td> Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> Microtome rotatif </td><td> Microm international, Waldorf, Allemagne </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica, Wetzlar, Allemagne </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * Isothiocyanate de fluorescéine ** Secondaire (Alexa Fluor 568-conjugué) anticorps utilisé après tTG2 anticorps primaire ** Dye

recognition of epidermal transglutaminase by iga and tissue transglutaminase 2 antibodies in a rare case of rhesus dermatitis

2 transglutaminase tissulaire (tTG2) est une enzyme digestive intestinale qui deamidates déjà partiellement digérés alimentaires peptides de gluten par exemple la gliadine. Chez les individus génétiquement prédisposés, tTG2 déclenche les réponses auto-immune qui se caractérise par la production d&#39;anticorps et leur tTG2 dépôt direct en 1,2 mur de l&#39;intestin grêle. La présence de ces anticorps constitue l&#39;une des caractéristiques majeures de la maladie cœliaque (MC). Epidermal transglutaminase (ETG) est un autre membre de la famille transglutaminase qui peut également fonctionner comme un autoantigène dans une petite minorité de patients CD. Dans ces cas relativement rares, ETG déclenche une réaction auto-immune (une éruption cutanée) cliniquement connu comme la dermatite herpétiforme (DH). Bien que le mécanisme exact de la pathogenèse de CD et de DH n&#39;est pas bien comprise, il est connu que tTG2 et ETG épitopes antigéniques part qui peut être reconnue par les anticorps du sérum de patients atteints de CD et de DH 3,4 fois. (Macaca mulatta) atteints de dermatite (Tableau 1, Fig. 1 et 2) a été utilisée pour étudier les tissus affectés. Chez un animal (EM96) un chevauchement spectral des anticorps IgA et tTG2 (Fig. 3) a été démontrée. La présence de doubles-positifs tTG2 + cellules + IgA a été concentré dans l&#39;épiderme en profondeur, autour de la papille dermique. Ceci est cohérent avec les lésions décrites chez des patients DH 3. Lorsque EM96 a été placé sur un régime sans gluten, la dermatite, ainsi que tTG2 + IgA + dépôts ont disparu et ne sont plus détectables (fig. 1-3). Dermatite réapparu cependant, basée sur la réintroduction du gluten dans EM96 (non représentée). En d&#39;autres macaques, y compris les animaux sans lien avec la dermatite, l&#39;tTG2 + IgA + dépôts n&#39;ont pas été détectés. Régime sans gluten dépendant rémission de dermatite dans EM96 avec présence de tTG2 + IgA + cellules de sa peau suggèrent une auto-immunes, comme le DH-mécanisme pour le développement de cette condition. C&#39;est le premier rapport du DH-comme la dermatite de quelque primate non humain.

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

La dermatite herpétiforme (DH) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par une réaction auto-immune entre les IgA et épidermique transglutaminase (GTE). DH se développe dans une très petite partie des patients sensibles au gluten et / ou cœliaque. Les résultats de cette étude indiquent que la DH peut aussi se développer chez un hôte singe rhésus avec des symptômes de la dermatite idiopathique.

La reconnaissance de la transglutaminase épidermique par les IgA et Tissue Transglutaminase 2 anticorps dans un cas rare de Rhésus Dermatite

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

24.4K vues.  Tulane National Primate Research Center. La dermatite herpétiforme (DH) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par une réaction auto-immune entre les IgA et épidermique transglutaminase (GTE). DH se développe dans une très petite partie des patients sensibles au gluten et / ou cœliaque. Les résultats de cette étude indiquent que la DH peut aussi se développer chez un hôte singe rhésus avec des symptômes de la dermatite idiopathique.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Recherche

Immunologie et infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

Technologie IgY: Extraction d&#39;anticorps de jaune d&#39;œuf de poulet par polyéthylène glycol (PEG) Précipitations

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research. 
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&amp;#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (V&#954;) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

La génération d&#39;anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Analyse de l&#39;immunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus<sup&gt; +</sup&gt; T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Effets de l’exposition de formaldéhyde à un modèle de Rat de la dermatite atopique induite par le traitement néonatale capsaïcine

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...