L’utilisation de la microinjection pour fournir des constructions d’ADN dans strongyloides nous permet de générer des knockouts et des transgéniques, qui peuvent être utilisés pour étudier comment ces vers se développent, naviguent dans leur environnement et parasitent les hôtes. Jusqu’à présent, c’est la seule technique efficace pour générer des knockouts et des transgéniques chez ces parasites. Un jour avant la microinjection, ajouter 180 microlitres de la solution d’agarose sur un bordereau de couverture à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, puis déposer immédiatement un deuxième glissement de couvercle sur le dessus pour aplatir l’agarose dans un tampon mince.
Après 5 à 10 secondes, retirez le glissement du couvercle supérieur en faisant glisser les deux et déterminez sur quelle glissière se trouve le coussinet de gélose et posez-le face vers le haut. Ensuite, sélectionnez un minuscule morceau de fragment de verre à partir d’un couvercle cassé et, à l’aide d’une pince, appuyez doucement dans la gélose près du bord supérieur du tampon. Le jour de la microinjection, tapissez le support Baermann, qui est un tamis fabriqué à partir de deux anneaux en plastique avec deux couches de filet de tuile en nylon fixé entre eux avec trois morceaux de tissu de laboratoire qui se chevauchent.
Ajoutez ensuite le mélange fécal-charbon de bois au support Baermann. Ensuite, placez le support Baermann avec le mélange fécal-charbon de bois dans l’entonnoir, pliez les morceaux de tissus autour du mélange fécal-charbon de bois et ajoutez suffisamment d’eau pour submerger la majeure partie du charbon fécal. Ensuite, recouvrez l’entonnoir avec un couvercle de boîte de Petri en plastique de 15 centimètres pour contenir l’odeur et étiquetez l’entonnoir au besoin.
Après une à deux heures, tenez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres sous le tube en caoutchouc au bas de l’entonnoir et ouvrez soigneusement les pinces au fond pour distribuer 30 à 40 millilitres d’eau contenant des vers dans le tube de 50 millilitres. Alors. transférer 15 millilitres d’eau Baermann contenant les vers dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Faites tourner le tube, retirez jusqu’à 13 millilitres du surnageant et jetez-le dans un récipient à déchets liquides avec de l’iode pour tuer les vers.
Après avoir collecté tous les vers, inspectez la pastille de vers au fond du tube. Si aucun ver n’est visible, attendez une à deux heures, puis collectez d’autres vers de l’appareil Baermann. Transférez les vers dans le moins d’eau possible dans une plaque de milieu de croissance de nématode de six centimètres à 2% avec une pelouse d’E. coli HB101 et utilisez cette plaque comme plaque source pour la microinjection.
Sous le microscope à dissection, recouvrez le tesson de verre sur le couvercle du tampon de micro-injection avec de l’huile d’halocarbure à l’aide d’un pic à ver de platine standard. Ensuite, placez le couvercle du tampon de micro-injection sur la lunette de micro-injection et localisez le tesson de verre recouvert d’huile. Alignez le tesson de verre de manière à ce qu’un bord soit perpendiculaire à la direction de l’aiguille pour servir de surface utilisée pour casser l’aiguille.
Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, assurez-vous que l’aiguille n’a pas de bulles ou de débris dans l’arbre conique, puis fixez l’aiguille de 1 à 1,5 centimètre dans le support sous pression. Positionnez la pointe de l’aiguille au centre du champ de vision du microscope à l’œil nu et sous un faible grossissement, positionnez la pointe de l’aiguille dans le champ de vision perpendiculairement au côté du tesson de verre. Ensuite, passez à un grossissement plus élevé et alignez la pointe de l’aiguille avec le bord du verre, près, mais sans le toucher.
Ensuite, pour casser la pointe de l’aiguille et permettre à l’écoulement du liquide, tapotez doucement l’aiguille sur le côté du morceau de verre tout en appliquant une pression continue du gaz. Une fois que le liquide commence à couler, vérifiez la forme de la pointe et assurez-vous qu’elle est tranchante avec un liquide qui s’écoule facilement. Lorsque le liquide s’écoule bien de l’aiguille, déplacez la lame de micro-injection vers la lunette de dissection et ajoutez un à deux microlitres d’huile d’halocarbure sur le tampon de gélose pour le placement des vers.
Transférer 20 à 30 strongyloïdes jeunes adultes sur une plaque de milieu de croissance de nématodes à 2 % sans bactéries pendant au moins cinq minutes pour éliminer les bactéries de surface en excès et sélectionner des vers uniques pour la microinjection. Ajoutez plus de vers à la plaque au besoin lors de l’injection. En utilisant une petite quantité d’huile d’halocarbure sur un pic à vers, sélectionnez une jeune femelle adulte Strongyloides avec un à quatre œufs dans sa gonade de la plaque sans bactéries et transférez le ver dans une petite goutte d’huile sur le tampon de gélose.
À l’aide du pic à ver, positionnez doucement le ver de sorte qu’il ne soit pas enroulé et que la gonade soit visible et facile d’accès. Ensuite, positionnez le ver dans le champ de vision du microscope à micro-injection, en vous assurant que la gonade est du même côté que l’aiguille et positionnée de manière à ce que l’aiguille entre en contact avec la gonade à un léger angle. Ensuite, amenez la pointe de l’aiguille sur le côté du ver dans le même plan focal.
Ensuite, en visant le bras de la gonade près du milieu du ver, insérez doucement l’aiguille dans la gonade à l’aide d’un micro-injecteur. Appliquez immédiatement une pression sur l’aiguille pour remplir doucement tout le bras de la gonade avec la solution d’ADN. Une fois que suffisamment de liquide a été injecté, retirez l’aiguille et observez que la plaie se ferme.
Répétez la procédure avec l’autre bras de la gonade, si elle est visible. Une fois l’injection terminée, vérifiez rapidement que l’aiguille n’est pas obstruée en appliquant une pression avec la pointe de l’aiguille sur le tampon de gélose, puis transférez la lame avec le ver injecté au microscope à dissection. Pour récupérer le ver injecté, placez d’abord quelques gouttes de solution saline tamponnée par le ver sur le ver pour le faire flotter hors du tampon de gélose.
Ensuite, collectez une petite quantité de bactéries sur un pic à vers et touchez le ver avec les bactéries adhérentes pour l’éliminer du liquide. Transférez doucement le ver sur la plaque de récupération. Pour les expériences comportementales, transférez 20 à 30 larves sur une plaque de milieu de croissance de nématodes à 2% avec une pelouse épaisse de bactéries HB101 et, sous un microscope à dissection par fluorescence, identifiez les larves exprimant le transgène d’intérêt.
Ensuite, à l’aide d’un pic à vers, sélectionnez les larves transgéniques et placez-les dans un petit verre de montre avec une solution saline tamponnée par les vers. Pour la microscopie, à l’aide d’une lame de rasoir, marquez une grille sur le fond en plastique d’une plaque de chimiotaxie de 10 centimètres pour suivre facilement l’emplacement des vers sur la plaque. Ensuite, ajoutez trois microlitres de larves dans une solution saline tamponnée par les vers dans un carré de la grille, en remplissant autant de carrés que nécessaire.
Ajoutez ensuite des gouttes de 15 à 20 microlitres de nicotine à 1% dans l’eau aux gouttes de ver. Après quatre minutes, lorsque les vers sont paralysés, filtrez-les à l’aide d’un microscope à dissection à fluorescence. Les larves transgéniques de Strongyloides stercolaris avec un modèle d’expression de l’acte-2 mRFPmars incomplet et complet sont montrées ici.
L’expression inégale dans le muscle de la paroi corporelle est plus fréquente lorsque le transgène n’est pas intégré dans le génome. En revanche, une expression cohérente dans tout le muscle de la paroi corporelle indique souvent que le transgène s’est intégré dans le génome. L’étape clé consiste à positionner l’aiguille dans le même plan de mise au point que la gonade pour s’assurer que l’ADN est injecté dans la gonade et sera incorporé dans les œufs en développement.
Le développement de cette technique a permis d’étudier la fonction des gènes chez les nématodes parasites, ce qui fournit de nouvelles informations sur les mécanismes du parasitisme et les interactions hôte-parasite.
