Le travail dans le laboratoire SM est soutenu par un Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Lors de la surveillance et du cytosquelette autophagy in vitro en utilisant des cellules de culture tissulaire, les protocoles décrits dans les sections 1 et 2 peuvent être appliqués à une grande variété de types de cellules de culture tissulaire. De plus, pour suivre autophagy (par exemple, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) et du cytosquelette (par exemple,., Queues d&#39;actine, des cages septines) dynamique, en temps réel au cours de l&#39;infection à Shigella en utilisant l&#39;imagerie en temps réel, des cellules de culture tissulaire peuvent être transfectées de manière transitoire en utilisant GFP, constructions RFP- ou CFP-marquées que précédemment décrits 7,8. Pour augmenter le pourcentage de cellules infectées par Shigella (par exemple, généralement souhaitable pour l&#39;analyse en temps réel compte tenu de Shigella qui peut envahir 5-30% des cellules HeLa à 100: 1. MOI), ajouter 400 ul directement de Shigella (DO600 = 0,3 -0,6) pour les cellules dans 2 ml de MEM (privées de sérum) et attendre au moins 1,5 après l&#39;infection h pour l&#39;entrée bactérienne suffisante, échapper à la phagosome, la réplication, aureconnaissance tophagy et septin mise en cage. Alternativement, on peut utiliser la souche de Shigella M90T AfaI qui exprime l&#39;adhésine AFAE et ont beaucoup plus élevés capacités d&#39;invasion de cellules épithéliales par rapport à la souche M90T 28. Il faut noter que la souche M90T AfaI n&#39;a pas encore été testée in vivo en utilisant le poisson zèbre. Les plaques de colonies de Shigella peuvent être conservés à 4 ° C pendant 2-3 jours et utilisées pour plusieurs expériences. Toutefois, au fil du temps, les colonies de Shigella qui ont perdu le plasmide de virulence peut aussi absorber le rouge Congo et semblent avoir conservé leur plasmide de virulence. Pour cette raison, nous recommandons d&#39;utiliser les stocks bactériennes fraîches si possible. Lors de la surveillance de la biologie cellulaire de l&#39;infection in vivo, les protocoles décrits dans les sections 3 et 4 de type sauvage utilisation AB ligne le poisson zèbre. Pour surveiller les interactions -leukocyte Shigella, lignes de poisson zèbre transgénique peuvent être utilisés, par exemple, mpx: GFP ou lyz: DsRed de visueliser neutrophiles 19,29,30 ou MPEG1: mcherry de visualiser les macrophages 19,31. Pour visualiser l&#39;autophagie in vivo, le poisson-zèbre transgénique ligne de GFP-Lc3 19,24 peut être utilisé tel que décrit dans la section 3.8. Pour perturber autophagy in vivo, la dose efficace de l&#39;oligonucléotide morpholino doit être évaluée expérimentalement sur ​​la base de son efficacité à inhiber l&#39;épissage de transcription ou une traduction en protéine. Il est conseillé de réaliser une expérience de titrage et pour confirmer l&#39;épuisement par RT-PCR (par épissure oligonucléotide morpholino) ou par SDS-PAGE (par translation oligonucléotide morpholino) 32. isolement d&#39;ARN à partir d&#39;embryons de poisson zèbre ou de larves peut être réalisée en utilisant l&#39;extraction thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme. Pour extraire des protéines à partir de larves de poisson zèbre (8 à 15 larves / tube), homogénéiser mécaniquement à l&#39;aide d&#39;un pilon dans 200 ul de tampon de lyse (Tris 1 M, 5 M de NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% octylphénol oxyde d&#39;éthylène condensate, et l&#39;inhibiteur de protéase). Tubes à centrifuger à 19 000 g à 4 ° C pendant 15 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter du tampon de Laemmli et on chauffe l&#39;échantillon à 95 ° C pendant 15 min. Lysats peuvent être stockés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire, et peuvent être évalués par Western blot comme décrit dans la section 2.3. Le poisson zèbre est un excellent modèle pour l&#39;application in vivo de médicaments. Analyse en utilisant des oligonucléotides morpholino peut être complétée avec des médicaments mis en place pour manipuler l&#39;autophagie (par exemple, la rapamycine et bafilomycine). Les larves non infectées et / ou infecté peut être traitée avec de la rapamycine (1,5 uM) ou la bafilomycine (80 nM) dilués dans E2 et du flux autophagique peut être évaluée par Western blot comme décrit dans l&#39;25,33. La conséquence de la manipulation de l&#39;autophagie sur le résultat de l&#39;infection et la survie des larves infectées peut être évaluée comme décrit dans la section 3.5. En plus d&#39;étudier cellule hôtedéterminants, in vitro et dans des protocoles in vivo peuvent être appliquées à évaluer les déterminants bactériens nécessaires à la reconnaissance de l&#39;autophagie, en utilisant des souches mutantes de bactéries qui sont différentiellement reconnus par autophagy, par ex., Shigella ΔicsA (la protéine Shigella IcsA recrute N-WASP et Arp2 / 3 pour la queue de l&#39;actine et la formation septin de la cage, en son absence, il ne peut y avoir la queue d&#39;actine, pas de cages de septines) et ShigellaΔicsB (Shigella évite la réponse autophagique par la protéine d&#39;effecteur bactérien CIPE, qui empêche le recrutement de la machinerie de l&#39;autophagie ICSA; dans son absence il peut y avoir plusieurs cages de septines, plus autophagie) 7,8. Shigella n&#39;est pas un agent pathogène naturel de poisson-zèbre et une croissance optimale à 37 ° C. Cependant, des travaux ont montré que les facteurs de virulence nécessaires pour l&#39;invasion de Shigella, échapper à la vacuole et la réplication dans le cyTosol peut être exprimé et sont fonctionnels chez les larves de poisson zèbre à 28 ° C 19. 28 ° C est la température la plus couramment utilisée pour l&#39;élevage du poisson zèbre et de la température standard pour assurer le développement de poisson zèbre normale 23. Il est frappant, les grands événements pathogènes qui conduisent à la shigellose chez les humains (par exemple, la mort des cellules macrophages, l&#39;invasion et la multiplication dans les cellules épithéliales, la propagation de cellule à cellule, la destruction inflammatoire de l&#39;épithélium de l&#39;hôte) sont fidèlement reproduits dans le modèle de poisson zèbre des infections à Shigella 19. gènes de l&#39;autophagie et du cytosquelette sont exprimé de façon ubiquitaire et avoir un large éventail de fonctions biologiques. Des études sur souris ont montré que l&#39;autophagie essentiel huitièmes de finale de 26 ou septines gènes 5 sont embryonnaire mortelle, et il est probable que certains de ces gènes sera également essentielle pour le développement du poisson zèbre (bien que ce problème peut être réduit par le fait que le poisson zèbre ont plusieursgènes paralogues 33). Si c&#39;est le cas, il existe plusieurs alternatives pour surmonter ce problème, y compris (i) l&#39;utilisation de réactifs pharmacologiques pour réguler l&#39;autophagie et le cytosquelette, (ii) morpholinos peuvent être titrés vers le bas, (iii) knock-out de gènes peut être conçu pour que cellule spécifique types, et / ou (iv) les gènes impliqués dans la reconnaissance autophagique qui ne sont pas essentiels pour le développement des animaux (par exemple., p62) peuvent être ciblés. Alors que le poisson zèbre est un système modèle idéal pour étudier l&#39;autophagie et le cytosquelette lors de l&#39;infection à Shigella, outils moléculaires sont actuellement défaut. Le champ doit générer de nouveaux outils et de l&#39;expression cellulaire spécifique d&#39;entraînement des protéines d&#39;intérêt. Pour abattre l&#39;expression des gènes de l&#39;autophagie / du cytosquelette, de nouvelles séquences morpholino sont nécessaires, et de nouvelles méthodes de l&#39;ingénierie des génomes (par exemple, TALEN, CRISPR / Cas9) peuvent également être utilisés. Dans l&#39;intervalle, plusieurs outils déjà générés pour les études humaines ou de sourispeut aussi travailler pour le poisson-zèbre. Les bactéries intracellulaires S. flexneri a émergé comme un organisme modèle exceptionnel pour aborder les questions clés de la biologie, y compris la capacité des bactéries à être reconnu par le système immunitaire de 1,2. La cellule hôte emploie septines à limiter la mobilité de S. flexneri et les cibler à l&#39;autophagie, une composante essentielle de la cellule immunité autonome 7,8. Ces observations suggèrent un nouveau cadre moléculaire pour étudier l&#39;autophagie et sa capacité à dégrader les bactéries cytosoliques. Un problème majeur est maintenant de déchiffrer complètement les événements moléculaires et cellulaires sous-jacents, et de valider ces événements analysés in vitro lors de l&#39;infection bactérienne in vivo sur des modèles animaux pertinents. A cette fin, le poisson-zèbre a été établi comme un nouvel hôte précieux pour l&#39;analyse de S. infection flexneri 19. Les interactions entre les bactéries et les cellules hôtes peuvent être visualisés à haute résolution, etle modèle de poisson zèbre devrait se révéler utile pour la compréhension de la biologie cellulaire des infections à Shigella in vivo. Larves de poisson zèbre peut être utilisé pour étudier le rôle de l&#39;autophagie des bactéries dans la défense de l&#39;hôte, et le travail a montré que que la perturbation de l&#39;autophagie peut nuire à la survie de l&#39;hôte en réponse à l&#39;infection à Shigella 19. Les observations générées à partir de l&#39;étude de Shigella, Septin mise en cage et l&#39;autophagie in vitro en utilisant des cellules de culture de tissus et in vivo à l&#39;aide de larves de poisson zèbre pourrait fournir des progrès fondamentaux dans la compréhension de défense de l&#39;hôte. Ils pourraient également suggérer le développement de nouvelles stratégies visant à lutter contre les maladies infectieuses. Un objectif essentiel de ce rapport est de donner un sens aux événements moléculaires et cellulaires analysés in vitro (c&#39;est-à-autophagie, queues d&#39;actine, Septin mise en cage) lors d&#39;une infection bactérienne in vivo dans le cadre d&#39;une entorganisme colère, en utilisant larves de poisson zèbre. Si ce n&#39;est pas familier avec la biologie et la manipulation du poisson zèbre, on peut se référer à des protocoles de profondeur pour l&#39;élevage du poisson zèbre bon 23 et analyse in vivo de l&#39;infection poisson zèbre 19,35.

Shigella flexneri, une bactérie entéro-invasive à Gram négatif, ne peut échapper à phagosomes à le cytosol, et polymériser l&#39;hôte cytosquelette d&#39;actine pour échapper à la réponse immunitaire cytosoliques et promouvoir le mouvement intra et intercellulaire 1,2. En dépit de la connaissance de la base de la motilité actine in vitro 3,4, les mécanismes qui limitent la dissémination bactérienne in vivo n&#39;ont pas été entièrement définies. Cela est essentiel pour une compréhension plus complète de l&#39;immunité innée et la défense de l&#39;hôte. Septines, une famille de protéines hautement conservées parmi les métazoaires, est la guanosine triphosphate (GTP) liant le protéines qui s&#39;assemblent en complexes hétéro-oligomériques et non polaires forment des filaments qui s&#39;associent avec les membranes cellulaires et le cytosquelette 5,6. Des travaux récents ont découvert que les cellules hôtes infectées peuvent empêcher Shigella actine motilité base par des bactéries ciblées à compartimenter autophAGY intérieur «cages de septines», révélant le premier mécanisme cellulaire qui contrecarre l&#39;actine motilité basé 7,8. Un large champ d&#39;investigation se trouve maintenant dans «la biologie de septin et infection». ensemble de Septin, induite par une variété d&#39;agents pathogènes (par exemple, la bactérie Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), peut apparaître comme une question clé dans la défense de l&#39;hôte 5,12. L&#39;autophagie, un processus de dégradation intracellulaire hautement conservée, est considéré comme un élément clé de l&#39;immunité cellulaire autonome en raison de sa capacité à fournir des bactéries cytosoliques vers le lysosome 13,14. Cependant, le rôle de l&#39;autophagie bactérienne in vivo de restreindre ou de promouvoir la réplication bactérienne reste mal comprise 15,16. Le poisson zèbre (Danio rerio) a émergé comme un modèle vertébré pour l&#39;étude des infections, car il est optiquement accessibleau stade larvaire, lorsque le système immunitaire inné est déjà fonctionnel 17,18. Des travaux récents ont caractérisé la sensibilité des larves de poisson zèbre à S. flexneri, un paradigme pour l&#39;autophagie bactérienne 15, et a utilisé le modèle d&#39;infection -zebrafish Shigella pour étudier la manipulation de l&#39;autophagie pour la thérapie antibactérienne in vivo 19. Ce rapport fournit de nouveaux outils et des analyses pour étudier S. interactions flexneri avec autophagie et le cytosquelette. Dans une première étape, les protocoles pour surveiller les interactions autophagie-cytosquelette sont décrits à l&#39;aide de l&#39;infection à Shigella lignée de cellules épithéliales humaines HeLa. Pour évaluer le rôle des interactions autophagie cytosquelette sur le processus d&#39;infection à Shigella in vitro, les méthodes pour manipuler l&#39;autophagie et les composants du cytosquelette (en utilisant siRNA ou réactifs pharmacologiques) sont fournis. De nouveaux travaux ont montré que l&#39;utilisation infection à Shigella of larves de poisson zèbre, des tests similaires peuvent être appliquées à l&#39;étude de la biologie de l&#39;infection de cellules in vivo. Protocoles de préparer et d&#39;infecter les larves de poisson zèbre sont détaillés, et d&#39;évaluer la réponse de l&#39;hôte à l&#39;infection à Shigella in vivo, des protocoles pour déterminer la survie de l&#39;hôte et de la charge bactérienne de larves infectées sont fournis. Méthodes pour surveiller le recrutement des marqueurs de septines et autophagie à Shigella (en utilisant soit les larves fixe ou vivant le poisson-zèbre) et aux méthodes de tester le rôle de ces processus in vivo [en utilisant des oligonucléotides morpholino (injectés dans 1-4 embryons au stade de cellules) ou des réactifs pharmacologiques ( ajouté directement à l&#39;eau du bain poisson zèbre)] sont également discutés. Ce programme de travail devrait fournir des indications sur les mécanismes nécessaires pour le contrôle de l&#39;infection par réponses de l&#39;hôte cytosoliques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri est un pathogène intracellulaire qui peut échapper à phagosomes pour atteindre le cytosol, et polymériser l&#39;hôte du cytosquelette d&#39;actine pour promouvoir sa motilité et la diffusion. De nouveaux travaux ont montré que les protéines impliquées dans la motilité dépendant de l&#39;actine sont également liés à l&#39;autophagie, un processus de dégradation intracellulaire crucial pour l&#39;immunité cellulaire autonome. Il est frappant, les cellules hôtes peuvent empêcher la motilité à base actine de S. flexneri la compartimentation des bactéries à l&#39;intérieur de «cages septines» et en les ciblant sur ​​l&#39;autophagie. Ces observations indiquent que une compréhension plus complète de septines, une famille de protéines de liaison au GTP filamenteux, ouvrira de nouvelles perspectives dans le processus de l&#39;autophagie. Ce rapport décrit les protocoles de surveiller les interactions autophagie cytosquelette causées par S. flexneri in vitro en utilisant des cellules de culture de tissus et in vivo en utilisant des larves de poisson zèbre. Ces protocoles permettent enquête de mechanis intracellulairesms qui contrôlent la dissémination bactérienne au niveau de l&#39;organisme moléculaire, cellulaire, et ensemble.

Lors de l&#39;infection de cellules de culture de tissus in vitro, S. flexneri peut s&#39;échapper du phagosome et envahir le cytosol. Dans le cytosol des cellules hôtes peuvent empêcher la mobilité sur la base de l&#39;actine-Shigella par un cloisonnement à l&#39;intérieur des cages de bactéries septines (Figure 1A). Les bactéries piégées par des cages de septines peuvent également être marqués par des marqueurs de autophagie p62 (figure 1B) et LC3 (Figure 1C). Ces observations mettent en évidence un nouveau mécanisme de défense de l&#39;hôte qui limite la diffusion des agents pathogènes invasifs, et révèlent aussi de nouveaux liens entre l&#39;autophagie et le cytosquelette. Il est frappant, l&#39;épuisement des marqueurs de l&#39;autophagie réduit considérablement septin mise en cage de bactéries (figure 2A), et les travaux ont également montré que l&#39;épuisement des septin cage réduit considérablement le recrutement des marqueurs de l&#39;autophagie 8. Ainsi, au moins dans le cas de Shigella, Septin ensemble de cage et formatio autophagosomen peut être considéré comme des processus interdépendants. D&#39;autres exigences cellulaires pour le cloisonnement de Shigella par des cages de septines comprennent la polymérisation de l&#39;actine et de l&#39;activité de l&#39;actomyosine (figure 2B). Il n&#39;existe pas de modèle naturel de la souris de la shigellose, et l&#39;enquête de Shigella pathogenèse, septin biologie et l&#39;autophagie bactérienne in vivo peuvent bénéficier d&#39;un nouveau modèle animal de l&#39;infection, les larves de poisson zèbre 19. Il est possible d&#39;infecter les larves de poisson zèbre par injection de bactéries dans différents sites anatomiques telles que des injections intraveineuses caudale pour les expériences de survie, et la queue injections musculaires pour la microscopie in vivo (Figure 3A). En fonction de la dose, S. flexneri injecté dans les larves de poisson zèbre peut soit être réglés en moins de 48 heures après l&#39;infection, ou peut entraîner une infection évolutive mortelle (figures 3B - 3D). Shigella virulence facteurs sont exprimés à 28 ° C, la température optimale de croissance de poisson-zèbre, de poisson zèbre et infection par Shigella est strictement dépendant de son système de sécrétion de type III (T3SS) 19, un facteur de virulence essentiel dans la maladie humaine. Pris ensemble, ces observations indiquent que la larve de poisson zèbre représente un nouvel hôte précieux pour l&#39;analyse in vivo des infections à Shigella. L&#39;accessibilité optique de larves de poisson zèbre permet de visualiser septin cage in vivo (figure 4A), un exploit qui n&#39;a jamais été accompli en utilisant des modèles hôtes de mammifères. Pour compléter la preuve que les cages septines piéger les bactéries ciblées à autophagy in vivo, on peut infecter les larves de poisson zèbre transgénique exprimant GFP-Lc3 observer recrutement et de marqueur de autophagy de Shigella (figure 4B). Pour une analyse de ultrastrucutral autophagosomes Shigella in vivo, elmicroscopie ECTRON peut être utilisé pour montrer clairement la séquestration cytosolique de bactéries par des doubles vacuoles de la membrane 19. L&#39;autophagie est considéré comme un élément clé de l&#39;immunité cellulaire autonome et un mécanisme de défense essentiel contre les bactéries intracytosolic 14-16. Afin de caractériser la fonction de autophagy in vivo, p62 larves de poisson zèbre morpholino-traité peut être utilisé. Contrairement à la machine de base de l&#39;autophagie [ex., Les 36 autophagie protéines apparentées (ATG) 26], p62 n&#39;est pas essentiel pour le développement des vertébrés et 27 larves de poisson zèbre peut ainsi se développer normalement avant l&#39;infection. Il est frappant, les larves de p62 appauvri inoculés avec S. résultat flexneri une augmentation significative de la mortalité et une augmentation de la charge bactérienne 19. En accord avec les travaux in vitro montrant que l&#39;assemblage septin cage est solidaire avec la formation autophagosome 7,8, le recrutement de septin à Shigella est nettement réduite chez les larves de p62 appauvri ( <strong&gt; Figure 4C). Ces données montrent que la survie du poisson zèbre autophagy dépend de p62 médiée pour contrôler une infection bactérienne intracellulaire. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: La cage septin in vitro. (A) Des cellules HeLa ont été infectées avec S. flexneri pendant 4 h 40 min, fixe, marqué avec des anticorps à SEPT9 et phalloïdine et imagée par microscopie confocale. La barre d&#39;échelle, de 1 um. (B) cellules HeLa ont été infectées par S. flexneri pendant 4 h 40 min, fixe, marqué avec des anticorps dirigés contre la protéine p62 et SEPT2 et imagée par microscopie fluorescente. La barre d&#39;échelle, de 1 um. cellules (C) HeLa ont été transfectées avec GFP-ATG8 / LC3, infecté par S. flexneri pendant 4 h 40 min, fixe, marqué avec des anticorps à SEPT2 et imagée par km fluorescentscroscopy. La barre d&#39;échelle, 1 pm. Ces chiffres ont été modifiés de Mostowy et al 7. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: exigences cellulaires pour Shigella formation de cage -septin. (A) cellules HeLa ont été traités avec le contrôle (CTRL), p62, ATG5, ATG6 ou ATG7 siRNA. Lysats de cellules entières de cellules siRNA-traités ont été immunotransférés pour GAPDH, p62, ATG5, ATG6, ou ATG7 pour montrer l&#39;efficacité des siRNA épuisement (en haut). cellules siARN traités ont été infectées par S. flexneri pendant 4 h 40 min, fixe, et marqué pour la microscopie quantitative. Graphiques (en bas) représentent la moyenne ± SEM% de Shigella dans des cages SEPT2 de n ≥3 expériences par le traitement. (B) cellules HeLa ont été infectées par S. falexneri, traités avec du DMSO, la cytochalasine D (cumul annuel), B latrunculine (TPVB), nocodazole (Noco), ou blebbistatin (Bleb) et après 4 h 40 min ont été fixées et marquées pour la microscopie quantitative. Graphiques représentent la moyenne ± SEM% de Shigella dans des cages SEPT2 de deux expériences indépendantes par traitement. Ces chiffres ont été modifiés de Mostowy et al 7. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 Le modèle de poisson zèbre d&#39;infection à Shigella. (A) Images pour illustrer l&#39;orientation de la larve de poisson zèbre sous la loupe binoculaire. (Panneau de gauche) poisson zèbre larves 72 heures après la fécondation ont été positionné latéralement dans la plaque d&#39;injection avec leur face dorsale face à l&#39;aiguille d&#39;injection. Infection (panneau du milieu) Bloodstream a été réalisée par injète les bactéries de la solution (rouge) dans la veine caudale, postérieur à l&#39;ouverture de urogénital. (Panneau droit) Infection dans la queue musculaire a été réalisée par l&#39;injection des bactéries (solution rouge) sur une somites. (B) Les courbes de survie des larves après la fécondation de 72 h injecté avec différentes doses de S. flexneri et incubé à 28 ° C après l&#39;infection pour 48 h. L&#39;inoculum efficace a été classé comme faible (&lt;10 3 UFC, cercles vides), moyen (~ 4 x 10 3 UFC, triangles ouverts) ou élevé (~ 10 4 UFC, carrés ouverts). % Moyen ± SEM (barres horizontales) à partir de n ≥3 expériences par classe d&#39;inoculum. (C) énumération des bactéries vivantes dans des homogénats de larves individu à différents moments après l&#39;infection mesurée par étalement sur ​​LB Remarque, seules les larves ayant survécu à l&#39;infection sont inclus dans l&#39;analyse de dénombrement. Moyenne ± SEM (barres horizontales) également indiqué. (D) Distribution de GFP Shigella déterminé parimagerie en temps réel en utilisant un microscope stéréoscopique fluorescent à différents moments après l&#39;infection en utilisant une basse, moyenne ou haute dose inoculum (caudales des injections intraveineuses). Superposition image de transmission (gris) et fluorescence de la GFP (vert) (B) de -. (D) Ces chiffres ont été modifiés de Mostowy et al 19. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 La biologie cellulaire des infections à Shigella in vivo. (A) des larves de poisson zèbre ont été infectés dans la queue musculaire avec GFP Shigella (faible dose) pendant 24 heures, fixe, marqué avec des anticorps contre SEPT7 (rouge) et à la GFP (green ), et imagée par microscopie confocale. La barre d&#39;échelle, 5 um. (B) GFP-Lc3 larves de poisson zèbre ont été infectées par Shigella mCherry- (dose moyenne) pour4 h, fixe, marqué avec des anticorps contre mCherry (rouge) et de la GFP (vert), et imagée par microscopie confocale. . Barre d&#39;échelle, de 1,5 um (C) les larves de poisson zèbre traités soit par contrôle (CTRL; image de gauche) ou p62 (image de droite) morpholinos ont été infectées par le GFP Shigella pendant 4 heures (dose moyenne), fixe, marqué avec des anticorps contre SEPT7 ( rouge) et de la GFP (vert), et imagée par microscopie confocale. Les flèches mettent en évidence des exemples de Shigella piégées dans des cages septines (CTRL) ou non (p62 épuisée) un après l&#39;infection de 4 heures. La barre d&#39;échelle, 5 um. Ces chiffres ont été modifiés de Mostowy et al 19.

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Pour contrer la diffusion de l&#39;agent pathogène, les cellules hôtes réorganisent leur cytosquelette de compartimenter les bactéries et d&#39;induire l&#39;autophagie. Utilisation de shigellose des cellules de culture de tissu, hôte et les déterminants de pathogènes sous-jacents de ce processus sont identifiés et caractérisés. En utilisant des modèles de poisson zèbre de shigellose, le rôle des molécules et des mécanismes découverts sont étudiés in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

15.7K vues.  Imperial College London.  Pour contrer la diffusion de l'agent pathogène, les cellules hôtes réorganisent leur cytosquelette de compartimenter les bactéries et d'induire l'autophagie. Utilisation de shigellose des cellules de culture de tissu, hôte et les déterminants de pathogènes sous-jacents de ce processus sont identifiés et caractérisés. En utilisant des modèles de poisson zèbre de shigellose, le rôle des molécules et des mécanismes découverts so...

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Immunologie et infection

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilisation d&#39;<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un organisme modèle pour l&#39;étude<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Maladies infectieuses

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Création d’un Dense Transposon Insertion bibliothèque à l’aide de la conjugaison bactérienne dans les entérobactéries souches telles que Escherichia Coli et Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imagerie de Ca2 + réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocouches de Colonoid humain pour étudier les Interactions entre les pathogènes, germes commensaux et hôte épithélium Intestinal

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...