L’établissement de protocoles de transfection pour les espèces d’Eimeria aiderait à faire progresser l’étude des fonctions génétiques, à mettre au point de nouveaux vaccins et à criblage de nouvelles cibles médicamentées pour Eimeria. En utilisant cette technique, nous avons atteint la transfection de plusieurs espèces d’Eimeria, et la nucléofection est un outil utile pour faciliter l’application de la manipulation génétique chez les parasites eimérien. La nucléofection d’Eimeria fournit une référence pour la transfection d’autres parasites qui ne peuvent pas être cultivés in vitro et accélérera l’étude de leur manipulation génétique.
Si vous essayez cette technique pour la première fois, vous devez bien préparer tous les reagents et leurs instruments avant le début de la transfection pour éviter les brouillages pendant l’expérience. La réalisation de cette méthode aide les personnes qui se concentrent sur la transfection d’Eimeria à voir les détails complexes de cette expérience. Pour commencer par la libération de sporocystes, centrifugeuse une fois 10 aux sept oocystes sporulated dans la solution de dichromate de potassium à 2300 fois g pendant cinq minutes.
Lavez-les avec PBS trois fois. Resuspendez la pastille avec un millilitre de PBS, et transférez le mélange dans un tube de 15 millilitres. Ajouter un volume égal de perles de verre d’un millimètre de diamètre et faire osciller la suspension oocyste à l’aide d’un mélangeur vortex pour libérer les sporocystes.
Chaque minute, surveillez la libération de sporocystes par microscopie. Lorsque plus de 90% des oocystes sont cassés, arrêtez de vortexer. Transférer la suspension sporocyste dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et une centrifugeuse à 1 600 g pendant cinq minutes.
Resuspendez le précipité avec un millilitre de solution de gradient de densité de 50%, et centrifugeuse à 10 000 fois g pendant une minute. Pour libérer les sporozoites, resuspendez le précipité avec le tampon d’excystation, et incubez dans un bain d’eau de 42 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes pour libérer les sporozoites. Secouez les tubes une fois toutes les cinq minutes pendant l’excystation.
Lorsque plus de 90% des sporozoites sont libérés, arrêtez d’incuber. Centrifugeuse à 600 fois g pendant 10 minutes. Resuspendez les précipitations avec une millilitre de solution de gradient de densité de 55%, et centrifugez le tube à 10 000 fois g pendant une minute.
Resuspendez les précipitations avec un millilitre de PBS, et comptez les sporozoites à l’aide d’un hémocytomètre. Pour recueillir les merozoites de deuxième génération d’Eimeria necatrix, coupez l’intestin de poulet longitudicieusement de la tige jaune à l’orifice ileocecal, et lavez-le avec PBS ou HBSS doucement trois fois dans une boîte de Petri. Couper l’intestin en morceaux et les placer dans un flacon conique avec un tampon de digestion.
Placer le flacon sur un mélangeur magnétique à 37 degrés Celsius avec une barre d’agitation pendant 30 à 60 minutes pour libérer les merozoites. Après 30 minutes d’incubation, surveiller la libération de mézoites par examen microscopique toutes les cinq minutes. Pour purifier les merozoites, versez la suspension contenant des merozoites digérés sur quatre couches de gaze pour filtrer dans des tubes de 50 millilitres, et centrifugez les tubes à 600 fois g pendant 10 minutes.
Après centrifugation, jeter le supernatant contenant des débris intestinaux. Transférer les précipitations avec des merozoites purifiés dans des tubes de 1,5 millilitre. Resuspendez les précipitations avec un millilitre de PBS, et comptez les merozoites à l’aide d’un hémocytomètre.
Tout d’abord, centrifuger la suspension sporozoite ou merozoite à 600 fois g pendant 10 minutes. Puis jetez le surnatant. Dans l’ordre suivant, ajouter 85 microlitres de tampon de transfection nucléaire, 10 microgrammes de plasmide et 25 unités d’enzyme de restriction dans le tube de 1,5 millilitre contenant des sporozoites ou des merozoites.
Transférer la suspension dans une tasse de transfection nucléaire. Mettez la tasse dans une rainure de transfert nucléaire. Allumez le dispositif de nucléofection en utilisant le bouton d’alimentation, et sélectionnez la procédure de transfection U-033.
Lorsque le programme se termine, appuyez sur le bouton X du dispositif de nucléofection, et l’écran s’affiche OK, indiquant que la nucléofection est réussie. Ajouter 0,5 à un millilitre de médium d’aigle modifié de Dulbecco à la tasse de nucléofection pour arrêter la réaction. Après avoir mélangé doucement, transférer la suspension dans un tube de 1,5 millilitre.
Inoculer les parasites nucléofectés en poulets de sept jours. Inoculer les merozoites d’Eimeria necatrix ou les sporozoites d’Eimeria tenella via la route cloaque, mais inoculer Eimeria acervulina sporozoites par injection intraveineuse. Après avoir recueilli des oocystes dans les excréments, utilisez le tri cellulaire activé par fluorescéine et 150 milligrammes par kilogramme de pyriméthamine pour augmenter le ratio de population transgénique.
Ce protocole a été utilisé pour transfecter les parasites eimérien. Dans cette étude, les meronts et merozoites de deuxième génération d’Eimeria necatrix sont montrés ici, ainsi que les sporocystes et les sporozoites d’Eimeria tenella après avoir utilisé les solutions de gradient de densité. Les images des oocystes d’Eimeria necatrix après avoir infecté avec les merozoites nucléofectés et les oocystes d’Eimeria tenella après avoir infecté avec des sporozoites nucléofectés indiquent la nucléofection réussie.
La chose la plus importante tout en essayant cette procédure est de s’assurer que la purification des sporozoites et des merozoites sont réussies et d’utiliser la solution de gradient de densité de 50% pour enlever l’OS2 tout en s’assurant que les sporocystes et les sporozoites sont plus purifiés. Suite à cette procédure, vous pouvez optimiser ce protocole, comme transfecting oocyste ou sporocyste pour simplifier les procédures de transfection des parasites Eimeria à l’avenir. Avec le développement de la transfection à Eimeria, la technologie CRISPR-Cas9 à Eimeria sera en mesure de mettre en avant de manière significative la manipulation génétique prudente d’Eimeria et d’être appliquée comme un véhicule approprié d’administration de vaccins.
