La recherche dans le laboratoire de MT est soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DBI-0820610-1022102 et IOS) et le ministère de la Santé York (NYSTEM-C024308). CM ont reçu des bourses postdoctorales du ministère espagnol de l&#39;Education et des Sciences (2007-0937) et la Fondation Rafael del Pino, Espagne.

<ol>
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M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia.">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li><li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades.">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li><li>Kidner, C., Timmermans, M. C. 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A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis.">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li><li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex.">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;hybridation in situ dans la méthode décrite ici permet la visualisation directe du patron d&#39;expression spatio-temporelle d&#39;un gène d&#39;intérêt avec une résolution cellulaire grande, haute sensibilité et spécificité. Le protocole ne permet pas une comparaison quantitative des niveaux d&#39;expression entre les gènes. Toutefois, une haute sensibilité de la méthode et la résolution peut révéler des gradients de l&#39;expression des gènes dans un tissu 8, 18, ​​qui n&#39;est pas possible avec la plupart des autres méthodes d&#39;analyse de l&#39;expression génique. Le protocole comprend de nombreuses étapes, ce qui peut rendre le dépannage des problèmes. Les étapes les plus critiques du protocole sont la fixation du tissu et de la sélection et l&#39;étiquetage de la sonde. Les tissus infiltrés et des sondes mal avec l&#39;incorporation DIG faible donnera des signaux très faibles qui pourraient être difficiles à détecter dessus du fond. Pour chaque nouveau gène d&#39;intérêt, il est conseillé d&#39;essayer quelques sondes distinctes provenant diffélocation régions de la transcription. Parfois, deux ou trois sondes ciblant différentes petites régions du gène peut être nécessaire de combiner pour obtenir un fort signal d&#39;hybridation et spécifiques. En outre, les conditions d&#39;hybridation, comme la température et la composition du tampon d&#39;hybridation, peut être optimisé pour chaque gène ou d&#39;un tissu à la baisse ou l&#39;augmentation de la rigueur d&#39;hybridation. Aussi l&#39;étape de traitement de la protéase est une variable et peut être modifié pour adapter le protocole pour différentes espèces de plantes ou pour la détection des transcrits avec très peu abondante. L&#39;inclusion de deux sondes de contrôle positif et négatif sera utile pour identifier les points problématiques du protocole. La procédure est optimisé pour paraffine des coupes de tissus végétaux, mais avec des modifications mineures peuvent être utilisées aussi pour l&#39;ensemble de montage hybridation in situ. Bien que largement utilisé dans la recherche animale 19, monter toute l&#39;hybridation in situ sera limited aux tissus de la plante qui peut être facilement infiltré, tels que les embryons, les racines ou les jeunes tissus méristématiques 20,21. Le protocole peut également être facilement modifié pour détecter simultanément deux ARNm distincts ou localiser les transcriptions aux côtés de protéines 15,22,23. Enfin, il est possible d&#39;étendre l&#39;application de cette méthode pour la visualisation des petits modèles d&#39;expression ARN dans les plantes. les modèles d&#39;expression de miRNA ont été déterminés en utilisant ce protocole dans les deux maïs et Arabidopsis 8,14. Plus récemment, le transcrit in vitro dans les sondes ont été remplacées par commercialement disponibles DIG-étiqueté d&#39;acides nucléiques verrouillés (LNA) sondes oligo que la sensibilité du signal augmentation de 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Produit </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Remarques </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4 oz </td><td> Fisher </td><td> 23-244-256 </td><td> À base de toluène 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Fisher </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Tissu Chemin Paraplast plus </td><td> Fisher </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + membrane de Nylon Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT; 40 U / uL </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase-Free DNase; 1 U / pl </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-étiquetés contrôle ARN </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG ARN étiquetage mélangez </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 ARN polymérase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3 ARN polymérase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polymérase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> dissoudre dans la glycérine à 50% de Tris pH 8,0 100 mM </td></tr><tr><td> Réactif de blocage </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Chauffer jusqu&#39;à 70 ° C dans un tampon TBS </td></tr><tr><td> Anti-digoxygénine-AP, des fragments Fab de mouton 150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> Solution stock NBT / BCIP </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Quick Spin Colonnes ARN </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> ARNt de E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide déionisée </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Protéase de Streptomyces griseus XIV type </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Diluer dans l&#39;eau MilliQ et de pré-digérer les 4 heures à 37 ° C </td></tr><tr><td> Triéthanolamine </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Diluer dans de l&#39;eau, porter à pH 8,0 avec HCl </td></tr><tr><td> L&#39;anhydride acétique </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran sulfate de sodium du sel de Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Sulfate de Dextran doit être chauffé à 80 ° C pour dissoudre. </td></tr><tr><td> Denhardt Solution 50x concentré </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine de sérum bovin - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Éosine Y sel disodique </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Dissoudre dans de l&#39;éthanol 96-100% jusqu&#39;à saturation </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol absolu 200 la preuve </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phénol / chloroforme </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base de moules </td><td> Électronique Microsocpy sciences </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Anneaux d&#39;Enrobage </td><td> Fisher </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml flacons de scintillation jetables, avec des bouchons </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Sonde-sur-Plus diapositives </td><td> Fisher </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Verres couvrent Micro mm 24x50 </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Papier Whatman 3MM </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Trois plats en verre et un staiauf support glissière en acier </td><td> Électronique Microsocpy sciences </td><td> 71420-25 </td><td> Deux verres bombés sont nécessaires pour le traitement histoclear et le dernier est utilisé pour le traitement de l&#39;anhydride acétique </td></tr><tr><td> 18 conteneurs en plastique propre </td><td> Électronique Microsocpy sciences </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ou 3 grandes plates boîtes en plastique avec couvercle refermable </td><td></td><td></td><td> requis pour les étapes d&#39;hybridation et d&#39;anticorps </td></tr><tr><td> Brosses fines </td><td></td><td></td><td> Aide remise des rubans de cire </td></tr><tr><td> Microtome </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Auto-nettoyage du système à vide sèches </td><td> Welch </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Glissez chauds </td><td> Fisher </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloc de chauffage </td><td></td><td></td><td> nécessaire à 60 ° C et 85 ° C</td></tr><tr><td> Incubateur à 58-60 ° C </td><td> Fisher </td><td></td><td> Pour les étapes avec des fondus Paraplast </td></tr><tr><td> Fours ou des bains d&#39;eau de 55 ° C et 37 ° C </td><td> Fisher </td><td></td><td> Besoin de deux en raison du changement rapide entre les températures </td></tr><tr><td> Centrifugeuse (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hotte </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants

Avec les progrès de la recherche en génomique de la dernière décennie, la biologie végétale a vu de nombreuses études à grande échelle présentant des analyses quantitatives de l&#39;expression génique. Microarray et à côté des approches séquençage de nouvelle génération sont utilisées pour étudier les processus d&#39;intervention de développement physiologique et le stress, épigénétique et décortiquer les petites voies d&#39;ARN, et construire des réseaux de gènes de régulation de grandes 1-3. Bien que ces techniques facilitent l&#39;analyse simultanée des ensembles de gènes importants, ils fournissent généralement une résolution très limitée spatio-temporelle des changements d&#39;expression génétique. Cette limitation peut être partiellement résolu en utilisant soit la méthode de profilage en conjonction avec lasermicrodissection ou fluorescence-activated tri cellulaire 4-7. Cependant, pour comprendre pleinement le rôle biologique d&#39;un gène, la connaissance de son modèle spatio-temporelle de l&#39;expression à une résolution cellulaire est essentielle. En particulier, lorsque l&#39;on étudie le développement ou les effets environnementaux des ISTmuli et mutants peuvent l&#39;analyse détaillée de profil d&#39;expression d&#39;un gène est devenu indispensable. Par exemple, de subtiles différences quantitatives dans les niveaux d&#39;expression de gènes clés de réglementation peuvent conduire à des phénotypes spectaculaires lorsqu&#39;ils sont associés à la perte ou le gain d&#39;expression dans des types cellulaires spécifiques. Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour l&#39;examen détaillé des profils d&#39;expression génique. L&#39;une est à travers l&#39;analyse des lignes de journaliste transgéniques. Une telle analyse peut cependant devenir fastidieuse lorsque l&#39;on analyse les gènes multiples ou travaillent dans des usines de transformation aux récalcitrants. Par ailleurs, une validation indépendante pour s&#39;assurer que le profil d&#39;expression des transgènes imite celle du gène endogène est généralement requis. Localisation de la protéine par immunohistochimie ou ARNm par hybridation in situ présenter des alternatives relativement rapide pour la visualisation directe de l&#39;expression des gènes dans les cellules et les tissus. Ce dernier a l&#39;avantage qu&#39;il peut être facilement used sur n&#39;importe quel gène d&#39;intérêt. L&#39;hybridation in situ permet la détection des ARNm dans les cellules cibles par hybridation avec un anticorps anti-sens sonde ARN obtenu par transcription in vitro du gène d&#39;intérêt. Nous exposons ici un protocole pour la localisation in situ de l&#39;expression génique dans les plantes qui est hautement sensible et spécifique. Il est optimisé pour une utilisation avec fixes paraformaldéhyde et inclus en paraffine sections, qui donnent une excellente conservation de l&#39;histologie et les sondes DIG-étiquetés qui sont visualisées par immuno-détection et la phosphatase alcaline réaction colorimétrique. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de tissus à partir d&#39;un large éventail d&#39;espèces de plantes, et peut être utilisé pour analyser l&#39;expression des ARNm ainsi que les petits ARN 8-14.

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In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

L&#39;<em&gt; In situ</emProtocole d&#39;hybridation&gt; décrite ici permet une localisation directe de l&#39;ARNm et petits expression de l&#39;ARN au niveau cellulaire avec une sensibilité et une spécificité élevées. La procédure est optimisé pour paraffine des coupes de tissus végétaux, est applicable à un large éventail de plantes et de tissus, et peut être complété dans les dix jours.

Hybridation in situ pour la localisation précise des transcriptions dans les plantes

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

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Research

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Biology

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

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