La ricerca nel laboratorio di MT è sostenuto da finanziamenti della National Science Foundation (DBI-0820610 e IOS-1022102) e il Dipartimento di Salute NY (NYSTEM-C024308). CM ha ricevuto borse di studio post-dottorato da parte del Ministero spagnolo dell&#39;Educazione e della Scienza (2007-0937) e la Fondazione Rafael del Pino, Spagna.

<ol>
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M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia.">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li><li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades.">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li><li>Kidner, C., Timmermans, M. C. 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A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis.">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li><li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex.">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di ibridazione in situ qui delineato permette la visualizzazione diretta del pattern di espressione spazio-temporale di un gene di interesse con grande risoluzione cellulare, elevata sensibilità e specificità. Il protocollo non consente un confronto quantitativo dei livelli di espressione tra geni. Tuttavia, elevata sensibilità del metodo e la risoluzione può rivelare gradienti di espressione genica in un tessuto 8, 18, ​​che non è possibile con la maggior parte di altri metodi di analisi di espressione genica. Il protocollo comprende molte tappe, che può rendere problematica la risoluzione dei problemi. Le fasi più critiche del protocollo sono la fissazione dei tessuti e la selezione e l&#39;etichettatura della sonda. Scarsamente nei tessuti infiltrati e sonde con l&#39;incorporazione DIG bassa darà segnali molto deboli che potrebbero essere difficili da rilevare sopra di fondo. Per ogni nuovo gene di interesse, si consiglia di provare un paio di sonde distinte derivanti da diveraffitto regioni della trascrizione. A volte, due o tre sonde targeting diverse regioni più piccole del gene potrebbe essere necessario essere combinati per ottenere un segnale di ibridazione forte e specifico. Inoltre, le condizioni di ibridazione, come la temperatura e la composizione del buffer di ibridazione, può essere ottimizzato per ogni gene o tessuto per abbassare o aumentare la severità ibridazione. Anche la fase di trattamento della proteasi è una variabile e può essere modificato per adattare il protocollo per diverse specie di piante o per la rilevazione delle trascrizioni con abbondanza molto basso. L&#39;inclusione di entrambe le sonde di controllo positivo e negativo sarà utile per identificare i punti problematici del protocollo. La procedura è ottimizzata per paraffina sezioni di impianto di tessuto, ma con piccole modifiche può essere utilizzato anche per tutto il montaggio di ibridazione in situ. Benché ampiamente utilizzati nella ricerca animale 19, montare tutto ibridazione in situ è limited di tessuti vegetali che possono essere facilmente infiltrati, come gli embrioni, radici o giovani tessuti meristematici 20,21. Il protocollo può anche essere facilmente modificato per determinare simultaneamente due distinte o localizzare mRNA trascritti a fianco delle proteine ​​15,22,23. Infine, è possibile estendere l&#39;applicazione di questo metodo per la visualizzazione di piccoli pattern di espressione di RNA nelle piante. pattern di espressione di miRNA sono stati determinati utilizzando questo protocollo sia in mais e Arabidopsis 8,14. Più recentemente, il sonde in vitro trascritto sono stati sostituiti da commercialmente disponibile DIG marcato blocco degli acidi nucleici (LNA) sonde oligo che aumentare la sensibilità del segnale 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Prodotto </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Osservazioni </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4 oz </td><td> Pescatore </td><td> 23-244-256 </td><td> A base di toluene 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Pescatore </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Percorso tessuto Paraplast Plus. </td><td> Pescatore </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + nylon membrana Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNasi OUT; 40 U / mL </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase-Free DNase, 1 U / mL </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG marcato controllo RNA </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA etichettatura mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimerasi 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNA polimerasi 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi-A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> sciogliere in glicerolo pH8.0 50% Tris 100mM </td></tr><tr><td> Blocco dei reagenti </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Calore fino a 70 ° C in tampone TBS </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina-AP, frammenti Fab di pecora 150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP Soluzione </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Quick Spin RNA Colonne </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA da E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> ® Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide deionizzata </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasi da Streptomyces griseus Tipo XIV </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Diluire in acqua MilliQ e pre-digerire 4 ore a 37 ° C </td></tr><tr><td> Trietanolammina </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Diluire in acqua, portare a pH8.0 con HCl </td></tr><tr><td> Anidride acetica </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Destrano solfato di sodio sale da Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Solfato di destrano deve essere riscaldato a 80 ° C a dissolversi. </td></tr><tr><td> Soluzione Denhardt di 50x Concentrate </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina da siero bovino - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina G sale disodico </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Sciogliere in etanolo 96-100% fino a saturazione </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo assoluto 200 prova </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fenolo / cloroformio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base stampi </td><td> Elettronica Microsocpy Scienza </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Anelli di embedding </td><td> Pescatore </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml fiale monouso scintillazione, con tappi </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda-on-più diapositive </td><td> Pescatore </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Vetri di copertura micro millimetri 24x50 </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman carta 3 millimetri </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Tre piatti di vetro e uno StaiNLES acciaio cremagliera scivolo </td><td> Elettronica Microsocpy Scienza </td><td> 71420-25 </td><td> Due vetri bombati sono necessari per il trattamento histoclear e l&#39;ultima è utilizzato per il trattamento anidride acetica </td></tr><tr><td> 18 contenitori in plastica pulita </td><td> Elettronica Microsocpy Scienza </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 o 3 grandi scatole di piatti in plastica con coperchio richiudibile </td><td></td><td></td><td> necessari per le fasi di ibridazione e di anticorpi </td></tr><tr><td> Spazzole multa </td><td></td><td></td><td> Aiuto consegna cartucce a cera </td></tr><tr><td> Microtomo </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Sistema autopulente a vuoto a secco </td><td> Welch </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Far scorrere più caldi </td><td> Pescatore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento blocco </td><td></td><td></td><td> necessari a 60 ° C e 85 ° C</td></tr><tr><td> Incubatore a 58-60 ° C </td><td> Pescatore </td><td></td><td> Per la procedura con Paraplast fusa </td></tr><tr><td> Forni o bagni di acqua di 55 ° C e 37 ° C </td><td> Pescatore </td><td></td><td> Necessità a causa del rapido cambio tra due temperature </td></tr><tr><td> Centrifuga (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cappa </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants

Con i progressi della ricerca genomica del decennio passato, biologia vegetale ha visto numerosi studi che presentano le analisi quantitative su larga scala dell&#39;espressione genica. Microarray e approcci di sequenziamento prossima generazione vengono utilizzati per studiare i processi evolutivi di risposta, fisiologiche e di stress, sezionare epigenetici e piccoli percorsi di RNA, e costruire reti geniche di grandi dimensioni regolamentari 1-3. Mentre queste tecniche di facilitare l&#39;analisi simultanea di insiemi gene di grandi dimensioni, in genere offrono una risoluzione spazio-temporale molto limitato di cambiamenti di espressione genica. Questo limite può essere superato parzialmente utilizzando profili metodo in combinazione con lasermicrodissection o fluorescenza-attivato l&#39;ordinamento delle cellule 4-7. Tuttavia, per comprendere appieno il ruolo biologico di un gene, la conoscenza del proprio modello spazio-temporale di espressione ad una risoluzione cellulare è essenziale. In particolare, quando si studia lo sviluppo o gli effetti di sti ambientaliMuli e mutanti in grado l&#39;analisi dettagliata del pattern di espressione di un gene è diventato essenziale. Per esempio, sottili differenze quantitative nei livelli di espressione dei principali geni regolatori può portare a fenotipi drammatico se associato con la perdita o il guadagno di espressione in tipi cellulari specifici. Diversi metodi sono abitualmente utilizzati per l&#39;esame dettagliato dei modelli di espressione genica. Uno è attraverso l&#39;analisi delle linee di giornalista transgeniche. Tale analisi può però diventare molto tempo quando si analizzano più geni o di lavoro negli impianti recalcitranti alla trasformazione. Inoltre, una convalida indipendente per garantire che il modello di espressione del transgene imita quella del gene endogeno è in genere necessaria. Localizzazione immunoistochimica di proteine ​​o l&#39;mRNA di ibridazione in situ presentare alternative relativamente veloce per la visualizzazione diretta dell&#39;espressione dei geni all&#39;interno delle cellule e dei tessuti. Quest&#39;ultimo ha il vantaggio che può essere facilmente used su qualsiasi gene di interesse. ibridazione in situ permette la rilevazione di mRNA bersaglio nelle cellule tramite l&#39;ibridazione con un marcato senso anti-RNA sonda ottenuti in vitro la trascrizione del gene di interesse. Qui delineare un protocollo per la localizzazione in situ di espressione genica nelle piante che è altamente sensibilità e specifici. È ottimizzato per l&#39;utilizzo con fisso paraformaldeide, incluse in paraffina sezioni, che danno ottima conservazione di istologia e sonde DIG marcato che vengono visualizzati da immuno-rilevazione e alcalino-fosfatasi reazione colorimetrica. Questo protocollo è stato applicato con successo ad un certo numero di tessuti da una vasta gamma di specie vegetali, e può essere utilizzato per analizzare l&#39;espressione di mRNA e piccoli RNA 8-14.

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In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Il<em&gt; In situ</em&gt; Protocollo di ibridazione qui descritto permette una localizzazione diretta di mRNA e piccoli RNA espressione a livello cellulare con alta sensibilità e specificità. La procedura è ottimizzata per paraffina sezioni di impianto di tessuto, è applicabile ad una vasta gamma di piante e tessuti, e può essere completato entro dieci giorni.

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

51.0K Views.  Cold Spring Harbor Laboratory. Il In situ Protocollo di ibridazione qui descritto permette una localizzazione diretta di mRNA e piccoli RNA espressione a livello cellulare con alta sensibilità e specificità. La procedura è ottimizzata per paraffina sezioni di impianto di tessuto, è applicabile ad una vasta gamma di piante e tessuti, e può essere completato entro dieci giorni.