We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission&#8217;s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the &#8220;Stem Cells Call for Proposals.&#8221; This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by &#8220;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&#8221;.

1. Étiquetage axonale <ol><li> Fibres d&#39;escalade peut être marqué soit en injectant des colorants organiques conjugués à des dextrans de haut poids moléculaire ou des plasmides / virus qui induisent l&#39;expression de protéines fluorescentes de 26 à 29. Dans ce protocole, le colorant organique Alexa Fluor Dextran 488 est injecté dans l&#39;olive inférieure à étiqueter fibres grimpantes et les visualiser dans le cortex cérébelleux (figure 1). Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. </li><li> Préparer le tube capillaire en verre en le tirant sur un étirage de micropipettes. Couper la pointe du tube capillaire en verre avec des ciseaux jusqu&#39;à ce que le diamètre extérieur est d&#39;environ 30 um. </li><li> Charger le capillaire avec 1-2 ul du colorant de dextrane conjugué. </li><li> Avant de commencer, stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave. Au cours de la procédure, de réduire les risques de contamination à l&#39;aide d&#39;un stérilisateur à billes de verre. </li><li> Anesthésier la souris (9-12semaines) par injection intraperitoneale de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (9 mg / kg). Assurez-vous que l&#39;animal est entièrement sous sédation en utilisant la queue et / ou pincées d&#39;orteil. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Raser les poils au-dessus du cou avec une lame de rasoir ou la crème dépilatoire. Badigeonner le site chirurgical deux fois avec de la bétadine, en alternance avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Placez la souris sur un support stéréotaxique. Gardez l&#39;animal au chaud avec un coussin chauffant. </li><li> Poussez doucement les earbars sur l&#39;os à côté des oreilles de sorte que la tête est maintenue fermement. Tourner la tête pour former un angle de 140 ° avec le corps. L&#39;orientation souhaitée peut être obtenue en modifiant légèrement la hauteur de la tige de support de nez sur le support stéréotaxique. </li><li> Appliquer quelques gouttes de lidocaïne sur la peau entre les oreilles. Utiliser une pince ou une lame de rasoir pour effectuer une incision verticale d&#39;environ 1 cm sur la peau au-dessous de l&#39;occiput. </li><li> Séparez délicatement le tissu sous-cutané et les muscles par pince émoussées sous le microscope de dissection. Abaissez le faisceau musculaire horizontale et tenir en dehors des deux muscles verticaux fascicules afin d&#39;exposer la dure sur le foramen magnum. </li><li> Utilisation de la plus grande prudence, disséquer la durée avec une aiguille de seringue ou une pince très pointus pour exposer le tronc cérébral. Une petite quantité de liquide céphalo-rachidien peut se répandre lorsque la durée a été réduite. </li><li> Sur le micromanipulateur stéréotaxique, faire tourner le support du tube capillaire à 45 ° de la verticale. Placer le tube capillaire sur la ligne médiane, à mi-chemin entre le bord caudal du cortex cérébelleux et la première vertèbre cervicale. Insérer la pipette à une profondeur de 2 mm de la surface. </li><li> Délivrer un volume 0,5-1,5 pi de colorant sur 10-15 min. Un système de distribution de micro-injection permet de délivrer de la pression contrôlée du liquide dans le capillaire (pression d&#39;impulsion = 20 psi; durée d&#39;impulsion = 3-4 ms, la fréquence des impulsions de livraison = 12 Hz). </li><li> Laissez le capillaire en place pendant 15 min, puis slowly (en 2-3 min) retirez-le. Délicatement réaligner les muscles et suturer la peau au-dessus. Gardez les muscles bien hydratés par l&#39;application de certaines saline toute la procédure. </li><li> Pour éviter la déshydratation, injecter sous-cutanée de 0,5 ml de NaCl à 0,9%. Garder l&#39;animal dans une cage chauffée jusqu&#39;à récupération complète de l&#39;anesthésie. </li><li> Sous-cutanée administrer Carprofen (5 mg / kg) par jour pendant 2-3 jours après la chirurgie. </li></ol> 2. Fenêtre optique sur le cervelet Cortex NOTE: Le colorant est transporté dans 2 semaines du noyau olivaire inférieur à la cortex cérébelleux aux bornes du SCF (voir la figure 1). Les SADC peu marquées peuvent être visualisés sous la fenêtre crânienne permanent qui peut être effectué comme suit: <ol><li> Stériliser tous les instruments chirurgicaux. </li><li> Anesthésier la souris comme décrit ci-dessus. Utilisez pincées d&#39;orteil pour vérifier l&#39;animal est entièrement sous sédation. </li><li> Raser les cheveux au-dessus de la tête, essuyez le skavec des balayages alternés de 70% d&#39;alcool et de la bétadine et appliquer une pommade oculaire. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique et positionner les barres d&#39;oreilles afin de maintenir fermement la tête. </li><li> Sous-cutanée administrer la dexaméthasone (0,2 mg / kg) et Carprofen (5 mg / kg) pour éviter le gonflement du cerveau et les inflammations possibles à la fenêtre le site crânienne. </li><li> Appliquez une goutte de la lidocaïne sur la peau au-dessus du crâne et couper un volet, d&#39;entre les oreilles jusqu&#39;au-dessus des yeux. Appliquer la solution de lidocaïne à nouveau sur le périoste avant de gratter avec un scalpel. </li><li> Utilisez la fraise de dentiste à une mince région semi-circulaire de crâne au-dessus du cervelet. La fenêtre est habituellement placé central et vers l&#39;arrière de suture, de sorte que la profondeur de crâne est à peu près constante tout au long du pourtour de la demi-cercle. Positionnement de la fenêtre trop près de la suture lambda et forage répétitif sur cette région très épais peut entraîner une surchauffe du cerveau et de la formation d&#39;oedèmes. </li><li> Appliquer hémostatiqueéponge sur le crâne en cas de saignement. </li><li> Couper une lamelle en deux parties avec l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir et une pince à épiler. Vérifiez que la lamelle est légèrement plus grand que l&#39;île de l&#39;os et a une forme similaire avant de retirer le volet de l&#39;os avec la pince à épiler; sinon, remodeler la lamelle ou en choisir un autre. Ne touchez pas la dure-mère avec la pince à épiler en tirant de l&#39;os. Poser doucement sur la lamelle sur la durée. NOTE: L&#39;adhérence de la totalité de la surface de la vitre sur la dure-mère est prédisait de longues fenêtres crâniens durables. </li><li> Retirer les bulles d&#39;air sous le verre en le rinçant à plusieurs reprises avec une solution saline et séchage avec des bâtons de coton. Cela aidera également à éliminer des restes de sang qui pourraient être déversés sur des petits capillaires après le positionnement de la vitre. Sceller la fenêtre avec un mélange de la colle acrylique et le ciment dentaire 30. </li><li> Gardez l&#39;animal sur un coussin chauffant dans une chambre de récupération jusqu&#39;à ce que complètement récupéré de l&#39;anesthésie. Ne pas réutilisertourner la souris dans la cage de la maison jusqu&#39;à ce que complètement rétabli; ne les laissez pas sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;ils repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. </li><li> Sous-cutanée administrer Carprofen (5 mg / kg) par jour pendant 2-3 jours après la chirurgie. </li></ol> 3. In Vivo multi-photons laser axotomie <ol><li> Attendez 2-7 jours de la chirurgie avant d&#39;effectuer la première session d&#39;imagerie. Le construit sur mesure à deux photons microscope utilisé ici est pourvue d&#39;un Ti: source laser saphir (120 fs impulsions en largeur, le taux de répétition de 90 MHz), qui est d&#39;abord numérisé par une paire de miroirs galvanométriques et ensuite focalisé sur l&#39;échantillon par une immersion dans l&#39;eau 20x objectif (NA 0,95, WD 2 mm). Une étape piézoélectrique en boucle fermée exécute les déplacements axiaux jusqu&#39;à 400 um de l&#39;objectif. tubes photomultiplicateurs collectent le signal de fluorescence. </li><li> Anesthésier l&#39;animal, puis placez la tête dans le support stéréotaxique de sorte que la fenêtre crânienne fixe parallèle à l&#39;objectivationve plan focal. </li><li> Explorez avec TPF imagerie du cortex sous la fenêtre crânienne. Choisissez l&#39;axone d&#39;être endommagés parmi les plus brillants. </li><li> Acquérir un Z-stack (généralement le champ de vision est de 100 x 100 um 2, à 512 x 512 pixels, 2 pm axe z étape) pour obtenir une 3D reconstructions de l&#39;axone ciblée. Dans le volume imagé, choisir le site de la lésion sur une branche axonale qui est la plupart du temps parallèle au plan focal. Cette orientation permet de marquer rapidement des changements morphologiques, qui sont prédictifs d&#39;une dissection de succès. </li><li> Irradier avec une énergie forte dose au point sélectionné sur une portion distale d&#39;un CF. Cela se fait par le logiciel Labview: augmenter la puissance du laser 5-10x plus de la puissance utilisée pour l&#39;imagerie (≈ 300 mW, mesurée après l&#39;objectif), définir la position des miroirs galvanométriques pour faire un scan en ligne (~ 4 - 10 pm) sur le site de la lésion et ouvrir l&#39;obturateur de laser pour 400 à 600 msec. Orienter le balayage de ligneperpendiculaire au plan CF à sectionner complètement l&#39;axone. Irradier taches lumineuses (par exemple., Varicosités) permet généralement de dissection de l&#39;axone. La longueur d&#39;onde de laser axotomie est le même que celui utilisé pour l&#39;imagerie (920 nm). </li><li> Habituellement, la fluorescence de l&#39;axone dans la zone irradiée diminue passagèrement en raison de photoblanchiment. L&#39;acquisition d&#39;une pile de la même région, quelques minutes après l&#39;irradiation pour assurer l&#39;ablation a été bien effectuée. Si la région a commencé le gonflement et l&#39;axone formé des structures en forme de perles, le neurone a été disséqué avec succès. Dans ce cas, en quelques heures (de quelques dizaines de minutes à 24 heures) de la partie distale de l&#39;axone va dégénérer et disparaître complètement. </li><li> Malheureusement, la dose d&#39;énergie nécessaire pour produire une axotomie complète n&#39;est pas toujours prévisible. Si le seul résultat de l&#39;irradiation est photoblanchiment, la fluorescence devrait être récupéré rapidement en raison de la diffusion de colorant, et l&#39;irradiation doit être répétée à nouveau à efficacement disséquer l&#39;axone. En outre, dans le cas des signes de gonflement n&#39;apparaissent pas dans les 5 - 20 min, ou le gonflement est suivie par la récupération (. Analogue à ce qui a été décrit pour dendrotomy laser, voir Allegra Mascaro et al 23), essayez à nouveau avec de nouveaux scans de plus en plus la le temps de séjour et / ou la puissance du laser. </li><li> Surveillance de la rénovation éventuelle de l&#39;axone dans les jours qui suivent la axotomy laser avec deux photons imagerie in vivo (figures 2 et 3). Le réseau vasculaire est utilisé comme modèle de référence pour récupérer l&#39;axone disséqué dans les jours suivants. </li><li> Sous-cutanée administrer Carprofen (5 mg / kg) chaque séance d&#39;imagerie pour toute la durée de l&#39;expérience. </li></ol>

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(12), (2008).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Ce protocole montre comment étiqueter les neurones de l&#39;olive inférieure avec un colorant fluorescent. Par la suite, le procédé pour réaliser une fenêtre crânienne sur le cortex cérébelleux est décrite. Cette technique permet un accès optique à la partie terminale de neurones olivocerebellar, les fibres d&#39;escalade. Malheureusement, le résultat à la fois de l&#39;étiquetage et de la chirurgie de craniotomie est assez faible, même dans les mains d&#39;opérateurs qualifiés (généralement 1 sur 3 ...

Transection axonale résultant d&#39;une lésion mécanique, agression toxique ou les maladies neurodégénératives est généralement suivie par la dégénérescence de la partie distale de l&#39;axone qui est séparée du corps de la cellule de 10 à 13. À quelques exceptions près 2,7,14,15, les axones sectionnés dans le SNC des animaux adultes sont généralement incapables d&#39;activer un programme de régénération 16. On sait peu sur la dynamique en temps réel des événements dégénératives au niveau cellulaire et subcellulaire. Le développement de nouvelles stratégies pour limiter les dommages neuronaux et favoriser la repousse neuronale nécessite, dans un premier temps, de clarifier le mécanisme par lequel les cellules neuronales singulièrement blessés dégénèrent et se régénèrent. Cette étude est la plus directement visée par le suivi de la dynamique d&#39;un seul neurone in vivo. Bien que les techniques à un photon de fluorescence imagerie sont limitées par la diffusion intense de la lumière visible, excitation à deux photons atteint couches corticales profondes live souris avec subcellulaire résolution 3,4,17. Profitant de souris transgéniques dans lesquelles les protéines fluorescentes sont exprimés sélectivement dans les sous-populations de neurones 18-20, TPF microscopie a été appliqué à l&#39;exploration de la plasticité synaptique et l&#39;allongement axonal pendant le développement in vivo 21,22. L a capacité des neurones endommagés singulièrement à repousser après une blessure peut être étudiée par couplage dans le suivi in vivo par imagerie à deux photons avec un modèle de lésion spécifiquement ciblées sur l&#39;axone d&#39;intérêt. Multi-photon absorption d&#39;impulsions femtosecondes a été utilisée pour perturber dendrites individuelles ou même des épines simples 5,23. En outre, cette blessure paradigme permet de couper des branches axonales simples sans perturber la dendrite contact 6. Dans le cadre de disséquer les fonctionnalités qui permettent population neuronale spécifique pour régénérer leurs axones fois endommagés, fibres grimpantes du cervelet (FC) sont un modèle si utilence ils conservent des propriétés plastiques remarquables après une blessure, même chez les animaux adultes 24,25. Récemment, l&#39;imagerie à long terme des FC a montré que ces axones sont capables de repousse dans les jours qui suivent axotomy laser 6. Ce protocole décrit la façon d&#39;étiqueter les neurones olivocerebellar et leur allongement des axones à travers antérograde traçage. Une fois que les neurones d&#39;intérêt sont marqués par fluorescence, ils peuvent être contrôlés de manière répétée à des instants arbitraires pendant des semaines ou des mois de moins d&#39;une fenêtre crânienne. La procédure de disséquer branches axonales simples par axotomie laser in vivo sera ensuite illustrée. Les techniques présentées ici fournissent de nouveaux aperçus dans le mécanisme de remodelage des axones in vivo et peuvent aider le développement de stratégies thérapeutiques pour limiter la dégénérescence neuronale et favoriser la repousse axonale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting&#160;</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 (Glass bead sterilizer)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection dispense system</td>
			<td>Picospritzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>64-0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses,&#160; 90 MHz repetition rate</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spongostan, haemostatic sponge&#160;</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirrors&#160;</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier modules&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H7710-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW System Design Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate)</td>
			<td>Boheringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rymadil (carprofen)&#160;</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine clorohydrate 2%</td>
			<td>ATI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 dextran</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser nanosurgery of cerebellar axons in vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Ce protocole décrit comment effectuer l&#39;étiquetage axonale, l&#39;imagerie in vivo et axotomy laser sur les neurones simples. Le calendrier de l&#39;expérience est illustré à la figure 1. Un exemple de FC marquées avec Alexa Fluor 488 Dextran et visualisées sous la fenêtre crânienne in vivo par microscopie à deux photons est rapporté sur la figure 2. 6,27 Comme indiqué précédemment, les branches ascendantes pré...

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Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Imagerie à deux photons, couplé à nanodissection laser, sont des outils utiles pour étudier les processus dégénératifs et régénératifs dans le système nerveux central avec une résolution subcellulaire. Ce protocole indique comment étiqueter, image, et disséquer fibres grimpantes simples dans le cortex cérébelleux in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

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Neuroscience

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

8.1K vues.  University of Florence.  Imagerie à deux photons, couplé à nanodissection laser, sont des outils utiles pour étudier les processus dégénératifs et régénératifs dans le système nerveux central avec une résolution subcellulaire. Ce protocole indique comment étiqueter, image, et disséquer fibres grimpantes simples dans le cortex cérébelleux in vivo. 