이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 신경 과학에 대한 일행 기증 기금, 크리스토퍼와 다나 리브 재단​​과 Amerisure 자선 재단에 의해 지원되었다.

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	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. 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S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

다른 레이저 시스템 3,5-11와 레이저 미세 몇 가지 좋은 토론이 있습니다. Femtosecond IR 레이저가 영상 시설과 관련된 경우 12 편리한 subcellular 레이저 절제의 &quot;금 표준&quot;입니다,하지만 그들은 개별 사용자에 대해 종종 너무 비용이 많이 드는 있습니다. 이 때문에 화상의 깊이 화상 샘플을위한 femtosecond IR 레이저가 필요한 경우 그때는 아마 레이저 axotomy 하나가 필요합니다. 표면의 30-50 음 내의 대상 axons 투명한 조직은 아마 높은 NA의 침지 렌즈를 통해 대상 20 uJ / 펄스 범위의 파란색과 녹색 펄스 레이저로 가능 있습니다. 특히 대상 축삭 증가의 깊이로 femtosecond 레이저와 비교하여 나노 및 피코 초 레이저로 더 많은 피해있을 것입니다. C.이 elegans은 투명 모든 axons은 표면의 20-30 음 내에 있습니다. 우리는 정기적으로 표면의 5 음 내에있는 모터 axons를 잘라. 우리는 또한 쉽게 도끼를 차단표피 표면으로부터 약 20 음하는 신경 링 내에서 기능. 우리는 어른 벌레의 직경을 통해 약 30-50 음 ... 수 axons를 절단에 대한 제한을 발견했습니다. 그것은 여기에 설명한 레이저 박리 시스템이 대상 axons의 투명성과 깊이의 기준에 맞게 여러 가지 준비를 잘 작동한다고 가능성이 높습니다. 아직도, 그것은 femtosecond IR 레이저, 그 나노 및 picosecond 355 NM 및 532 nm의 레이저의 이론적 장점을 감안할 때, 조금 놀라운 것은 C로 레이저 axotomy에 대해 너무 잘 수행 elegans 6,13. 우리는 nanosecond 440 NM, nanosecond 532 NM, 그리고 femtosecond 레이저와 IR 레이저 axotomy에 대한 응답으로 축삭 재생에 차이를 볼 수 없습니다. 솔리드 스테이트 355 나노미터 자외선 레이저는 532 nm의 다이오드는 수동적 Q - 스위치 고체 레이저 펌핑과 같은 비용에 대해 있지만, 효율적으로 이러한 짧은 파장을 통과 하나 높은 능력이나 광학을 필요로합니다. 대부분의 광학은 보이는 400과 잘 수행하기 위해 설계되었습니다 -700 NM 라이트. 355 나노미터 레이저는 6 등 감소 플라즈마 임계값, 작은 스폿 크기, 그리고 효율적으로 대상으로 절제 레이저의 100 %를 직접 샘플 신호의 손실없이 GFP의 동시 이미징을 허용 것이다 긴 통과 이색성 같은 장점을 제공합니다. 블루 440 나노미터 레이저는 가시 광선 레이저 (표준 광학 및 안전과 좋은 성능) 작업의 장점을 유지합니다. 불행히도, DPP Q - 스위치 고체 440 nm의 레이저의 가격은 현재와 비슷한 전력 355nm 또는 532 nm의 레이저의 3 배 비용입니다. 우리는 C.위한 새로운 시스템을 설계했다면 elegans은 대상 깊이는 최소한 어디에, 우리는 1 UV 투명 렌즈 (355nm에서 50-70%의 투과율과 비용 40X 1.3na 석유 렌즈에 대한 약 $ 3,000) 및 5-10 uJ / 맥박을 생산 355 나노미터 레이저을 선택 것입니다 -20에 kHz에서. 축삭의 박리는 플라즈마 형성에 의한 것으로 생각됩니다. 짧은 펄스는 낮은 전력과 플라즈마 볼륨 w에서 플라즈마 임계값을 생산합니다<html> 병이 6 작은 수 있습니다. 목표는 가장 낮은 전원 펄스 에너지를 조정하여 가장 작고 짧은 - 살았 플라즈마를 생산하는 것입니다. 큰 긴 plasmas이 캐비테이션 거품을 생성하는 것으로 세포를 둘러싼 손상. 우리는 일반적으로 가장 높은 빈도 (예 : 2.5kHz)에서 50-100에 대한 펄스를 사용하는 것을 절제를 발견하면 최상의 결과를 제공합니다. 이것은 손상이 점차 더 손상의 정도를 제어하는​​ 펄스의 연속을 통해 통합될 수 있습니다 제안합니다. 빔을 정렬하고 정확하게 확장하는 경우 여기에 설명된 레이저 박리 시스템은 매우 용서입니다. 우리는 10 % 레이저의 파워 (0.3 MW의 평균 2,500 Hz에서에서 측정 및 1 uJ / 펄스 예상)에서 성인 벌레에 axons 절단 시작하고 14 % 전력을 통해 제한된화된 손상 절약하실 수 있습니다. 당신은 15~39% 레이저 파워 피해의 큰 영역을 볼 수 있지만, 오직 40 % 전력 (약 1 MW의 평균 2,500 Hz에서에서 측정) 위에 벌레 대형 캐비테이션 거품과 벌레의 표피 손상에 의한 폭발 않습니다. e_content &quot;&gt; Steinmeyer 외. 2010이 종이, 레이저 박리 시스템을 구축을위한 훌륭한 리소스입니다. 리온 에이버리는 또한 저렴한 N2 가스 337 NM 레이저를 기반으로, 레이저 박리 시스템의 좋은 실용적인 설명을 이뤘고, 좋은 실천을 제공합니다 조언 (elegans.swmed.edu / Worm_labs / 애버리 /). 자신의 시스템을 설계할 때 먼저 현미경 목표로 절제 레이저를 대상으로하는 방법을 결정하기 위해 귀하의 현미경 담당자와 상담해야합니다. 귀하의 현미경이 진동 절연 테이블에 장착해야합니다 (뉴 포트, TMI, 토르). 브레드 보드의 상단 최적이지만, 견고한 스틸 맨은 여전히​​ 자기 positioners와 함께 사용할 수 있습니다. 모든 광학 요소가 자리에 남아있을 수 있기 때문에 수직 범위에있는 전용 중개 모듈이 좋은 것입니다.하지만, 저렴하고 카메라 포트 (거꾸로) 또는 에피 형광등 포트에 연결된 &quot;결합기&quot;를 사용하기 더욱 편리있을 수 있습니다. 당신은 (에 다시 조리개와 투과율의 크기를 알아야<html> 목적 렌즈의 blation 레이저 파장)은 당신이 사용하는 것입니다. 일단 레이저 (예 : Crylas, 가득하며, 크리스탈, 또는 CRC)는 정확한 광학 요소를 선택, 하드웨어 및 안전 장비와 관련하여 도움이 토르 또는 뉴 포트에 문의를 결정합니다. 우리는 공간을 절약하기 위해 이중 갈릴리 빔 확장기 결정하지만 간단 Keplerian의 확장기가 옵션 (f2/f1 = 팽창 계수)입니다. 사용자 정의 빔 확장기가 가장 비싼되지만, 뉴 포트, 토르, 그리고 레이저 제조 업체의 여러 우수한 품질의 상용 빔 확장기를 제공합니다. 일부 레이저 제조 업체는 비용 효율과 공간 절약있을 수 있습니다 설명서 및 전자 제어 attenuators를 제공하고 있지만, Glan - 톰슨 편광자 및 하프 웨이브 플레이트처럼 다목적 없습니다. 당신은 또한 레이저를 제어하는​​ 방법을 결정해야합니다. 당신은 레이저 회사에서 제공하는 상업 TTL 발생기, 또는 소프트웨어를 사용, LabView 기반의 컨트롤러를 디자인할 수 있습니다. 특정 레이저 제조 업체 옵션을 논의. 십t &quot;&gt; 우리는 일반적인 가이드에만 사용이 하드웨어의 목록을 제공합니다. 시스템은 기존 이미징 시스템에 추가할 때 $ 15,000 달러의 비용이 여기에 설명된. 가까운 물리 부서에서 자주 실질적인 소개를 제공하기 위해 기꺼이 누군가를해야합니다 안전하게 무료 빔 레이저와 협력. 고정 및 C. 시간 경과 영상을위한 대체 방법 elegans은 최근에 설명되어있다. 14 문제 해결 가장 어렵고 중요한 단계는 현미경의 광축 중심으로 확대 빔을 정렬합니다. 일단 당신이 센터에 최종 정렬에 대한 운영 미러를 사용하기 전에 현미경의 광학 축의 5 음 내에서가 정렬하려면 열심히해야 갈릴리 렌즈를 통해 중심과 확장된 광선을합니다. 현미경으로 빔을 정렬 운영 거울 과도하게 사용이 빔을 통해 축을 벗어 이동합니다팽창기. 해당 ND 필터와 함께 레이저 빔을 감쇠와 직접 반사 대상 (전면 표면 거울)에 레이저 빔 프로파일을 볼 수 각별히 조심을 사용합니다. (그것이 당신이 레일의 높이를 조정하는 데 필요한 위 / 아래 범위에 중심 수없는 경우) 당신은 부드럽게 정확 센터보기의 목적 60X 필드에 광선을하기 위해 현미경을 슬쩍 찌르다 수 있습니다. 빔 프로파일이 정확하게 중심 원형이다 빔과 대칭 &quot;플레어&quot;를 제공하기 위해 현미경 광학 축을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 비대칭 불을 현미경 축이 완벽하게 (또는 레일 레벨되지 않습니다) 정렬되지 나타냅니다. 마지막으로, L3를 조정하고 빔의도 및 대칭 확장과 수축이 나타납니다. 가장 작은 지점에 레이저 빔을 초점 L3 조정 후 대상 표면에 정확히 현미경을 집중합니다. 이제 LSCM 또는 CCD 시스템을 통해 몇 군데와 절제 자리 이내로 때 레이저 빔을가 중심의 5 음 사이는 것을 발견한다Z의 초점 1um. 당신이 찾아내는 경우에 당신은 벌레를 &quot;폭파&quot;또는 지속적으로 문제가 가장 가능성이 절제 레이저의 미세 정렬됩니다 axons를 잘라 대형 캐비테이션 거품을 생성하고 있습니다. 최소 (&lt;500nm)가 절제 명소가 Z 초점 (L3 렌즈 컨버전스를 조정)하고 XY 신탁 지점 (마지막 kinematically 장착된 거울로 조정)에 현지되어 있는지 확인하십시오. 가까이 표면에 axons을 타겟팅하면 더 적은 레이저 전원을 필요합니다. 마찬가지로, 작은 동물 (L1 및 L2)은 성인에서 동일한 axons을 타겟팅에 비해 axotomy을위한 더 적은 레이저 전원을 필요합니다. 당신의 야생 유형 axons이 재생 또는 axons의 표백제하지 않으면 당신은 이미징 레이저 전원을 감소하거나 샘플링 속도를 감소 시도해야합니다. 당신의 벌레가 죽어거나 될 경우 병약한 1 % 단계에서 %의 아가로 오스를 줄여보십시오. 당 높은 사용하는 경우이 종종 그들이 죽는 원인이되므로이 장착 벌레 후 coverslip을 이동하지 있는지 확인centage 아가로 오스와 microspheres. 당신의 벌레가 시간 경과 세션 중에 파열 또는 죽으면 그것으로 인한 것입니다 : 1. 아가로 오스 비율이 너무 높습니다. 2. 절제 레이저로 표피 손상. 3. 장착 후 coverslip의 운동. 표피에 손상이 잘못에있다면 그것은 단지 절제 레이저 타겟으로 탑재된 웜 영향을 미칩니다. 당신의 벌레가 시간 경과 세션 중에 너무 많이 움직이면 0.5 % 단계의 비율 아가로 오스를 늘려보십시오. 건강한 웜의 건강한 axons는 항상 &quot;적극적&quot;이며 형광의 일관된 수준을 표시합니다. 이 형광 또는 활동에 갑자기 감소를 볼 경우 웜은 죽어 있거나 죽어있다. 여러 페르시 또는 조각 axons 죽어가는 혹은 죽은 벌레의 확인 서명이 있습니다. 당신은 전체 시간 저속 세션 동안 초점에 axons를 지키는 문제가있다면 여러 가지 문제가있을 수 있습니다. 처음 10 H 이상의 유리 슬라이드에 영상에 의해 불활성 샘플을 당신의 무대 드리프트를 확인RS. 몇 미크론 드리프트는 열 불안정으로 인해 수도 있지만 이상 5 음 아마도 현미경으로 기계적 문제로 인해 발생합니다. 장착에 문제가 더 일반적입니다. 시간의 경과를 시작하기 전에 마운트 웜 30 분 동안 현미경 스테이지와 평형합시다. 귀하의 바셀린의 인감이 시간 저속 세션 과정 중에 누출을 개발하지 않았 있는지 확인하십시오.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 535 NM 레이저 </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (가득하며, 크리스탈, 그리고 CRC도 비교 레이저를 제공합니다) </td></tr><tr><td> 모든 광학 및 하드웨어 </td><td></td><td></td><td> (토르는 비교 광학 및 하드웨어를 제공합니다) </td></tr><tr><td> SUPREMA 광학 마운트, 1.0에서 직경 </td><td> 뉴 포트 </td><td> SS100 - F2KN </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 게시, 1&quot;높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 포스트 포크 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 제로 주문 Wavel 플레이트, ½ 웨이브의 지체, 400 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> 10RP52 - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 회전 스테이지, 1 &quot;Aperature </td><td> 뉴 포트 </td><td> RSP - 1T </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 게시, 1&quot;높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 포스트 포크 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> Glan - 레이저 방해석의 편광판, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 편광판 회전 마운트 </td><td> 뉴 포트 </td><td> RM25A </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 직경 게시물 ¼ &quot;1 스페이서&quot; </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 0.25 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> ½ &quot;높이 1&quot;직경 포스트 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 0.5 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 포크, 1 &quot;직경 포스트 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 빔 덤프 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PL15 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 현미경 렌즈 마운트 목표 </td><td> 뉴 포트 </td><td> LH - OBJ1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 게시, 1&quot;높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 포스트 포크 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 높은 에너지 ND : YAG 레이저 미러, 25.4 mm의 직경, 45 °, 532 NM </td><td> 뉴 포트 </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA 광학 마운트, 1.0 인치 직경 통관 장착 구멍 </td><td> 뉴 포트 </td><td> SN100C - F </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 고정밀 손잡이 조정 나사, 12.7mm 여행, 100TPI </td><td> 뉴 포트 </td><td> AJS100 - 0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 스레드 어댑터, ¼ -20 남성, 동경 8-32 여성 </td><td> 뉴 포트 </td><td> SS - 1 - B </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 1.5 인치 직경로드에 대한로드 클램프 </td><td> 뉴 포트 </td><td> 340 - RC </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 로드, 높이 14 인치 (35.5 cm) </td><td> 뉴 포트 </td><td> 40 </TD&gt; <td> 일 </td></tr><tr><td> X26, 스퀘어 40mm 길이 레일 캐리어 </td><td> 뉴 포트 </td><td> CN26 - 40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 스틸 레일, 384mm (15 &quot;) 길이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> X26 - 384 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1.5 인치 직경로드에 대한로드 플랫폼 </td><td> 뉴 포트 </td><td> 300 P </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 로드, 높이 14 인치 (35.5 cm) </td><td> 뉴 포트 </td><td> 40 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 평요의 렌즈, 12.7mm 직경 - 25mm EFL, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 렌즈 볼록 렌즈, 25.4mm 직경 50.2mm EFL, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 렌즈 볼록 렌즈, 25.4mm 직경 62.9mm EFL, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 고정 렌즈 마운트, 0.5 &quot;직경 1.0&quot;축 높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> LH - 0.5 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 고정 렌즈 마운트, 1.0 &quot;직경 1.0&quot;축 높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> LH - 1 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> Microspheres 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00,876 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO 사항 </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> 시그마 </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

시간이 경과 현미경에 의해 다음 레이저 axotomy는 C로 축삭 재생의 phenotypes에 민감한 분석입니다 elegans 1. 이 분석의 주요 어려움은 레이저 박리 시스템 2,3을 구현하는 데 필요한 인식 비용 ($ 25 100K) 및 기술 전문 지식이다. 그러나 겸손한 비용 (&lt;$ 10K)의 솔리드 스테이트 펄스 레이저는 대상 axons은 조직의 표면에 &quot;가까운&quot;입니다 투명 준비의 레이저 절제를위한 강력한 성능을 제공할 수 있습니다. 시스템의 건설과 정렬은 하루에 수행할 수 있습니다. 초점 콘덴서에서 절제 레이저 빛을 제공하는 광학 경로는 편리한 정렬 가이드를 제공합니다. 제거된 모든 광학과 중간 모듈은 절제 레이저에 헌신되며 광학 요소, 레이저 박리 세션 동안 이동하지해야한다는 보장 수 있습니다. 중간 모듈에서 이색성은 동시 영상과 레이저 박리 수 있습니다. 레이저 빔 T를 중심으로O는 초점 현미경의 콘덴서 렌즈에서 나가는 빔은 시스템의 초기 정렬을 안내합니다. 렌즈의 다양한 상태로 사용하고 선택한 객관적인 렌즈의 뒤쪽 구멍을 채울 수있는 레이저 광선을 확장하고 있습니다. 최종 정렬 및 테스트는 앞 표면 미러 유리 슬라이드 목표로 수행됩니다. 레이저 파워는 최소 크기의 절제 자리를 (&lt;1um) 제공하도록 조정됩니다. 절제 장소는 이미지 창에 고정 머리카락을 건너 마지막 kinematically 탑재 거울 미세 조정 중심이다. axotomy에 대한 레이저 전원이 대상 슬라이드 (이것은 여러분이 사용하는 대상과 다를 수 있습니다)에 최소 절제 장소에 필요한보다 높은 약 10X 것입니다. 웜는 아가로 오스 패드 (또는 microfluidic 실 4)에 장착하여 레이저 axotomy 및 시간 - 저속 영상에 대한 고정하실 수 있습니다. 아가로 오스 패드는 쉽게 전자 레인지에 녹인 균형 식염수에서 10 % 아가로 오스와 함께 만들어집니다. 용융 아가로 오스의 방울은 유리 슬라이드에 배치하고 서로 평평합니다패드에 유리 슬라이드 두께 약 200 음 (인접 슬라이드에 시간이 테이프의 단일 레이어는 스페이서로 사용됩니다.) &quot;Sharpie&quot;캡은 13mm의 군복을 입은 직경 원형 패드를 절단하는 데 사용됩니다. 마취 (1ul Muscimol 20mM)와 Microspheres (크리스 송곳니 엔 개인 통신) (1ul 2.65 % 폴리스티렌 0.1 음 ... 물속에) 그들이 왼쪽 측면에 누워되도록 지향 3-5 웜 뒤에 패드의 중심에 추가됩니다. 유리 coverslip이 적용됩니다 그리고 바셀린는 coverslip을 봉인하고 샘플의 증발을 방지하는 데 사용됩니다.

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Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

레이저 axotomy 시간 - 저속 영상 뒤에 것은 분석의 돌연변이의 효과를 민감한 방법입니다<em&gt; C. elegans</em&gt; 축삭 재생에. 고품질하지만, 저렴한 가격, 레이저 박리 시스템은 쉽게 대부분의 현미경에 추가할 수 있습니다. 15시간 시간이 지남에 저속 영상은 웜주의 고정이 필요합니다.

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

15.3K 조회수.  University of Utah. 레이저 axotomy 시간 - 저속 영상 뒤에 것은 분석의 돌연변이의 효과를 민감한 방법입니다 C. elegans 축삭 재생에. 고품질하지만, 저렴한 가격, 레이저 박리 시스템은 쉽게 대부분의 현미경에 추가할 수 있습니다. 15시간 시간이 지남에 저속 영상은 웜주의 고정이 필요합니다.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...