Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation, le Fonds de dotation McKnight for Neuroscience, le Christopher et Dana Reeve Foundation et Amerisure Charitable Foundation.

<ol>
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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il ya plusieurs bonnes discussions sur la microchirurgie au laser avec des systèmes de laser différentes 3,5-11. Femtoseconde lasers IR sont le «gold standard» pour l&#39;ablation laser subcellulaire 12 et commode si associé à une installation d&#39;imagerie, mais ils sont souvent trop coûteux pour les utilisateurs individuels. Si vous avez besoin d&#39;un laser femtoseconde pour l&#39;imagerie infrarouge de votre échantillon en raison de la profondeur de l&#39;imagerie, alors vous aurez probablement besoin d&#39;une pour le laser axotomie. Tissus transparent avec les axones cible au sein de 30 à 50 um de la surface sont probablement faisable avec les lasers à impulsions bleu et vert dans les 20 UJ / impulsion fourchette cible à travers une lentille d&#39;immersion na élevé. Il n&#39;y aura plus de dommages collatéraux avec le nano et pico seconde lasers rapport avec le laser femtoseconde, d&#39;autant que la profondeur de l&#39;axone augmente cible. C. elegans est transparent et tous les axones sont à 20-30 um de la surface. Nous faisons régulièrement coupé axones moteurs qui sont dans les 5 um de la surface. Nous avons aussi facilement couper hacheons dans l&#39;anneau nerveux qui sont environ 20 um de la surface de la cuticule. Nous avons trouvé la limite pour la coupe des axones à environ 30-50 um par le diamètre d&#39;un ver adulte. Il est probable que le système d&#39;ablation laser décrit ici serait bien travailler avec de nombreuses préparations différentes qui répondent aux critères de transparence et de la profondeur des axones cible. Pourtant, il est un peu surprenant, étant donné les avantages théoriques des lasers femtoseconde IR, que 355 nano et picoseconde nm et 532 nm lasers exécuter si bien pour le laser axotomie en C. elegans 6,13. Nous ne voyons aucune différence dans la régénération des axones en réponse au laser nanoseconde avec axotomie 440 nm, 532 nm nanoseconde, et des lasers femtosecondes infrarouge. Solid state lasers UV 355 nm sont environ le même coût que la diode 532 nm pompé passivement Q-Switched laser à état solide, mais nécessitent des puissances supérieures ou optique qui passent efficacement ces longueurs d&#39;onde plus courtes. La plupart des optiques sont conçus pour bien performer avec 400 visibles -700 nm de lumière. 355 nm lasers offrirait certains avantages tels que six seuil de réduction du plasma, la taille plus petite place, et une longue passe dichroïque serait efficace à 100% directes de l&#39;ablation par laser à la cible et permettre l&#39;imagerie simultanée de la GFP sans perte de signal de l&#39;échantillon. Les lasers bleus nm 440 conserverait les avantages de travailler avec un laser de lumière visible (de bonnes performances avec des optiques standard et de sécurité). Malheureusement, le coût d&#39;un DPP Q-switched laser à état solide 440 nm est de 3 fois le coût d&#39;un laser 355nm ou 532 nm de puissance similaire à ce moment. Si nous devions concevoir un nouveau système pour C. elegans, où la profondeur des cibles est minime, nous opterions pour une lentille transparente aux UV (coût environ $ 3.000 pour une lentille d&#39;huile 1.3na 40x avec 50-70% de transmittance à 355nm) et un laser 355 nm produisant 50 à 10 UJ / impulsion à 1 -20 kHz. L&#39;ablation Axon est pensé pour être dû à la formation du plasma. Impulsions plus courtes produira seuils plasma à faible puissance et les volumes de plasma w<html> malades seront plus petits 6. L&#39;objectif est de produire le plasma et petit plus éphémère en ajustant l&#39;énergie d&#39;impulsion à la plus faible puissance. Agrandir les plasmas de longue durée va générer des bulles de cavitation que les dommages entourant les cellules. Nous avons généralement constaté que l&#39;ablation en utilisant environ 50-100 impulsions à la fréquence la plus élevée (c.-à 2.5kHz) donne les meilleurs résultats. Cela suggère que les dommages peuvent être progressivement intégrée sur une série d&#39;impulsions afin de mieux contrôler l&#39;étendue des dégâts. Le système d&#39;ablation laser décrite ici est très indulgent si le faisceau est aligné et élargi avec précision. Nous commençons la coupe des axones vers adultes à la puissance du laser à 10% (moyenne de 0,3 mW mesuré à 2500 Hz et environ 1 UJ / impulsion) et peut couper avec des dommages localisés limitée par la puissance de 14%. Vous pouvez observer plus grandes zones de dégâts de 15 à 39% la puissance du laser, mais seulement au-dessus 40% de puissance (environ 1 mW en moyenne mesurée à 2500 Hz) ne les vers exploser à cause de grandes bulles de cavitation et de dommages à la cuticule du ver. e_content &quot;&gt; Le Steinmeyer et al. 2010 2 papier est une excellente ressource pour construire un système d&#39;ablation laser. Leon Avery a aussi une belle description pratique d&#39;un système d&#39;ablation laser basé sur un laser à gaz N2 nm coûteux 337 et il fournit certaines pratiques très conseils (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Lorsque vous concevez votre propre système, vous devriez d&#39;abord parler avec votre représentant microscope afin de déterminer comment cibler le laser d&#39;ablation à l&#39;objectif du microscope. Votre microscope doit être monté sur une table anti-vibrations (Newport, TMI, Thor). Un haut breadboard est optimal, mais un top en acier massif peut toujours être utilisé avec positionneurs magnétiques. Un module dédié intermédiaires sur une portée verticale est agréable car tous les éléments optiques peut être laissé en place. Cependant, il peut être moins coûteux et plus commode d&#39;utiliser un port de la caméra (inversé) ou un «combinateur» attaché à un port epi-fluorescence. Vous avez besoin de connaître la taille de l&#39;ouverture arrière et la transmission (à l&#39;une<html> blation longueur d&#39;onde laser) de l&#39;objectif que vous comptez utiliser. Une fois que vous décidez sur un laser (par exemple, Crylas, TEEM, Cristal, ou CRC), vous devez contacter Thor ou de Newport pour aider à sélectionner les bons éléments d&#39;optique, matériel informatique et de sécurité. Nous avons décidé d&#39;un élargisseur de faisceau Galiléen double pour économiser l&#39;espace, mais une simple extension de Kepler est une option (F2/F1 = facteur d&#39;expansion). Un expanseur de faisceau personnalisé sera le moins cher, mais à Newport, Thor, et plusieurs des fabricants de lasers offrent une excellente qualité commerciale du faisceau extenseurs. Certains fabricants de lasers offrent également atténuateurs manuelle et à commande électronique qui peut être rentable et peu encombrant, mais pas aussi polyvalent que le polariseur de Glan-Thompson et la plaque demi-onde. Vous aurez également besoin de décider la façon de contrôler le laser. Vous pouvez concevoir un contrôleur de LabView, utilisez un générateur commerciaux TTL, ou les logiciels fournis par l&#39;entreprise au laser. Discutez des options avec le fabricant de laser spécifique. tente »&gt; Nous avons fourni une liste du matériel que nous avons utilisé seulement comme un guide général. Le système décrit ici a coûté environ $ 15 000 lorsqu&#39;elle est ajoutée à notre système d&#39;imagerie existants. Votre département Physique locales auront souvent quelqu&#39;un qui est prêt à fournir une introduction pratique à en toute sécurité travaillant avec des lasers faisceau libre. Méthodes alternatives pour l&#39;immobilisation et laps de temps d&#39;imagerie de C. elegans ont été récemment décrites. 14 Dépannage L&#39;étape la plus difficile et critique l&#39;alignement du faisceau centré étendu à l&#39;axe optique du microscope. Une fois que vous avez le faisceau centré et étendu à travers les lentilles de Galilée, vous devez travailler dur pour obtenir ce aligné à moins de 5 um de l&#39;axe optique du microscope avant d&#39;utiliser les miroirs de pilotage de l&#39;alignement final pour le centre. L&#39;utilisation excessive des miroirs de direction pour aligner le faisceau du microscope va l&#39;amener hors axe passant par le faisceauexpandeur. utilisant PRUDENCE EXTRÊME vous pouvez atténuer le faisceau laser avec le filtre ND approprié et visualiser directement le profil du faisceau laser sur une cible réfléchissante (miroir surface frontale). Vous pouvez doucement pousser le microscope avec précision le centre du faisceau dans le champ de l&#39;objectif 60X de vue (si elle ne peut pas être centré dans le haut / bas gamme dont vous avez besoin d&#39;ajuster la hauteur du rail). Le profil du faisceau peut être utilisé pour aligner avec précision l&#39;axe microscope optique pour donner un faisceau centré qu&#39;il est circulaire et «fusées» de façon symétrique. Une éruption asymétrique est une indication que l&#39;axe microscope n&#39;est pas parfaitement aligné (ou le rail n&#39;est pas de niveau). Enfin, vous devriez ajuster L3 et voir une expansion régulière et symétrique et la contraction de la poutre. Focus du microscope, précisément sur la surface cible et ensuite ajuster L3 à focaliser le faisceau laser pour la plus petite tache. Vous devriez maintenant constater que le faisceau laser est à 5 um du centre où imagé via LSCM ou CCD système et l&#39;endroit d&#39;ablation est dans1um de concentration Z. Si vous trouvez que vous &quot;sauter&quot; vers ou constamment générer de grandes bulles de cavitation à couper axones votre problème est plus probable l&#39;alignement amende de l&#39;ablation laser. Assurez-vous que le minimum (&lt;500nm) tache d&#39;ablation est localisée à la mise au point Z (ajuster la convergence avec lentille L3) et à l&#39;endroit XY fiduciaires (ajuster avec miroir cinématiquement montés dernière). Cibler les axones près de la surface, il faudra moins de puissance de laser. De même, les petits animaux (L1 et L2), il faudra moins de puissance laser pour axotomie rapport à cibler les axones même chez les adultes. Si votre axones de type sauvage ne se régénèrent pas ou l&#39;eau de Javel axones vous devriez essayer de réduire la puissance d&#39;imagerie laser ou en diminuant le taux d&#39;échantillonnage. Si vos vers meurent ou deviennent maladives essayez de réduire le Agarose pour cent dans les étapes 1%. Assurez-vous que vous ne bougez pas la lamelle, après les vers de montage comme ce sera souvent provoquent leur mort lors de l&#39;utilisation élevée parpourcentage d&#39;agarose et des microsphères. Si vos vers éclater ou meurent lors d&#39;une session time-lapse, il est dû à: 1. Pourcentage d&#39;agarose est trop élevé. 2. Dommages aux cuticules par ablation laser. 3. Mouvement de la lamelle après le montage. Si des dommages à la cuticule est en faute qu&#39;elle affectera seulement les vers montés qui ont été ciblés avec le laser d&#39;ablation. Si votre ver se déplace trop pendant une session time-lapse essayez d&#39;augmenter le pourcentage d&#39;agarose dans les étapes de 0,5%. Axones sains dans les vers sains sont toujours «actif» et d&#39;afficher un niveau homogène de la fluorescence. Si vous voyez une diminution soudaine de la fluorescence ou de l&#39;activité du ver est mourant ou mort. Plusieurs axones perlées ou fragmentées sont un signe certain d&#39;un ver mourant ou mort. Si vous avez du mal à garder votre axones se concentrer lors de la session laps de temps ensemble il peut y avoir plusieurs problèmes différents. Premièrement, vérifiez votre dérive scène par l&#39;imagerie d&#39;un échantillon inerte sur une lame de verre de plus de 10 hrs. Une dérive quelques microns peuvent être dus à l&#39;instabilité thermique, mais supérieure à 5 um est probablement dû à des problèmes mécaniques avec votre microscope. Problèmes avec le montage sont plus communs. Laissez vos vers montés s&#39;équilibrer avec votre platine de microscope pendant 30 minutes avant de commencer votre laps de temps. Vérifiez que votre sceau vaseline n&#39;ont pas développé de fuites au cours de votre session laps de temps.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> 535 nm laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal, et CRC offrent également des lasers comparables) </td></tr><tr><td> Toutes les optiques et le matériel </td><td></td><td></td><td> (Thor offre optiques comparables et matériel) </td></tr><tr><td> SUPREMA optique Mount, 1,0 de diamètre </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatique d&#39;ordre zéro Plate Wavel, Retardation vague ½, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Stade de rotation, une &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Polarisant calcite, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotation Polarisant mont </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;entretoise pour une« post diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;de hauteur, une« après Diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork, 1 message &quot;de diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Décharge de faisceau </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscope Objectif Monture </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Laser Nd: YAG miroir, 25,4 mm de diamètre, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA optique Mount, 1,0 pouces de diamètre, trou de passage de montage </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Haute précision de réglage à vis Bouton, voyages 12.7mm, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Adaptateur fileté, ¼ -20 masculins, 8-32 femelles </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Clamp pour 1,5 cm de diamètre tige </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pouces (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Transporteur ferroviaire pour le X26, carré longueur 40mm </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) de longueur </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plate-forme de tige pour tige 1,5 cm de diamètre </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pouces (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-lentille concave, diamètre 12,7 mm, 25mm-EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Lentille plan-convexe, diamètre 25,4 mm, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lentille plan-convexe, diamètre 25,4 mm, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monture fixe, 0,5 &quot;de diamètre, 1,0&quot; Hauteur d&#39;axe </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Monture fixe, 1,0 &quot;de diamètre, 1,0&quot; Hauteur d&#39;axe </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microsphères 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> Questions EEO </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser axotomie suivie par microscopie time-lapse est un test sensible des phénotypes régénération des axones dans C. elegans 1. La principale difficulté de ce dosage est le coût perçu ($ 25-100K) et de l&#39;expertise technique nécessaire pour mettre en œuvre un système d&#39;ablation laser 2,3. Toutefois, les lasers à impulsions à l&#39;état solide des coûts modestes (&lt;$ 10K) peut fournir une performance robuste pour l&#39;ablation au laser dans des préparations transparentes où les axones cibles sont «proches» de la surface du tissu. Construction et de l&#39;alignement d&#39;un système qui peut être accompli en une journée. Le chemin optique fournie par la lumière du condenseur concentré à l&#39;ablation laser fournit un guide d&#39;alignement commode. Un module intermédiaire avec toutes les optiques retiré peut être dédié à l&#39;ablation laser et assure qu&#39;aucun des éléments optiques doivent être déplacés lors d&#39;une séance d&#39;ablation laser. Un dichroïque dans le module intermédiaire permet l&#39;imagerie simultanée et l&#39;ablation laser. Centrer le faisceau laser to le faisceau sortant de la lentille de condenseur de microscope concentré guides de l&#39;alignement initial du système. Une variété de lentilles sont utilisés pour conditionner et d&#39;élargir le faisceau laser pour remplir l&#39;ouverture arrière de la lentille de l&#39;objectif choisi. L&#39;alignement final et les essais sont effectués avec une cible de surface miroir glisser façade en verre. Puissance du laser est ajustée pour donner une place de taille minimale d&#39;ablation (&lt;1um). Le spot d&#39;ablation est centré par des ajustements précis du miroir dernière cinématiquement montée en réticule fixe dans la fenêtre d&#39;imagerie. Laser de puissance pour axotomie sera d&#39;environ 10 fois plus élevée que celle nécessaire pour la tache d&#39;ablation minimale sur la diapositive cible (cela peut varier avec la cible que vous utilisez). Les vers peuvent être immobilisés pour le laser axotomie et imagerie time-lapse en montant sur ​​des patins d&#39;agarose (ou en microfluidique chambres 4). Coussinets Agarose sont facilement faites avec 10% d&#39;agarose dans une solution saline équilibrée fondu dans un four micro-ondes. Une goutte d&#39;agarose fondu est placé sur une lame de verre et aplatie avec un autrelame de verre dans un pavé d&#39;environ 200 um d&#39;épaisseur (une seule couche de ruban de temps sur des lames adjacentes est utilisé comme une entretoise). Un &quot;Sharpie&quot; bouchon est utilisé pour découper un bloc de diamètre uniforme circulaire de 13mm. Anesthésique (1UL Muscimol 20mm) et des microsphères (Chris Fang-yen communication personnelle) (1UL 2,65% polystyrène 0,1 um dans l&#39;eau) sont ajoutés au centre du pavé suivie par 3-5 vers orienté de sorte qu&#39;ils sont couchés sur leurs côtés gauche. Une lamelle de verre est appliquée et ensuite la vaseline est utilisé pour sceller la lamelle et d&#39;empêcher l&#39;évaporation de l&#39;échantillon.

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Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomie suivie par imagerie time-lapse est une manière sensible pour doser les effets des mutations dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Sur la régénération axonale. Une haute qualité, mais peu coûteux, le système d&#39;ablation laser peut facilement être ajouté à la plupart des microscopes. Laps de temps d&#39;imagerie plus de 15 heures nécessite une immobilisation attention du ver.

Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

15.3K vues.  University of Utah. Laser axotomie suivie par imagerie time-lapse est une manière sensible pour doser les effets des mutations dans C. elegans Sur la régénération axonale. Une haute qualité, mais peu coûteux, le système d'ablation laser peut facilement être ajouté à la plupart des microscopes. Laps de temps d'imagerie plus de 15 heures nécessite une immobilisation attention du ver.