Ce protocole nous permet d’identifier les voies de guidage axon actives dans le nerf oculomotrice et d’évaluer leurs rôles à différents points le long de la trajectoire nerveuse en temps réel. Cette technique préserve les environnements locaux par lesquels les axones voyagent et leurs cibles finales. Les axones en croissance ne sont pas coupés, de sorte que la croissance initiale de l’axon, plutôt que la régénération, peut être évaluée.
Cette méthode fournit un aperçu de la conduite axon dans le système moteur oculaire, mais pourrait être adapté à l’étude de la conduite axon d’autres nerfs. Cette technique prend la pratique pour maîtriser, et travailler rapidement est extrêmement important. Lorsque vous l’essayez pour la première fois, n’utilisez que quelques embryons, plutôt qu’une portée entière.
Avant de commencer l’intervention, confirmez d’abord la grossesse par ultrasons le jour embryonnaire 10,5 d’un accouplement insoituré. Récoltez les embryons, vaporisez l’abdomen de la souris enceinte avec 70% d’éthanol, et utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale pour extraire l’utérus. Laver l’utérus dans une boîte de Pétri de HBSS glacé avant de placer l’organe dans une deuxième boîte de Petri de HBSS fraîchement glacé.
Dans le cadre d’une dissécation, retirer les embryons de la corne utérine et de leurs sacs amniotiques individuels, en plaçant chaque embryon sur le dessous du couvercle d’une plaque de 12 puits, sur la glace, au fur et à mesure qu’ils sont récoltés. Utilisez du papier filtre pour enlever tout liquide entourant chaque embryon, sans toucher les embryons eux-mêmes, et submergez les embryons dans de l’agarose liquide à faible fondante. Placez le couvercle de la plaque sur la glace pour solidifier l’agarose.
Lorsque l’agarose s’est durcie, retournez les embryons et couvrez l’autre côté de chaque échantillon d’agarose supplémentaire. Lorsque le deuxième volume d’agarose s’est solidifié, utilisez un microscope à dissection de fluorescence pour couper l’agarose autour de chaque embryon afin que chaque embryon soit bien orienté sur le stade vibratoire. Les noyaux oculomotor et les excroissances précoces d’axon devraient être fluorescents.
Alignez chaque embryon de sorte que le noyau, les axones en croissance et les yeux forment une ligne, et utilisez une lame de rasoir pour couper l’agarose parallèle à cette ligne. Ensuite, remplissez la chambre vibratoire avec un tampon de tranche glacée, et supergluez le premier embryon au stade vibratome de sorte que la lame sera parallèle avec le noyau oculomotrice et les yeux. Lorsque la superglue est sèche, submergez le stade vibratome de sorte que l’embryon est orienté vers l’extérieur de la lame, et utilisez une nouvelle lame vibratoire pour obtenir des tranches de 400 à 450 micromètres.
Utilisez une pipette de transfert stérile pour transférer chaque tranche dans un tampon de tranchage froid au fur et à mesure de son acquisition, et utilisez le microscope à disséquer la fluorescence pour sélectionner la tranche contenant les noyaux et les yeux oculomotor. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, transférer la tranche sur un insert de culture cellulaire dans une plaque de six puits contenant 1,5 millilitres de milieu de culture par puits, et placer la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Retirer l’agarose résiduelle du stade vibratoire et supergluer l’embryon suivant sur la scène, en continuant à recueillir des tranches jusqu’à ce que tous les embryons aient été sectionnés et plaqués.
Ajoutez ensuite la concentration appropriée de l’inhibiteur ou de la molécule recombinante d’intérêt, diluée dans un solvant approprié, au milieu de chaque puits. Créez une courbe dose-réponse. Imagez les tranches toutes les 30 minutes par contraste de phase et microscopie fluorescence jusqu’à 72 heures.
Pendant le développement in utero normal, les premiers axones oculomotor fluorescents verts positifs à la protéine atteignent l’orbite par jour embryonnaire 11.5 avant de ramifions à leurs cibles finales, comme observé dans cette culture représentative de tranche. L’orientation de la tranche sur le stade vibratoire est cruciale, car les tranches ne sont pas interprétables si elles ne sont pas orientées correctement. Par exemple, si l’embryon est incliné sur le côté, un seul noyau oculomoteur sera observé dans la tranche.
Si l’embryon incorporé est incliné trop loin vers son dos, les yeux ne seront pas présents dans la tranche, et au lieu de cela le membre supérieur et l’arrière-cerveau ou la moelle épinière peuvent être inclus. Il est également important de faire en sorte que pendant le placement de la tranche sur la membrane de culture, que le tissu ne se plie pas. Prenez soin de dissoudre les inhibiteurs et les facteurs de croissance dans les solvants organiques.
Par exemple, dans cette expérience, la tranche est morte après l’ajout d’éthanol au milieu. N’oubliez pas de tout garder sur la glace et de minimiser le temps entre l’extraction des embryons et le placement des tranches dans l’incubateur. En utilisant cette technique, nous avons commencé à identifier d’autres mécanismes de guidage axon à l’œuvre dans le système moteur oculaire.
N’oubliez pas de faire preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des lames de rasoir et que certains inhibiteurs peuvent être dangereux et doivent être manipulés avec soin selon leur profil de sécurité.
