Nous remercions le Dr Takahiko Matsuda pour fournir le pCAG-mCherry construire. YCM est soutenu par une bourse de développement de carrière de la Fondation Schweppe et une subvention de la Fondation Whitehall.

1. Fourniture de préparation (pas dans la vidéo) <ol><li> Préparer une dilution fraîche 1X de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) dans du PBS 1X. Pas plus de 50 ml est nécessaire. Filtrer avec un filtre de 0,22 um seringue. </li><li> Préparer des constructions d&#39;injection en combinant souhaités constructions plasmidiques. Nous avons mis toutes les constructions dans le vecteur pCAG-Drapeau, avec une stoechiométrie appropriée pour un volume final de 10 uL ~. En outre, pCAG-GFP 14 ou pCAG-mCherry devrait être ajouté pour une efficacité d&#39;électroporation de suivi et de cellules électroporées. Nous utilisons pCAG-mCherry pour cette expérience. Enfin, ajouter 0,22 um-filtrée de colorant vert rapide dans le mélange d&#39;ADN plasmidique à une concentration finale de 0,05% à visualiser l&#39;efficacité d&#39;injection dans midbrains chiches embryonnaires. </li></ol> 2. Préparation des oeufs (en vidéo) <ol><li> Dans le but d&#39;acquérir étape HH 11 embryons, les oeufs doivent être incubés à 100 ° F (37,8 ° C) pendant environ 41 heures après la fécondation avec une humidité de 25-40%. Lieuoeufs, de leur côté et marquer le début de chaque tableau de bord avec un crayon. Placez les plateaux dans un pré-chauffé, incubateur humidifié. Lentement balancer des oeufs en réglant la fonction de rotation de plates-formes incubateur pour &quot;Automatique&quot;. Vérifier le niveau d&#39;humidité et l&#39;eau toutes les 24 heures. </li><li> Juste avant de commencer l&#39;expérience, retirer les oeufs de l&#39;incubateur et laisser à température ambiante. Cela aidera à ralentir le développement et prévenir plus de développement. </li><li> Nettoyer la surface de chaque œuf avec de l&#39;éthanol 70% et essuyer avec un Kimwipe. </li><li> Prenez deux 4 pièces cm de scotch et de les coller côte à côte sur l&#39;œuf de faire un grand rectangle sur le tableau de bord crayon. Lisser la bande contre l&#39;œuf. C&#39;est là que la fenêtre ne sera effectué. La bande empêche petits morceaux de coquille d&#39;oeuf de tomber lorsque la fenêtre est découpé. </li><li> Utilisez une seringue de 10 ml et 18 ½ aiguille de la jauge de tirer 5 mL de sortir l&#39;albumine de l&#39;œuf. Après avoir percé la coque, l&#39;angle de l&#39;aiguille loin de la jaune à ne pas perturberou endommager l&#39;embryon tout en retirant l&#39;albumine. Nettoyez l&#39;aiguille avec de l&#39;éthanol à 70% entre les œufs, mais assurez-vous que l&#39;aiguille est sec avant de percer l&#39;œuf suivant. </li></ol> 3. Préparation de verre aiguille d&#39;injection (en vidéo) <ol><li> Les aiguilles ne sont faites en utilisant les paramètres suivants sur une Flaming / Brown Micropipette Puller (modèle d&#39;instrument Sutter P-97):. De chaleur 670, Pull 120, Vel 40, heure 165 Mondiale Precision Instruments (API) 4 pouces de 1,0 mm à paroi mince capillaire en verre (API TW100F-4) est utilisé pour faire des aiguilles. </li><li> Chargez une aiguille de verre tiré à l&#39;aide d&#39;une pipette P10 et le long bout de capillaire de chargement de pointes de pipettes (Eppendorf 5,242,956,003). Chargez ul 5-10, en fonction du nombre d&#39;oeufs destinés à être injectés. Remplir le verre de l&#39;aiguille lentement, créant une colonne continue de solution de plasmide absente de bulles d&#39;air. </li><li> Placer l&#39;aiguille chargée dans le porte-aiguille fixée à la micromanipulateur (Narishige MM3) et le micro-injecteur Picospritzer III. Voir l&#39;aiguille sous un dissectisur microscope et de l&#39;assiette de l&#39;aiguille à l&#39;endroit où le fluide vert cesse. Il permet d&#39;utiliser un fond sombre pour mieux visualiser l&#39;aiguille. Aiguille appropriée coupe vient avec la pratique. </li></ol> 4. Mésencéphale / injection du tube neural (en vidéo) <ol><li> Utilisez des ciseaux à ressort pour couper une fenêtre de 2-2,5 cm de diamètre dans l&#39;œuf. Début de la fenêtre de la précédente trou d&#39;aiguille fait lors de l&#39;élaboration d&#39;albumine, et faire tourner l&#39;oeuf dans votre main que vous coupez. Assurez-vous de nettoyer les ciseaux avec un Kimwipe saturée dans de l&#39;éthanol à 70% entre les œufs. </li><li> Voir les embryons de poulet sous un microscope à dissection. Il peut être nécessaire de former les yeux. Il peut aider à visualiser l&#39;embryon en injectant 0,22 um-filtrée d&#39;encre de 20% en Inde dans le PBS en vertu de l&#39;embryon de poulet. Toutefois, nous avons constaté que cette étape devrait être évité autant que possible, car il tend à diminuer la survie. </li><li> Injection est plus efficace si l&#39;embryon est positionné en parallèle à la trajectoire de l&#39;aiguille, avec la tête loin de l&#39;aiguille.Lentement percer le tube neural à un angle de 45 degrés à la jonction mésencéphale-rhombencéphale. Il est très critique à ne remplir que la vésicule neurones représentant du mésencéphale avec l&#39;ADN plasmidique et rapide colorant vert, sans diffusion significative dans les régions du cerveau antérieur et postérieur. Commencer à injecter avec la durée de l&#39;ensemble de micro-injecteur Picospritzer de moins 25 ms, ce qui peut être nécessaire de modifier en fonction de l&#39;aiguille coupe. En général, utiliser entre 10-50 ms. </li></ol> 5. L&#39;électroporation (en vidéo) <ol><li> Récupérer l&#39;aiguille d&#39;injection. Placer 3 gouttes de Pen 1X / Strep dans une solution de PBS dans l&#39;œuf sur l&#39;embryon. </li><li> Vérifiez les paramètres de la électroporateur BTX EMC830: <table border="1"><tbody><tr><td> TENSION: </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> Durée d&#39;impulsion: </td><td> 25 ms </td></tr><tr><td> IMPULSIONS #: </td><td> 3 </td></tr><tr><td> INTERVALLE: </td><td> 500 ms </td></tr><tr><td> POLARITE: </td><td&gt; UNIPOLAIRE </td></tr></tbody></table></li><li> Placer les électrodes de platine de 2 mm de long en forme de L au même niveau horizontal que le fond du tube neural, avec le mésencéphale embryonnaire assis au milieu entre deux électrodes de 3 mm en dehors. Aligner les électrodes avec le fond du tube neural est critique pour l&#39;électroporation efficace du mésencéphale ventral. Pour atteindre le mésencéphale spécifique électroporation, nous avons remplacé les électrodes d&#39;origine BTX avec deux faits sur platine en forme de L avec électrodes courtes 2 mm pointes longues. Ces électrodes de platine sont en 0.5mm de diamètre (fils de platine Alfa Aesar). Ces électrodes de platine sont juste assez longtemps pour couvrir le mésencéphale d&#39;un embryon de poulet étape 11, qui est d&#39;environ 0,9 mm de long, sans cibler une grande partie de la ou des régions du cerveau antérieur rhombencéphale. Appuyez sur la pédale BTX fois. Les bulles d&#39;air doivent être générés autour des électrodes avec chaque électroporation réussie. Retirez délicatement les électrodes de l&#39;œuf et essuyez l&#39;électrodes avec un Kimwipe 70% d&#39;éthanol-couverte. Placez un autre 3 gouttes de Pen 1X / solution Strep dans l&#39;œuf, sur l&#39;embryon. </li><li> Couvrez la fenêtre avec un 5 cm x 5 cm pièce de ruban d&#39;emballage transparent. Assurez-vous de sceller l&#39;œuf bien et que le contenu des œufs ne viennent pas en contact avec la bande. </li></ol> 6. Incuber et Harvest <ol><li> Placez les oeufs de retour dans l&#39;incubateur. Assurez-vous que le tournage de plates-formes incubateur est OFF. Incuber les œufs jusqu&#39;à ce que le stade de croissance désiré HH 23 est atteint. </li><li> Les embryons vivants de récolte et de les placer dans des boîtes de Pétri communes du PBS-remplis pour chaque condition. Ecran récolté embryons en vertu d&#39;un microscope à dissection fluorescente, en gardant seulement les embryons avec l&#39;expression mCherry. </li><li> Transfert d&#39;embryons dans des puits individuels d&#39;un plat de 24 puits. Remplir chaque puits avec 1 ml de paraformaldéhyde 2% fraîchement préparée (PFA) et permettent de fixer les 2-3 heures à 4 ° C. </li><li> Laver embryons fixes trois fois pendant 10 minutes chacun dans du PBS. Embryons de manière séquentielle in 15% et 30% de saccharose jusqu&#39;à équilibrée. Les embryons seront d&#39;abord flotter dans du saccharose, mais va couler sur l&#39;équilibration. </li><li> Vérifiez embryons en vertu d&#39;un microscope à dissection fluorescente, prenant des notes sur le modèle d&#39;expression et le niveau mCherry pour chaque embryon. Intégrer chaque embryon en oct. Il est très important pour les embryons d&#39;orienter correctement afin de générer des sections optimales du mésencéphale pour des analyses ultérieures (figure 1). </li><li> Préparer 18 um d&#39;épaisseur à l&#39;aide des sections du mésencéphale un cryostat Leica CM3050S. Analyser le développement du mésencéphale et la différenciation des neurones dopaminergiques par immunomarquage avec marqueurs appropriés de type de cellules. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Une représentation schématique du électroporation et l&#39;analyse du mésencéphale poussin embryonnaire est illustré à la figure 1. Dans les embryons de poulet avec succès injectés et électroporation, l&#39;expression mCherry doit être visible dans la région du mésencéphale, après développement ( <strong&gt; figure 2A, B, C). En supposant que mCherry en corrélation avec l&#39;expression d&#39;autres gènes co-électroporation, les embryons présentant une expression mCherry dite peut alors être fixé et intégré pour préparer cryosections mésencéphale pour complément d&#39;étude (figure 2D). En règle générale, environ 50% des progéniteurs neuronaux mésencéphale ventral peut être efficacement transfectées avec le protocole ci-dessus. La spécification du destin dopaminergique dans électroporées progéniteurs neuronaux peuvent être examinés par la co-localisation des mCherry, Drapeau-étiqueté gène, avec des marqueurs de neurones dopaminergiques tels que la tyrosine hydroxylase (TH) (figure 3). La structuration des domaines progénitrices dans mésencéphale ventral peut être étudié par la co-immnostaining cryosections avec différents marqueurs de domaine progénitrices. Expression mCherry insuffisante suggère que les gènes extra-utérines sont probablement pas exprimé efficacement. Les embryons de moins cette condition ne doit pas être utilisé pour des études ultérieures. De même, les embryons quin&#39;a pas survécu à la fin de la procédure expérimentale ne peut pas être utilisé pour la collecte de données et d&#39;analyse. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> Figure 1. Illustration du mésencéphale poussin embryonnaire en test électroporation in ovo. HH étape 11 embryons de poulet embryonnaires sont injectés avec pCAG-mCherry avec les gènes d&#39;intérêt mélangés avec vert rapide de visualiser le processus d&#39;injection (A). Après avoir rempli avec des constructions d&#39;ADN, sont midbrains électroporation avec un électroporateur onde carrée. Les embryons sont ensuite incubés jusqu&#39;à l&#39;étape souhaitée HH 23 est atteint. Puis mCherry-positifs embryons sont récoltés, fixé, et intégré (B). Cryosections mésencéphale sont préparés avec les plans de coupe indiquées par la ligne blanche dans la figure 1B, et analysées par immunomarquage avec des marqueurs du mésencéphale tels que la tyrosine hydroxylase (TH) (C). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici</a>pour agrandir la figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> Figure 2. Préparation de cryosections de mésencéphale embryonnaire de poulet. Après 41 heures d&#39;incubation, HH embryons au stade poussin 23 exprimant mCherry et les gènes d&#39;intérêt sont récoltées (A, B et C), fixé par l&#39;IFP, traités avec du saccharose, et intégré dans l&#39;OCT pour cryosectioning. Embryons de poulet sont soigneusement orientés pour assurer la préparation des sections du mésencéphale. Une morphologie embryonnaire typique et le plan de coupe pour l&#39;obtention de sections du mésencéphale sont indiqués (D). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> Figure 3. Analyse des sections du mésencéphale électroporées. Cryosections à partir d&#39;embryons présentant des niveaux élevés d&#39;expression mCherry (A) sont préparées et colorées avec antibods qui reconnaissent le drapeau-étiqueté gène d&#39;intérêt (B) et le mésencéphale neurone dopaminergique marqueur TH (C). Midbrains embryonnaires électroporés avec pCAG-mCherry et pCAG-Drapeau vecteur vide servir de témoin. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt potentiels à révéler contradictoires.

Le électroporation in ovo de mésencéphale embryonnaire de poulet offre un faible coût et alternative rapide à la génération d&#39;animaux transgéniques ou knock-out pour effectuer une étude in vivo des fonctions des gènes dans le mésencéphale neurone dopaminergique développement. Utilisation à court de 2 mm des électrodes de platine longues en forme de L avec injection d&#39;ADN embryonnaire mésencéphale spécifique est la clé pour parvenir à une expression efficace du gène...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Des œufs de poule fécondés </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Egg incubateur </td><td> Fabrication GQF </td><td> 1502 Sportsman </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporateur </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Électrodes </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0162 en forme de L genetrodes </td><td> Pour une utilisation avec ECM830 électroporateur </td></tr><tr><td> Iridium Platinum </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 mm de diamètre Pour effectuer les 2 mm électrodes longues </td></tr><tr><td> Tube capillaire en verre </td><td> Instrument de précision du monde </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader pointe de pipette </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Encre de Chine </td><td> Staples </td><td></td><td> Filtrer 20% avant l&#39;utilisation </td></tr><tr><td> Microinjecteur </td><td> Automatisation Parker, Parker Hannifin coopération </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection fluorescent </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette extracteur </td><td> Instrument Sutter </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

Les neurones dopaminergiques situés dans le mouvement de lutte mésencéphale ventral, le comportement affectif, et les mécanismes de récompense 1-3. Le dysfonctionnement de la ventrale du mésencéphale dopaminergique neurones est impliquée dans la maladie de Parkinson, la schizophrénie, la dépression et la démence 1-5. Ainsi, l&#39;étude de la régulation de la différenciation des neurones dopaminergiques du mésencéphale pourrait non seulement fournir des indications importantes sur les mécanismes régulant le développement des neurones du mésencéphale et la spécification sort géniteur, mais aussi aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter une variété de troubles neurologiques de l&#39;homme. Les neurones dopaminergiques différencier de progéniteurs neuronaux qui bordent la zone ventriculaire du mésencéphale ventral embryonnaire. Le développement des progéniteurs neuronaux est contrôlé par des programmes d&#39;expression génique 6,7. Nous rapportons ici les techniques qui utilisent l&#39;électroporation pour exprimer des gènes spécifiquement dans le mésencéphale de Hamburger Hamilton (HH) étape 11 (esomites irteen, 42 heures) les embryons de poulet 8,9. Le développement externe d&#39;embryons de poulet permet de pratiques spécifiques à des manipulations expérimentales stades embryonnaires, avec des effets déterminés à des moments plus tard, de développement 10-13. Poussin tubes neuraux embryonnaires antérieures à l&#39;étape SA 13 (dix-neuf somites, 48 ​​heures) sont constitués de cellules progénitrices neurales pluripotentes qui sont capables de se différencier en cellules types distincts du système nerveux. Le vecteur pCAG, qui contient à la fois un promoteur CMV et un poussin β-actine enhancer, permet l&#39;expression robuste de drapeau ou d&#39;autres constructions épitope-étiquette dans des tubes de poulet embryonnaires neurales 14. Dans ce rapport, nous insistons sur les mesures spéciales pour parvenir à l&#39;expression des gènes au niveau régional restreint dans embryonnaires du mésencéphale progéniteurs neuronaux dopaminergiques, y compris comment injecter de l&#39;ADN construit spécifiquement dans la région du mésencéphale embryonnaire et comment repérer électroporation avec de petites électrodes sur-mesure. Analyser cmésencéphale hick à des stades ultérieurs fournit une excellente système in vivo pour plasmide vecteur à médiation de gain de fonction et de la perte de fonction des études de développement mésencéphale. Modification du système expérimental peut prolonger le test à d&#39;autres parties du système nerveux pour effectuer une analyse de cartographie et d&#39;enquêter sur le sort de la régulation de l&#39;expression génique.

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In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Pour évaluer la fonction et la régulation des gènes lors du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale, nous décrivons une méthode qui consiste à<em&gt; In ovo</emÉlectroporation&gt; des constructions d&#39;ADN plasmidique en embryonnaires progéniteurs chiches mésencéphale ventral de neurones dopaminergiques. Cette technique peut être utilisée pour obtenir une expression efficace des gènes d&#39;intérêt pour étudier différents aspects du développement du mésencéphale et la différenciation des neurones dopaminergiques.

En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

in-ovo-electroporation-chick-midbrain-for-studying-gene-function

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

11.3K vues.  Children's Hospital of Chicago Research Center. Pour évaluer la fonction et la régulation des gènes lors du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale, nous décrivons une méthode qui consiste à In ovo des constructions d'ADN plasmidique en embryonnaires progéniteurs chiches mésencéphale ventral de neurones dopaminergiques. Cette technique peut être utilisée pour obtenir une expression efficace des gènes d'intérêt pour étudier différents aspects d...

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Recherche

Neurosciences

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Application d&#39;une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Étudier le fonctionnement du cerveau chez les enfants à l’aide de magnétoencéphalographie

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...