Ce projet a été financé par le Knut et Alice Wallenberg Foundation et le Conseil de recherche suédois.

1. Clonage de la fusion de cibles gene/ABDz1-tagged construire <ol><li> Préparer des fragments PCR du gène ABDz1 flanqué par des sites de restriction appropriée pour N-terminal de la ligature du gène cible dans le plasmide d&#39;expression (un plasmide contenant ABDz1 est disponible gratuitement grâce à un accord de transfert de matériel). </li><li> Enchaînement d&#39;expression purifiée vecteur et fragments PCR avec des enzymes de restriction choisies dans un tampon de réaction appropriée. Purifier les produits avant la ligature. </li><li> Ligaturer les restreint ABDz1 fragment dans le vecteur d&#39;expression contenant le gène d&#39;intérêt et de transformer le produit de ligature à E. coli (dans la méthode originale la souche RR1ΔM15 a été utilisé 8). Fais cellules transformées sur des plaques d&#39;agar supplémenté avec des antibiotiques appropriés pour la sélection. </li><li> PCR écran un peu de colonies et la séquence de vérifier la cassette d&#39;expression résultant par séquençage d&#39;ADN. </li><li> Préparer plasmidique à partir d&#39;une culture de nuit d&#39;une séquence verifcolonie IED et de transformer la souche d&#39;expression préféré (dans la méthode de E. coli d&#39;origine Rosetta (DE3), organise un PRARE plasmidique pour améliorer la production des protéines codées par les gènes humains, ont été utilisés). </li></ol> 2. L&#39;expression des protéines <ol><li> Inoculer une seule colonie bactérienne dans 10 ml de bouillon de soja tryptique supplémenté avec 5 extrait de levure g / l et des antibiotiques appropriés. Incuber à 150 rpm à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Inoculer 1 ml de culture de la nuit dans 100 ml de milieu frais et d&#39;induire l&#39;expression des protéines (à l&#39;origine une mM d&#39;isopropyl-β-D-thiogalactoside quand un opéron lac a été utilisé) quand les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique. </li><li> Incuber à 150 rpm à 25 ° C durant la nuit les cellules et la récolte par centrifugation. </li></ol> 3. Purification par affinité orthogonale <ol><li> Reprendre le culot dans 25 ml de tampon de fonctionnement (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (p / v) de Tween 20, pH 8,0) et perturber èmee cellules par sonication à une amplitude de 60% et 1.0/1.0 impulsions pendant 3 min. Centrifuger l&#39;échantillon et le filtre de la protéine cible contenant surnageant (0,45 um) avant une purification supplémentaire. </li><li> Equilibrer soit un 1 ml HSA Sépharose colonne ou une colonne de NHS-activated, précédemment couplé avec HSA selon les recommandations du fournisseur, avec 10 volumes de colonne (CV) de course de tampon à 1 ml / min sur un système de purification de protéines adéquat. Chargez le lysat bactérien à 0,5 ml / min, puis remettre le débit à 1 ml / min. </li><li> Laver la colonne avec 5 CV de tampon de migration suivies de 5 CV de tampon de lavage (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5). </li><li> Eluer l&#39;échantillon avec le tampon d&#39;élution (0,5 M HAC, pH 2,5) à 1 ml / min et de recueillir des fractions, l&#39;absorption à 280 nm suivre pour sélectionner les fractions du pic élué d&#39;une purification supplémentaire. </li><li> Piscine les fractions avec la plus forte concentration de protéines, diluer deux fois en tampon de migration Sure (phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) etAssurez-vous que le pH se situe autour de neutre. Ajouter 1 M Tris-HCl pH 8 pour augmenter le pH si nécessaire. </li><li> Chargez l&#39;échantillon à 0,5 ml / min sur une colonne de 1 ml MabSelect HiTrap SuRe qui a été équilibrée avec 10 CV de tampon de migration sûr à 1 ml / min. Réinitialiser le débit à 1 ml / min après le chargement. </li><li> Laver la colonne avec 5 CV de tampon de migration Sure (étape 5) et éluer les protéines avec 0,2 M HAC, pH 2,7. Pour les protéines cibles sensibles de l&#39;éluat peut être neutralisé directement sur la collecte par addition de Tris-HCl. </li></ol> Si les étapes chromatographiques sont inversés l&#39;éluat de la colonne de MabSelect sûr qu&#39;il puisse être dilués dans un tampon (étape 3.1) et l&#39;augmentation du pH à environ 8 par addition de 1 M Tris-HCl. En général, plus étroit pics sont observés lorsque la matrice Sure est employé dans la deuxième étape. 4. Evaluation de la pureté par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyl polyacrylamide (SDS-PAGE) <ol><li> Chargez les fractions purifiées sur uneréduire SDS-PAGE et, si désiré, d&#39;analyser le poids moléculaire du produit purifié par spectrométrie de masse. Il est important de réduire complètement l&#39;échantillon depuis une cystéine libre dans ABDz1 peut provoquer la dimérisation du produit sous conditions non réductrices. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Comme une preuve de principe, de purification par affinité orthogonale facilitée par la balise ABDz1 a été évaluée pour trois protéines cibles humaines représentant les classes de solubilité différentes, des poids moléculaires et points isoélectriques (tableau 1). Le gène a été génétiquement fusionné ABDz1 aux gènes cibles et les constructions ont été exprimées dans E. coli, la figure 2 montre un organigramme pour toutes les étapes de la méthode consécutivement. Après purification par le protocole orthogonales, les échantillons prélevés à différents points ont été analysés par SDS-PAGE (figure 3). Les résultats montrent clairement l&#39;utilité d&#39;une balise double et deux étapes de purification très spécifique. Même si la pureté raisonnable est achieved après l&#39;étape de purification initiale comme on le voit à partir des gels, l&#39;étape successive donne un produit très pur bien adapté pour des applications très exigeantes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" /> Figure 1. Conception de la bibliothèque combinatoire utilisée pour la sélection de l&#39;bispécifique ABDz1 tag. Les 46 acides aminés se replie de domaine albumine contraignant dans un bundle stable à trois hélices et il contient un site de liaison pour l&#39;albumine sérique humaine principalement situés à la deuxième hélice. Par génétiquement aléatoire onze surface exposée acides aminés situés dans la première hélice et de la troisième, une surface nouvelle liaison était conçu. Les onze positions sont indiquées sur la figure et numérotés selon Kraulis et al. 9. Après biopanning contre un dimère de la Z-domaine de la protéine A du staphylocoque à la bibliothèque combinatoire exprimé sur phage, la molécule bispécifique ABDz1 a été identifié. <img alt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Un organigramme simplifié pour le protocole de purification par affinité orthogonale. Une PCR-fragment contenant la séquence ABDz1 est ligaturé (N-terminale) avec un gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression approprié. Le produit de ligation est transformé en E. coli pour la vérification de séquence et préparation de plasmide. Suite à la transformation d&#39;un hôte d&#39;expression, d&#39;une culture à grande échelle pour l&#39;expression de protéines recombinantes est mis en place à partir d&#39;une culture initiale pendant la nuit. Les bactéries sont récoltées par centrifugation et lysées par sonication pour produire lysat bactérien contenant la protéine cible. Après une étape de filtration pour éliminer les résidus de particules solides, le lysat est soumis à la purification par affinité orthogonale sur un système de manipulation des liquides en subissant deux étapes de purification dans la succession. Pics élués des deux étapes de purification sont échantillonnés et évalués par SDS-PAGE pour évaluer la pureté et par rapport à tIl lysat avant purification. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" /> Figure 3. Analyse SDS-PAGE de protéines cibles exprimées et purifiées en fusion avec ABDz1. Des échantillons prélevés dans le lysat bactérien de trois protéines exprimées dans la fusion à ABDz1, représentant des propriétés différentes, et la balise elle-même étaient ABDz1 collectés avec des échantillons provenant des pics correspondants provenant de la purification sur une colonne de HSA-suivi par un MabSelect Sure-colonne (A) . Pistes 1-4 représentent des échantillons à partir de lysats avant la purification, les voies de l&#39;HSA 5-8 de purification (première étape) et les voies 9-12 de la purification MabSelect Sure (deuxième étape). Les échantillons sont chargés dans l&#39;ordre suivant: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 et ABDz1. En outre, les échantillons acquis à partir des lysats même purifiée dans l&#39;ordre inverse sur les mêmes colonnes ont été analysés (B). Pistes 1-3 représentent des échantillons à partir de lysats avant purification, pistes 4-6 fROM MabSelect Sure-purification (première étape) et les ruelles de 7-9 HSA-purification (deuxième étape). Les échantillons ont été chargés dans le même ordre que dans (A) mais la balise elle-même n&#39;est pas inclus. De ces résultats, il est clair que cette méthode en deux étapes rendements protéines hautement purifiées indépendamment de l&#39;ordre dans lequel les étapes sont appliquées. <table border="1"><tbody><tr><td> B Nom </td><td> Protéine cible Uniprot c </td><td> Moléculaire poids (kDa) </td><td> Solubilité Classe D </td><td> Poids moléculaire du produit de fusion (kDa) </td><td> Point isoélectrique du produit de fusion </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Poids moléculaire de ABDz1 tag seul est de 6,3 kDa, point isoélectrique 6,7. </li><li> Protéine cible représente une partie de la protéine Uniprot. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Classe de solubilité du fragment de la protéine N-terminal avec son 6 ABP 10. </li></ol> Tableau 1. Protéines cibles et des produits de fusion avec une étiquette de ABDz1 évaluée dans une étude de validation de principe. Trois protéines humaines uniques avec un poids moléculaire différent, la solubilité et le point isoélectrique ont été choisis pour l&#39;expression et la purification par l&#39;approche par affinité orthogonale.

<ol>
	<li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+most+of+affinity+tags.">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification.">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li><li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin.">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li><li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein.">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li><li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification.">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+affinity+domains+for+the+detection,+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins.">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li><li>R&#252;ther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts.">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li><li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle:+a+heteronuclear+NMR+study.">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein.">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li><li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins.">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery.">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery.">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le protocole de purification par affinité orthogonale présentée ici permet une purification efficace d&#39;une large gamme de protéines cibles. En combinant le site inhérentes liaison du domaine albumine contraignant avec une surface nouvelle liaison, une petite protéine tag bispécifique a été développé. Il est très simple à utiliser la balise car il peut simplement être cloné et exprimé dans la fusion à une protéine d&#39;intérêt dans tout vecteur d&#39;expression privilégié. L&#39;équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires peuvent être employées pour la purification des protéines en deux étapes. Puisque la fonction de l&#39;étiquette ABDz1 dépend repliement correct du domaine d&#39;exposer efficacement ses deux surfaces de liaison, la méthode est limitée aux protéines exprimées sous forme soluble et ne conviennent pas pour des purifications dans des conditions dénaturantes. Les agents réducteurs devraient également être évités car ils interfèrent avec la liaison de ABDz1 au Z-domaine sur le MabSelect matrice sûr. Orthogonal affinité purificationtion fournit une alternative utile aux méthodes traditionnelles afin de satisfaire les exigences de protéines hautement purifiées dans de nombreuses applications exigeantes. Dans le même temps, cette méthode élimine le besoin de marquage combinatoire lorsque des stratégies de purification différents sont utilisés dans la succession. Pour les applications nécessitant une protéine cible natif, un site de clivage de la protéase peuvent être introduits pour rendre élimination enzymatique de la balise ABDz1 possible 11. Par ailleurs, la balise ABDz1 est le premier domaine bispécifique petite protéine et plié décrites à ce jour. Il est unique car elle fournit une stratégie de purification qui repose sur deux interactions cibles affinité spécifique. Dans l&#39;avenir, il serait intéressant d&#39;étendre ce concept en développant de nouvelles étiquettes qui portent bispécifique nouvelles surfaces de liaison qui sont compatibles avec facilement disponibles et peu coûteux des résines chromatographiques. Par exemple, en remplaçant les acides aminés impliqués dans la liaison albumine avec des résidus de base, un tag compatible avec isur la chromatographie d&#39;échange peut être réalisable. Un concept similaire a été prouvé efficace par le génie chargé de la Z-domaine pour générer les balises connue sous le nom d&#39;acide Z 12 et Z 13 de base compatible avec les anions et de cations échange, respectivement.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Bouillon de soja tryptique </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> L&#39;extrait de levure </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Sonicateur cellules Vibra </td><td> Sonics et les matériaux </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sépharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Ancien produits </td></tr><tr><td> HiTrap SuRe MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS-activated colonne HP </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag

En raison des coûts élevés associés à la purification de protéines recombinantes les protocoles doivent être rationalisées. Pour haut-débit efforts, il existe une demande pour des méthodes générales qui ne nécessitent pas l&#39;optimisation des protéines cibles spécifiques 1. Pour y parvenir, les balises de purification qui peut être génétiquement fusionné au gène d&#39;intérêt sont couramment utilisés 2. La poignée de l&#39;affinité la plus largement utilisée est la balise hexa-histidine, qui est approprié pour la purification de fois dans des conditions natives et dénaturantes 3. La charge métabolique pour la production de la balise est faible, mais il ne fournit pas que la spécificité élevée que chromatographie d&#39;affinité 1,2 concurrentes stratégies. Ici, une étiquette de purification bispécifique avec deux différents sites de fixation sur un acide aminé 46, le domaine petite protéine a été développée. Le domaine d&#39;albumine contraignant est dérivé de la protéine G streptococcique et a une forte affinité inhérente à l&#39;albumine sérique humaine(HSA). Onze exposées à la surface des acides aminés, ne participent pas à l&#39;albumine contraignant 4, ont été randomisés pour produire génétiquement une bibliothèque combinatoire. La bibliothèque de protéines avec le roman disposées au hasard de surface de liaison (figure 1) ont été exprimées sur les particules de phages pour faciliter la sélection des liants par la technologie d&#39;affichage de phages. Grâce à plusieurs cycles de biopanning contre un dimère Z-domaine dérivé de la protéine staphylococcique A 5, une petite molécule bispécifique avec une affinité pour les deux HSA et la nouvelle cible a été identifié 6. Le domaine nouvelle protéine, appelée ABDz1, a été évaluée comme une étiquette de purification pour une sélection de protéines cibles avec des poids moléculaires différents, la solubilité et le point isoélectrique. Trois protéines cibles ont été exprimés dans Escherichia Escherishia avec le tag roman fusionnée à leur N-terminaux et par la suite purifiés par affinité. La purification initiale soit sur une colonne avec immobilisé HSA ou Z-domaine conduit à relativement des produits purs. Deux étapes de purification par affinité avec le tag bispécifique conduit à une amélioration substantielle de la pureté des protéines. Supports chromatographiques avec le Z-domaine immobilisées, par exemple MabSelect sûr, sont facilement disponibles pour la purification des anticorps et des HSA peuvent être facilement couplés chimiquement à des médias pour fournir la deuxième matrice. Cette méthode est particulièrement avantageux quand il ya une forte demande sur la pureté de la protéine cible récupéré. Le bifonctionnalité de la balise permet à deux différentes étapes de chromatographie pour être utilisés pendant le fardeau métabolique sur l&#39;hôte d&#39;expression est limitée en raison de la faible taille de l&#39;étiquette. Il offre une alternative compétitive à ce qu&#39;on appelle le marquage combinatoire, où plusieurs balises sont utilisées en combinaison 1,7.

Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Un roman et très efficace en deux étapes chromatographie d&#39;affinité protocole a été élaboré et est décrite en détail. La méthode est basée sur une petite étiquette de purification avec deux affinités inhérentes et est applicable à un large éventail de protéines cibles avec des propriétés différentes.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K vues.  Royal Institute of Technology. Un roman et très efficace en deux étapes chromatographie d'affinité protocole a été élaboré et est décrite en détail. La méthode est basée sur une petite étiquette de purification avec deux affinités inhérentes et est applicable à un large éventail de protéines cibles avec des propriétés différentes.

Vidéo: Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

TPS-Sa purification: A deux pas d&#39;affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...