This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1 Connexion <ol><li> Alimenter le bioréacteur. Cliquez n&#39;importe où pour ouvrir la page de connexion. Sélectionnez le nom d&#39;utilisateur et entrez le mot de passe et cliquez sur «Connexion». </li></ol> 2. étalonnage <ol><li> Calibrer capteur de pH (2 points avant autoclavage). </li><li> Inspectez capteur de pH et de confirmer la pointe du capteur est rempli avec une solution d&#39;électrolyte. Préparer deux béchers avec des solutions d&#39;étalonnage de pH (électrolytiques) de pH 4 et pH 7 et disposer d&#39;une bouteille de lavage avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Branchez le câble de pH au capteur de pH. Accédez à l&#39;onglet &quot;Actions&quot; sur l&#39;interface Bonjour et cliquez sur &quot;calibrer&quot;. Entrez la température du tampon dans le domaine de température de la solution d&#39;étalonnage. </li><li> Placez capteur de pH dans le tampon 1 (pH 4) et entrer la valeur dans le champ &quot;zéro&quot;. Attendez que le graphique pour stabiliser et le bouton &quot;calibrer 1&quot;, cliquez sur. Rincez le capteur de pH avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Placer le capteur dans un tampon 2 (pH 7). Entrez tampon2 valeur dans le champ &quot;span&quot;. Attendez graphique pour stabiliser et cliquez sur le bouton calibrer 2. </li><li> Cliquez sur &quot;Enregistrer&quot; puis cliquez sur &quot;Fermer&quot;. </li><li> Calibrer le capteur d&#39;oxygène dissous (DO). </li><li> Assurer la sonde à oxygène a été polarisé en étant connecté au système pendant plusieurs heures. Accédez à l&#39;onglet &quot;Actions&quot; sur l&#39;interface Bonjour et cliquez calibrer. Cliquez sur le bouton &quot;faire un&quot;. </li><li> Débrancher la sonde à oxygène et entrez 0 dans le champ &quot;zéro&quot;. Attendez que le graphique pour stabiliser et le bouton &quot;Calibrer 1&quot;, cliquez sur. </li><li> Rebranchez le capteur DO et entrez 100 dans le domaine «Span». Attendez que le graphique pour stabiliser et le bouton &quot;Calibrer 2&quot;, cliquez sur. </li><li> Cliquez sur &quot;Enregistrer&quot; puis cliquez sur &quot;close&quot;. </li></ol> 3. autoclave et installer des capteurs et des navires de réactifs <ol><li> Après calibration, placer des capteurs et bien thermique dans AUTOCsachets Lave et autoclave pendant 30 min à 121 ° C, 15 psi. </li><li> Désinfectez sachets autoclave avec 70% d&#39;alcool isopropylique (IPA) et de transfert des sachets à enceinte de sécurité biologique (BSC). Retirez l&#39;emballage extérieur du bateau. </li><li> Désinfectez emballage intérieur, avec 70% d&#39;IPA et transférer navire enceinte de sécurité biologique (BSC). Retirez l&#39;emballage intérieur et d&#39;inspecter le navire et les tubes des dommages causés lors de l&#39;expédition. </li><li> Installer le pH et DO capteurs dans les deux ports avant. Installez le bien thermique au port arrière gauche. Ouvrez le bouchon du capteur. </li><li> Guide de la sonde à travers l&#39;orifice de la sonde. Enfilez le capteur fermement dans le port. </li><li> Transfert navire de BSC. </li><li> Accrochez le DO et les câbles de capteur de pH en dehors de la douille de navire et vérifier que rien n&#39;est dans le manchon. Faites glisser le navire dans le manchon, les pieds en premier. </li><li> Installer avec précaution le capteur de température dans le puits thermique de la cuve. Assurez-vous que le fond du récipient est en appui contre les dispositifs de chauffage. </li><li> Supprimerle tube fixe de leurs sacs. Alignement de codage de couleur sur les tubes aux raccords et les pompes correspondantes sur l&#39;unité de contrôle du bioréacteur. </li><li> Installez la conduite de gaz principale en appuyant sur le connecteur dans la prise de gaz. Installez la conduite de gaz micro en tournant le raccord vers la droite dans la sortie de gaz. Installez le tube de filtre d&#39;échappement: </li><li> Ouvrez le four de filtre. Fixer le filtre d&#39;échappement sur le profilé en U de sorte que son tube passe par les deux crochets au filtre et à la sortie du four. </li><li> Installation du tuyau par sac de condenseur dans le porte-tube. Fermer la porte. </li><li> addition des lignes de Route A et B, les deux lignes des médias, et la ligne de récolte derrière la sonde à oxygène et sur le banc à côté de l&#39;unité de commande de bioréacteur. </li><li> Connectez les câbles aux DO et pH capteurs. </li></ol> 4. Ajout moyennes et micro-supports <ol><li> Accédez à l&#39;onglet &quot;actions&quot; et cliquez sur &quot;Control Pompes&quot; sur l&#39;interface de l&#39;ordinateur. </li><li> Former un stérilisateurle raccordement entre une ligne non utilisée moyen d&#39;addition (une bande orange) et la source de la bouteille / du sac par le soudage du milieu ou les tubes en utilisant des raccords Luer. </li><li> Cliquez sur le curseur pour activer la pompe de médias sur. Cliquez sur le curseur pour éteindre la pompe les médias au bout de plus la quantité désirée de milieu. </li><li> Passer billes microsupports en Ca2 +, Mg2 + libre du PBS pendant 3 h à température ambiante. </li><li> Laver Perles plusieurs fois avec Ca2 +, Mg 2 + libre PBS. </li><li> Autoclave pendant 15 minutes à 115 ° C, 15 psi. NOTE: Ajouter 3 g / L (poids sec) dans cette expérience. </li><li> Pompe à micro-supports qui ont été hydratées, lavées et passées à l&#39;autoclave dans le réacteur de la même manière, le milieu est ajouté à l&#39;étape 4.1. </li></ol> 5. équilibrage et à un point DO étalonnage <ol><li> Réglez les contrôleurs à Auto et entrez les consignes désirées. Ici, utiliser agitation du point de consigne (SP) = 15 min, Température SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Attendez que le pramètres s&#39;équilibrer. </li><li> Confirmez capteur est complètement polarisée. Confirmez DO valeur actuelle s&#39;est stabilisée. </li><li> Accédez à l&#39;onglet &quot;Actions&quot; et cliquez sur &quot;calibrer&quot;. Cliquez sur &quot;DO A&quot;, cliquez sur &quot;à un point&quot;. </li><li> Entrez «100» dans le champ «Span». Cliquez sur le bouton &quot;Calibrer 1&quot;, cliquez sur &quot;Enregistrer&quot; et cliquez sur &quot;Fermer&quot;: </li></ol> 6 Démarrage d&#39;un cycle <ol><li> Accédez à l&#39;onglet Actions. Cliquez sur &quot;Batch&quot;. Utilisez le clavier à l&#39;écran ou un clavier externe pour entrer un nom de lot 16 caractères ou moins. </li><li> Cliquez sur &quot;Masquer&quot; bouton du clavier à l&#39;écran. Cliquez sur &quot;Démarrer lot&quot; confirmer en cliquant sur &quot;Démarrer&quot; dans la superposition. </li></ol> 7 Ensemencer avec des cellules <ol><li> Former une connexion stérile entre d&#39;une sortie ligne de plus moyen (1 bande orange) et le sac de source / bouteille de cellule par soudagele tube ou l&#39;aide des raccords Luer. </li><li> Installer la section de silicone de la tubulure dans la pompe de support de sorte que la flèche vers le tube entre la pompe et la cuve. </li><li> Vérifiez les tuyaux pince est ouverte et sa pince de tube ramifié est fermé. Cliquez sur le curseur pour éteindre la pompe de médias sur et cliquez sur «Off» après l&#39;ajout de cellules. </li><li> Accédez à l&#39;onglet &quot;Actions&quot; et cliquez sur &quot;Pompes de contrôle&quot;. </li></ol> 8. échantillonnage <ol><li> Après inoculation et aussi souvent que désiré pour surveiller la culture, prélever un échantillon de la culture de la manière suivante: </li><li> Accédez à l&#39;onglet &quot;actions&quot; et cliquez sur &quot;prendre exemple&quot;. Placez le tuyau d&#39;échantillonnage dans la pompe de prélèvement et de manipuler le robinet de prélèvement selon les instructions à l&#39;écran. </li><li> Effectuer au moins une observation microscopique jour et le nombre de cellules sur ces échantillons. </li><li> Lorsque les cellules ont atteint la densité souhaitée, dans ce case 1,2 x 10 6 cellules / ml, infecter les cellules avec l&#39;addition d&#39;un inoculum de virus. </li><li> Ajouter de manière aseptique de l&#39;inoculum à une seringue de 20 ml, et de relier la seringue à l&#39;un des ports d&#39;addition de rechange sur le réacteur. Introduire l&#39;inoculum dans le réacteur en appuyant sur le piston de la seringue. </li><li> Continuer l&#39;échantillonnage et l&#39;analyse de la culture de la concentration de particules d&#39;adénovirus intracellulaire. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

Auteurs D. Giroux et Y. Hashimura sont des employés de PBS Biotech qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Ce système de bioréacteur à usage unique est relativement simple à utiliser et fournit des analyses en temps réel pour la surveillance et l&#39;analyse réacteur. Il est très bien adapté pour la culture de cellules de mammifères et d&#39;insectes avec des densités cellulaires atteignant plus de 30 millions de cellules / ml. Outre les cellules A549 décrits dans ce rapport 11, nous avons grandi SF-9 cellules d&#39;insectes dans le bioréacteur ainsi. Le mélange doux fourni par la roue d&#39;air pneumatique réduit les dommages cellulaires. Plusieurs étapes sont essentielles lors de la création de ce réacteur. Tout d&#39;abord, le calibrage approprié du pH et les sondes à oxygène sont importantes pour le contrôle optimal de la culture et pour l&#39;addition de réactifs pour ajuster le pH ou l&#39;oxygène dans le système. Deuxièmement, les flacons de réactifs et de semences doivent être remplis et les pièces jointes luer fait dans un environnement stérile comme un BSC. Une fois que les bouteilles de réactif sont déplacés hors de l&#39;environnement stérile, les liaisons avec les lignes d&#39;alimentation de bioréacteur doivent être effectués avec soin pour éviter une contamination microbienne. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bien que ce système de bioréacteur fonctionne bien pour les lignes cellulaires mammifères et d&#39;insectes, il n&#39;est pas conçu pour des cultures bactériennes. Le système ne peut pas fournir le mélange rapide et l&#39;oxygénation qui est nécessaire pour les cellules bactériennes. La croissance bactérienne est mieux assurée dans un bioréacteur à cuve agitée. Par rapport à d&#39;autres bioréacteurs à usage unique pour la culture de cellules de mammifères ou d&#39;insectes, ce système est facile à utiliser, fournit des données suffisantes pour l&#39;analyse des pistes, et a la croissance des cellules similaire ou meilleure que l&#39;autre système à usage unique que nous avons évalué. Le système de bioréacteur pneumatique à usage unique a le potentiel de répondre à un grand nombre de la recherche et les applications cliniques dans les domaines de produits biothérapeutiques, les vaccins, les cellules souches et la médecine personnalisée 4. En outre, la souplesse de ce système permet de batch, fed-batch, la perfusion, et la transfection à base de bioréacteur applications 5. Enfin, à usage unique systèmes de bioréacteurs jetables ont le potentiel pour répondre aux besoins de la production industrielle à grande échelle et à se conformer aux directives et recommandations des organismes de réglementation nationaux et internationaux 6-10.

Lignées de cellules de mammifères peuvent être classés en trois catégories en fonction de leurs caractéristiques de croissance: les cellules qui se développent en suspension, les cellules qui poussent comme des agrégats, et les cellules qui poussent ancré sur un substrat. Bien que le bioréacteur air roues démontré dans cette vidéo est capable de croître tous les trois types de cellules, cette vidéo démontre l&#39;utilisation du bioréacteur à cultiver des cellules dépendantes de l&#39;ancrage sur les micro-supports. Des cellules de mammifère dépendantes d&#39;un support peuvent être cultivées dans le but de produire plusieurs cellules - où les cellules elles-mêmes sont le produit. Par exemple, les cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle osseuse humaine sont actuellement cultivés dans le but de récolter les cellules et de les injecter dans le tissu malade. Le bioréacteur pneumatique montré dans cette vidéo s&#39;est avéré approprié pour la production de ces cellules souches mésenchymateuses de la présente demande (Serra et al., Communication personnelle, 2013). Anchorage deples cellules de mammifères sont généralement de endent cultivées à petite échelle dans des récipients de culture 2D tels que des plaques de culture cellulaire, des flacons de culture cellulaire, ou des bouteilles roulantes, où elles adhèrent à une surface de croissance spécialement traité 1. Lorsque plusieurs cellules sont souhaitées, les plaques ou les flacons peuvent être développées en utilisant des navires de plus ou plus. Cependant, pour plus de culture rentable de grandes quantités de cellules dépendantes de l&#39;ancrage, ce qui augmente la surface pour la fixation des cellules peut être réalisée en utilisant de petites billes solides appelées micro-supports. En fonction des caractéristiques de fixation de la cellule, plusieurs types différents de micro-supports sont disponibles dans le commerce, tels que le dextrane, un peptide, ou revêtues de collagène. Les micro-porteurs ont une grande surface par rapport au volume offrant une plus grande surface pour la croissance des cellules; et les micro-supports peuvent être maintenues en suspension par agitation, ce qui permet aux cellules d&#39;être cultivées à des densités élevées en deux systèmes de bioréacteurs. Actuellement, les types de bioreacteurs où les cellules adhérentes sont cultivées sur des micro-supports comprennent des flacons spinner et des systèmes de réservoir agité, qui utilisent des turbines axiales à maintenir une suspension de enrobées de cellules micro-transporteurs. Plusieurs facteurs sont importants pour le succès de la culture de cellules, y compris la tension en oxygène, la contrainte de cisaillement, la surface de la matrice, et les concentrations d&#39;éléments nutritifs et de métabolites. L&#39;utilisation de bioréacteurs permet la surveillance en temps réel des conditions de croissance et le potentiel de façon significative les coûts de production inférieurs 1. Il existe plusieurs modèles de bioréacteurs commun pour la culture in vitro de cellules, y compris, suspension agitée, tournant navire de mur, à fibres creuses, sac bioréacteur sur une plate-forme de bascule, et les systèmes à lit fluidisé 3. Beaucoup de ces systèmes présentent des problèmes particuliers pour la culture de cellules et de l&#39;échelle -up, tels que le coût élevé, des éléments nutritifs des gradients de concentration, de cisaillement hydrodynamique, l&#39;agrégation de cellules, et la difficulté de l&#39;échantillonnage, la surveillance et le contrôle de cell échelle. Diverses lignées de cellules adhérentes sont utilisés dans la production de virus, que ce soit dans la production de vaccins viraux ou pour la production de vecteurs viraux pour des applications de thérapie génique. Dans cette vidéo, à l&#39;aide de l&#39;utilisation unique pneumatique (air-roue) système de bioréacteur, nous démontrons la culture de cellules de carcinome de poumon humain (A549) de cellules sur micro-supports pour la production d&#39;un adénovirus oncolytique. La conception du bioréacteur pneumatique utilise une roue à agitation verticale qui est alimenté par la flottabilité du gaz injecté dans la partie inférieure du bioréacteur. Cette méthode d&#39;agitation douce limite des forces de cisaillement hydrodynamiques, mais assure toujours moyen optimal et cellule de mélange 4. Par rapport au réacteur à cuve agitée, le réacteur pneumatique a une faible contrainte de cisaillement de paroi, même avec des systèmes de bioréacteurs Air-roue en grand volume (figure 1). Contrairement aux bioréacteurs à cuve agitée, la roue verticale de ce réacteur à usage unique est activé par un courant de bulles de gaz à l&#39;intérieurle récipient, ce qui permet de tendre et uniforme moyen mélangeur (figure 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Sur la figure 3, les paramètres de déclenchement de la course de bioréacteur sont présentés. Cette figure montre l&#39;écran avant de fixer les paramètres de température, l&#39;oxygène dissous, le pH et l&#39;agitation. Une fois que les paramètres sont définis, les paramètres d&#39;exécution sont surveillés en permanence et des ajustements peuvent être faits pour maintenir les conditions requises. Le logiciel produit une lecture continue qui permet d&#39;identifier facilement les problèmes. Dans cette expérience, en utilisant 2,5 L de milieu DMEM contenant 10% de FBS, 250 ppm de SAFC Anti-mousse C, 2 mM de L-glutamine et 3 g / l de micro-porteurs, le système est stabilisé de sorte que le pour cent d&#39;oxygène est de 50%, l&#39; la température est de 37 ° C, et le pH est de 7,2. Le réacteur est inoculé avec des cellules A549 à une concentration de 7 x 10 4 cellules / ml (soit 10 cellules / micro-porteurs). Les paramètres choisis pour cet essai ont permis, dans la majorité des cellules qui adhèrent aux micro-porteurs à l&#39;intérieur de 2 heures (figure 4). Après 12 h, les cellules sont des démonstrant des signes de l&#39;aplatissement et l&#39;étalement sur ​​la surface de micro-support (Figure 5). En 24 heures, les micro-porteurs ont une répartition relativement égale des cellules, sans micro-supports sans cellules et pas de grands amas de cellules sur les micro-supports (Figure 6). Le pourcentage de micro-support colonisation par des cellules A549 est de 75% en 24 h et de 90% par la suite (figure 7). Les cellules ont continué à croître de façon exponentielle à ~ 1 million de cellules / ml après 48 heures (Figure 8). Après infection par une dose d&#39;adénovirus oncolytique (2 x 10 8 virions / ml) à 50 h, la densité a augmenté à 1,2 millions de cellules / ml, puis a commencé à diminuer à mesure que l&#39;infection lytique progressé. Il y avait ~ 10.000 fois amplification de l&#39;inoculum viral. Dans les expériences précédentes, nous avons trouvé que le contrôle et le réglage de l&#39;écoulement de gaz est essentiel pour optimiser la croissance des cellules (données non publiées). Rapidement les cellules en croissance peuvent épuiser le système de l&#39;oxygène avec<html> le niveau de l&#39;oxygène pour tomber à zéro. Alors que les cellules ont continué à croître, il était à un rythme beaucoup plus lent. Il est important de surveiller et d&#39;ajuster le débit d&#39;oxygène pour satisfaire les exigences de la cellule pendant la phase de croissance logarithmique. Chaque course peut être analysée pour une croissance optimale en comparant le pH, DO, et la température avec les comptes quotidiens cellulaires. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Figure 1: la dynamique des fluides du système bioréacteur pneumatique (PBS) par rapport à un réservoir agitateur bioréacteur mesure des forces de cisaillement de mur à différents volumes de réacteur. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Figure 2 pneumatique Air roues réacteur turbine. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figure 3. pneumatique Air Roue logiciel capture d&#39;écran de paramètres pour lancer le cycle de bioréacteur. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> Figure 4 Micro porte-colonisation par des cellules A549 2 heures après l&#39;inoculation. (Diamètre micro-porteur moyen ~ 180 um.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Figure 5 h 12 après le début de la culture, les cellules A549 sont attachants, planer, et la diffusion sur les micro-supports.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Figure 6: Micro-porteuses revêtues de cellules après 24 heures de culture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> Figure 7 Pourcentage de micro-support colonisation par des cellules A549 après l&#39;inoculation. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Figure 8: Le nombre de cellules viables A549 en culture avant et après l&#39;infection avec adenovirnous. Notez que l&#39;étape de l&#39;infection virale a eu lieu à 50 h.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Fonctionnement d&#39;un bioréacteur de laboratoire

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

Encapsulation de cellules de mammifères dans des perles d&#39;alginate à l&#39;aide d&#39;un récipient agité simple

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Collagène recombinant j’ai microporteurs de Peptide pour l’Expansion des cellules et leur utilisation potentielle comme système de diffusion de cellule dans un bioréacteur modèle

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Une orbitale secouant la Culture des cellules de mammifères dans les vaisseaux en forme de O pour produire des agrégats uniformes

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

Construction de plasmides CRISPR et détection de l’efficacité des knockouts dans les cellules mammifères grâce à un système de double luciferase reporter

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...