Nous remercions l&#39;équipe de la production de virus DKFZ et de l&#39;unité de développement, en particulier Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, et Mandy Roscher. Cette étude a été partiellement financé par des subventions du Ministère fédéral de l&#39;éducation et la recherche (BMBF) et l&#39;Association Helmholtz dans le cadre de la Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Programme commun dans la tumeur appliquée virologie.

Notez que d&#39;un laboratoire avec un niveau de biosécurité 2 est nécessaire pour la production de parvovirus recombinants (recPV). Le protocole est subdivisé en deux parties principales. La première partie (production de recPV par transfection) est nécessaire pour produire la quantité minimale de recPVs qui sert d&#39;inoculum dans la deuxième partie du protocole (production de recPVs via l&#39;infection). Une fois une petite quantité de recPVs est produite, la première partie du protocole peut être omis, et le parvovirus recombinant peut être amplifié que par l&#39;intermédiaire d&#39;infection fournissant le gène codant pour les protéines de capside du parvovirus par l&#39;assistant adénovirus (voir ci-dessous). 1. Production de recPVs via Transfection 1,1 transfection d&#39;ADN viral Il est possible d&#39;utiliser n&#39;importe quelle méthode d&#39;ADN établi transfection dans cette section du protocole, soit à base de lipides cationiques ou phosphate de calcium. Nous utilisons généralement Fugene HRéactif de transfection D. Pour contrôler l&#39;efficacité de transfection, nous vous recommandons de transfection plaque supplémentaire avec un plasmide exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (par exemple pEGFP-N1, Clontech). Transfection est considéré efficace et optimal pour la production de virus lorsqu&#39;au moins 50% de la population cellulaire résulte EGFP-positives 24 heures après transfection. <ol><li> 1 jour avant transfection, les cellules de semences, HEK293T 2 millions dans une plaque de 10 cm, pour obtenir 50% de confluence cellulaire à jour de la transfection. Cultiver les cellules dans 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec plus de 10% sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 U par ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Préparer le virus de décision mélange (1:2:1 rapport molaire) dans un tube de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 3 pg de vecteur recPV hébergeant le transgène d&#39;intérêt (ei pHH-1-GFP 6). </li><li> 6 pg de vecteur pCMV / VP 5 abriter l&#39;unité du gène de capside du parvovirus </li><li> 8 o ugf adénovirus dérivé plasmide auxiliaire pXX6 7. </li></ol></li><li> Diluer le mélange des plasmides avec un milieu sans sérum jusqu&#39;à 850 (concentration finale de 20 ng / pl) ul. </li><li> Ajouter 42,5 pi Fugene HD (2.5:1 Fugene ul rapport: pg d&#39;ADN). Ne pas toucher le côté du tube lors de l&#39;ajout au milieu Fugène. </li><li> Vortex doucement pendant 5-10 secondes. </li><li> Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Ajouter les mélanges de transfection goutte à goutte aux cellules. Agiter la plaque doucement afin de répartir le mélange à travers. </li></ol> 1.2 Production Virus <ol><li> Incuber la plaque à 37 ° C avec une humidité de 92% et 5% de CO 2 pendant 72 heures avant la récolte. Pendant cette période, des particules de parvovirus descendance sont formés à partir des plasmides parvovirus. </li></ol> 1,3 récolte de virus <ol><li> Dans une hotte de culture tissulaire, racler les cellules au sein de leur milieu, aspirer et transférer la suspension de la plaque dans un 15en plastique ml tube. </li><li> Centrifuger le tube à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer 95% du surnageant. </li><li> Vortex doucement le tube pour remettre en suspension le culot dans le surnageant restant (environ 0,5 ml). </li><li> Congeler le tube à -80 ° C. Il est possible d&#39;arrêter la production à ce stade ou de continuer avec le protocole. </li><li> Décongeler la suspension et l&#39;amener à la température ambiante. </li><li> Congeler la suspension dans un bain d&#39;azote liquide et de dégel dans l&#39;eau chaude à 37 ° C. Vortex les tubes vigoureusement pendant 15 sec et répéter les cycles de gel-dégel en outre deux fois. </li><li> Centrifuger les tubes à 16.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Le tube à ce stade contient la préparation de virus brut extrait. </li><li> Procéder à l&#39;titrage du virus (voir ci-dessous). Pour la recPV portant le gène de la GFP, une production typique devrait donner 1-3 x 10 7 unités infectieuses virales correspondant à environ 1 -3 x 10 10 génome viral contenant des particules. </li></ol> 1.4 Stockage Virus <ol><li> Pour stockage à long terme geler le tube contenant l&#39;extrait virus brut à -80 ° C. Il est possible d&#39;utiliser des extraits bruts virales comme inoculum dans la deuxième partie du protocole. </li></ol> 2. Production de recPVs par infection Avant de commencer la production recPV par infection, de produire et de purifier l&#39;adénovirus 5 portant le parvovirus VP gène (Ad-VP aide, décrit en 5) selon le protocole standard 8. Il est également nécessaire de disposer d&#39;une quantité minimale de recPVs portant le transgène d&#39;intérêt (par exemple, produit par transfection comme décrit ci-dessus). Ci-dessous, nous décrivons la production recPV dans 175 cm 2 flacon (T175) en format. Une amplification supplémentaire du stock viral produit de cette manière peut être menée dans 10 chambres de culture multicouches CellSTACK (Corning)avec des ajustements mineurs du protocole proposé. 2.1 Infection <ol><li> 1 jour avant que les cellules d&#39;infection de la plaque, les NB324K 10 millions dans un flacon T175 pour obtenir 60-80% de confluence cellulaire à la journée de l&#39;infection. Préparer un second flacon contenant le même nombre de cellules sous forme de commande (cellules non infectées). Chaque T175 devrait avoir 20 ml de milieu essentiel minimum (MEM) en tant que volume final, supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100U par ml Penicillium et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Le lendemain matin, préparer le mélange du virus dans un tube en plastique de 2 ml consistant en: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-helper 5 à la multiplicité d&#39;infection (MOI, unités infectieuses par cellule) = 10 (correspondant à 1 x 10 8 unités infectieuses); </li><li> recPVs à MOI = 0,5 (correspondant à 5 x 10 6 unités infectieuses). Remplissez à 1,5 ml avec du MEM. </li></ol></li><li> Appliquer le mélange dans un virus entier de la fiole T175. </li><li> Incuber laballon pendant 2 heures à 37 ° C, humidité 92%, 5% CO 2 en secouant doucement toutes les 15 min. </li><li> Incuber pendant encore 20 à 24 h à 37 ° C, humidité 92%, 5% de CO 2. </li><li> Remplacez le milieu culturel du milieu frais. </li></ol> 2.2 La production de virus Incuber les flacons à 37 ° C avec une humidité de 92% et 5% de CO 2 pendant 48 heures. Comme indication de la production virale efficace, des signes clairs de cytotoxicité doit être observée dans le flacon contenant virales des cellules infectées, en commençant 36-48 heures post-infection. 2,3 récolte de virus <ol><li> Dans une hotte de culture tissulaire, aspirer et transférer le surnageant du milieu de la fiole dans un tube de 50 ml centrifugeuse. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 1,5 ml de PBS. </li><li> Trypsiniser les cellules avec 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Ajouter la suspension de cellules dans le milieu enlevé. </li><li> Centrifuger les cellules et le surnageant à 5000 xg pendant 5 min à tempérament chambrerature. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon TE (1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) à la cellule et le culot vortexer doucement le tube pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Congeler la suspension cellulaire dans un bain d&#39;azote liquide et de dégel dans l&#39;eau chaude à 37 ° C. Vortex vigoureusement le tube pendant 15 secondes et répéter le cycle de gel-dégel à trois reprises. </li><li> Traiter la suspension cellulaire avec 50 nucléase U / ml Benzonase pendant 30 min à 37 ° C afin de digérer l&#39;ADN génomique de cellules et non-emballés ADN viraux. </li><li> Centrifuger le tube à 5000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Le surnageant à ce stade de la préparation contient le virus extrait brut. Les rendements typiques de recPV-GFP produite à la suite de ce protocole devrait être de l&#39;ordre de 1-10 x 10 8 unités infectieuses virales. </li></ol> 2.4 Entreposage Virus <ol><li> Pour le stockage à court terme (maximum 2 mois), le virus conserver à 4 ° C. </li><li> Pour lonstockage à long terme g (plus de 2 mois), le virus conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Purification RecPV <ol><li> Pour la purification de recPVs des lysats bruts, nous recommandons d&#39;exécuter un gradient discontinu iodixanol selon Zolotoukhine et al. 9. Nous vous recommandons d&#39;utiliser un minimum de 5 ml d&#39;extrait brut virale (obtenu à partir de la production dans cinq flacons T175) pour la purification de virus efficace. </li></ol> 4. Titrage Parvovirus recombinant <ol><li> Effectuer le titrage recPV tel que décrit dans El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Contrôles de qualité <ol><li> Utilisez le protocole décrit dans El-Andaloussi et al. 5 à vérifier la présence de virus de réplication indésirables compétentes (AN) effectuant un essai sur plaque parvovirus dans les cellules indicatrices NB324K. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de recPVs production par l&#39;intermédiaire d&#39;une transfection, en présence ou en l&#39;absence d&#39;éléments génomiques adénovirales est représenté sur la figure 3. Cellules ont été transfectées avec pCMV / VP (plasmide portant le gène codant pour les protéines de capside VP parvovirus) avec pHH-1-GFP (recPV une hébergeant le gène de la GFP) ou pHH-1-luciférase (recPV une hébergeant le gène de la luciférase de luciole) , avec (+ pXX6) ou sans (-pXX6) le pXX6 plasmide (portant l&#39;adénovirus E2A, E4 (orf6) et VA gènes de l&#39;ARN). Volume égal d&#39;extraits cellulaires bruts ont été appliqués à NB324K cellules et transduction GFP ou luciférase essais ont été effectués comme indiqué dans El-Andaloussi et al. 5. Une nette augmentation de la production recPVs a été obtenue en présence de pXX6 avec augmentation de la production de 0,3 unités GFP transductional (TU) ou de cellules obtenues selon des protocoles classiques à environ 5 TU / cellulaire obtenue à la suite de notre méthode (Fig. 3A, B). Une augmentation significative (environ 24 fois) de recPV productisur a également été observé dans le cas de PHH-1-luciférase (Fig. 3C). Ces résultats indiquent que le matériel génétique contenu dans pXX6 est capable de stimuler la production parvovirus. Un exemple représentatif de la production par l&#39;intermédiaire recPVs infection sont présentées dans la figure 4. Cellules ont été NB324K co-infectés par recPVs divers (comme indiqué dans la figure) et Ad-VP-helper (hébergeant le gène codant pour les protéines de capside VP PV). Ad-VP aide de production renforcée recPV jusqu&#39;à&gt; 70 TU par ensemencée cellule (figure 4A) sans augmenter la survenance d&#39;indésirables capables de réplication des particules virales (Fig. 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Figure 1. Vecteurs sur la base de parvovirus autonomes. (A) Haut: Le transgène remplace une partie des gènes VP-codage et est sous le contrôle du promoteur viral P38. Les gènes de NS1 / 2 sont à nouveauentretenus et leur expression est contrôlée par le promoteur viral P4. Le génome du vecteur est flanqué par le parvovirus RTI, qui contiennent des éléments agissant en cis qui sont nécessaires à la réplication et l&#39;emballage du génome recombinant. Bas de: Un plasmide portant le gène de sous-VP soit une hétérologue (par exemple CMV.), Ou autologue (par exemple P38.) Promoteur (Px), est fourni en trans lors de la production recombinante de parvovirus, afin de compenser la perturbation des gènes de structure dans le génome recombinant. ITR, répétition terminale inversée. Figure adaptée de 4. Schéma (B) du protocole classique utilisé pour la production de recPVs. HEK293T cellules sont transfectées transitoirement avec l&#39;ADN viral (vecteur et plasmides auxiliaires) et au bout de trois jours, les cellules sont collectées et les virus récoltés. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Figure 2. La production d&#39;recPVs avec lel&#39;aide de l&#39;Ad-VP. (A) des cartes schématiques des génomes recPV et Ad-VP. Le recPV contient un transgène hétérologue qui remplace une partie de la région VP. Le comité ad-VP abrite le gène parvovirus VP. Vue schématique (B) du protocole décrit dans ce manuscrit. Cellules NB324K sont co-infectés par recPV et Ad-VP virus. Après trois jours cellules sont récoltées et les particules recPV récupéré à partir du lysat cellulaire. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Figure 3. Stimulation de la production par recPV à base d&#39;adénovirus plasmides pXX6. Cellules HEK293T, ensemencées dans des boîtes de 10 cm, ont été transfectées avec pCMV / VP en combinaison avec PHH-1-GFP (A et B) ou pHH-1-luciférase (C) pour produire recPVs. Simultanément, les cellules ont été co-transfectées avec les plasmides auxiliaires adénovirus dérivés pXX6 ou non, comme indiqué. Trois jours après la transfection, les cellules ont été récoltées et lysées par des cycles de gel et de dégel trois. Des volumes égaux de crudextraits de virus e ont été appliqués à NBK cellules indicatrices, et des essais de transduction ont été effectuées. (A) micrographies représentatives montrant cellules GFP-positives dans les monocouches confluentes NB324K. (B) Quantification des essais de transduction de GFP exprimée en unité de transduction (TU) par cellule ensemencée (C). La quantification de l&#39;activité de la luciférase exprimée en unités relatives de la luciférase (RLU). Le dosage de la luciférase a été réalisée comme décrit dans El-Andaloussi et al. 5. Colonnes représentent des valeurs moyennes de trois répétitions avec des barres d&#39;écart-type. Nombre au sommet de la colonne + pXX6, dans (B et C), indique la multiplication dans les titres de virus recPV, obtenu en présence d&#39;pXX6 versus sans. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Figure 4. Stimulation de la production recPV au moyen d&#39;un virus recombinant Ad-helper VP. (A) des cellules NB324K, étaient les infectionsTed avec le virus purifié aide Ad-VP à une MOI de 10 (Ad-X unité / cellule, titré avec Adeno-X Kit Rapid titre), puis surinfectées avec l&#39;un des parvovirus recombinants suivants Chi-hH-1-EGFP 11 (0,1 TU / cellule) ou H-1-GFP (0,5 TU / cellule) 5. Un jour post-infection, le milieu a été changé et deux jours plus tard, les cellules ont été collectées et lysées par trois gel-dégel. Des extraits cellulaires bruts ont été utilisés pour déterminer le titre de virus par un test de transduction selon El-Andaloussi et al. 5. TU, unité de transduction. (B) lots virales produites dans la présence ou l&#39;absence d&#39;Ad-VP ont été analysés pour leur teneur en particules virales compétentes pour la réplication (RCV) par dosage de plaque sur des cellules indicatrices NB324K.

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	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous avons montré que la production recPV peut être renforcée par la présence d&#39;éléments génomiques adénoviraux. Nous avons augmenté les rendements recPV de plus de 10 fois (0,3 à 5 TU / cellule) en fournissant des éléments génomique adénovirus par transfection et de plus de 100 fois co-infectant les cellules avec Ad-VP-helper en combinaison avec le recPV dans Comparaison de protocoles conventionnels. Le protocole décrit ici peut être encore optimisée en déterminant le moment le plus approprié pou...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Le sérum fœtal bovin </td><td> AAP </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nucléase </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X rapide Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Parvovirus des rongeurs (PV) comme chez le rat H-1PV et MVM, sont de petits icosaédrique, simple brin virus à ADN,. Leur génome comprend deux promoteurs P4 et P38 qui régulent l&#39;expression des protéines non structurales (NS1 et NS2) et (capside VP1 et VP2), respectivement 1. Ils attirent un grand intérêt en tant qu&#39;agents anticancéreux pour leurs capacités oncolytiques et oncosuppressive tout en étant non-pathogènes pour l&#39;homme 2. NS1 est l&#39;effecteur majeure du 3 cytotoxicité virale. Afin de renforcer davantage leurs activités naturelles antinéoplasiques, dérivés de ces vecteurs ont été générées par le remplacement du gène codant pour les protéines de la capside d&#39;un transgène thérapeutique (par exemple un polypeptide cytotoxique, cytokine, une chimiokine tumeur du gène, suppresseur etc) 4. Les parvovirus recombinants (recPVs) vecteur conserve les séquences NS1 / 2 de codage et les télomères du génome qui sont nécessaires PV pour l&#39;amplification d&#39;ADN viral et l&#39;emballage. La production derecPVs se produit uniquement dans les cellules productrices (générale HEK293T), par co-transfection des cellules avec un second vecteur (pCMV-VP) exprimant le gène codant pour les protéines VP (fig. 1) 4. Les vecteurs recPV générés de cette manière sont défectif pour la réplication. Bien que recPVs prouvé posséder une intensification des activités oncotoxic à l&#39;égard des virus parentaux à partir de laquelle ils ont été générés, leur production reste un défi majeur et entrave fortement l&#39;utilisation de ces agents dans la lutte contre le cancer des applications cliniques. On a constaté que l&#39;introduction d&#39;un vecteur d&#39;annonce-5 dérivée contenant l&#39;E2a, E4 (orf6) et les gènes d&#39;ARN VA (par exemple plasmide pXX6) dans HEK293T amélioré la production de recPVs de plus de 10 fois par rapport à d&#39;autres protocoles en cours d&#39;utilisation. Partant de ce constat, nous avons construit un roman Ad-VP-helper qui contient les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production recPVs ainsi que la parvovirnous VP gène unité 5. L&#39;utilisation d&#39;Ad-VP-helper, permet la production de recom-PV en utilisant un protocole qui repose entièrement sur ​​les mesures infection virale (par opposition à la transfection de plasmide), ce qui rend possible l&#39;utilisation de lignées cellulaires qui sont difficiles à transfecter (par exemple NB324K) ( Fig. 2). Nous présentons une méthode qui améliore considérablement la quantité de virus recombinant produit, réduisant à la fois le temps de production et les coûts, sans affecter la qualité du produit final 5. En outre, la production à grande échelle de recPV (dans les cellules en suspension et les bioréacteurs) est maintenant envisageable.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l&#39;infection des cellules, ce qui améliore l&#39;efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d&#39;autres protocoles en cours d&#39;utilisation. Ce protocole basé sur l&#39;utilisation d&#39;un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l&#39;unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).

Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l&#39;aide d&#39;adénovirus dérivés Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K vues.  German Cancer Research Center (DKFZ). Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l'infection des cellules, ce qui améliore l'efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Ce protocole basé sur l'utilisation d'un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l'unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).

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Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Estimation des taux de production de virus dans les systèmes aquatiques

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Recherche

Immunologie et infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.