L’utilisation de virus recombinants est une technologie puissante à la fois pour déchiffrer les mécanismes de réplication virale et pour fournir des plates-formes de développement pour les vaccins. De même, la génération de stocks viraux de bonne qualité est cruciale pour chaque étude virale, de la recherche la plus fondamentale aux études appliquées. Le sauvetage des virus recombinants, la récolte optimale, la congélation et la titration des stocks de VRS sont des méthodes essentielles pour toutes les études virologiques.
Ils peuvent être considérés comme traditionnels, mais restent délicats et nécessitent une expertise spécifique. La veille de la transfection, suspendre les cellules BSR-T7/5 en milieu complet à 0,5 million de cellules par concentration millilitre. Répartir deux millilitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque de six puits.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % jusqu’à ce qu’elle atteigne 80 à 90 % de la confluence le lendemain. Pour sauver chaque virus, mélangez d’abord les vecteurs génétiques inversés décongelés dans un tube, puis passez à la transfection, suivant le protocole du fabricant de réavants de transfection. Ajouter ensuite 250 microlitres du milieu de sérum réduit aux vecteurs mixtes.
Dans un autre tube, diluer 10 microlitres de ce réagent transfection dans 250 microlitres du milieu de sérum réduit. Vortexer doucement les deux tubes et attendre cinq minutes. Mélanger le contenu des deux tubes et attendre 20 minutes à température ambiante.
Pendant ce temps, rincer les cellules BSR-T7/5 avec un millilitre du milieu de sérum réduit et distribuer 1,5 millilitre d’antibiotiques moyens essentiels minimum gratuit complété avec 10% sérum de veau fœtal par puits. Si nécessaire, incuber à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5 %. Après l’incubation de 20 minutes, ajouter 500 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5% pendant trois jours. Pour surveiller l’efficacité du sauvetage, observez la fluorescence du GFP au microscope à fluorescence inversée à 20 X grossissement une fois par jour. Le troisième jour de transfection, gratter les cellules dans chaque puits de la plaque transfectée BSR-T7/5 six puits.
Transférer les cellules et le supernatant de chaque puits dans un tube stérile de microcentrifugeuse de deux millilitres. Pour libérer le virus sauvé des membranes cellulaires, vortex chaque tube vigoureusement pendant au moins 30 secondes. Pour la première amplification des virus sauvés, retirez d’abord le milieu de culture de la plaque HEp-2 ensemencée la veille, puis ajoutez rapidement 500 microlitres par puits de la suspension virale fraîche passage zéro.
Placez la plaque HEp-2 à 37 degrés Celsius sur un rocker à scie à scie pour une agitation douce pendant deux heures. Pour produire le premier passage des virus sauvés, jetez 500 microlitres de l’inoculum et ajoutez deux millilitres de MEM avec 2% de FCS. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant trois jours.
Pour surveiller l’infection au microscope à fluorescence inversée à 20 X grossissement, observez la fluorescence GFP des cellules HEp-2 infectées par la suspension de passage zéro une fois par jour. Sous un microscope à champ lumineux, observez l’apparition d’une petite syncytie et d’un décollement cellulaire, ce qui reflète l’effet cytopathique du VRS. Pour amplifier les virus sauvés, diluez d’abord la suspension virale du MEM sans FCS pour obtenir une suspension de trois millilitres à 50 000 PFU par millilitre, puis retirez le milieu du flacon HEp-2.
Ajoutez rapidement la suspension virale de trois millilitres et incubez le flacon à 37 degrés Celsius sur un rocker à scie à scie pour une agitation douce pendant deux heures. Ensuite, retirez et jetez l’inoculum et ajoutez 15 millilitres de MEM avec 2%FCS. Incuber à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant deux à quatre jours.
Pour estimer le bon moment pour récolter les virus, vérifiez la morphologie cellulaire et la fluorescence GFP au microscope à fluorescence inversée à 20X grossissement. Notez que c’est généralement lorsque 50% à 80% de la couche cellulaire HEp-2 est détaché en raison de l’effet cytopathique RSV qui se produit entre 48 et 72 heures après l’infection. Ensuite, grattez toutes les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire.
Recueillir les cellules et le supernatant ensemble et les transférer dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Ajouter 1/10 du volume de la solution de conservation 10X RSV. Vortex les tubes vigoureusement pendant cinq secondes et centrifugeuse pendant cinq minutes à 200 fois g pour clarifier la suspension.
Transférer le supernatant dans un tube de 50 millilitres. Vortex brièvement et aliquot la suspension dans des tubes cryogéniques étiquetés avec des étiquettes résistantes à l’alcool. Plongez le tube dans de l’alcool pré-refroidi, moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.
Pour effectuer un test de titration de plaque, faites d’abord 2X minimum moyen essentiel en diluant commercial 10X MEM avec de l’eau stérile et en ajoutant de la L-glutamine, 1000 unités par pénicilline millilitre, et un milligramme par streptomycine millilitre. Secouez vigoureusement la dilution et rangez-la à quatre degrés Celsius, puis ajoutez 900 microlitres du MEM sans FCS à six tubes. Décongelez les aliquots de virus et vortexez-les vigoureusement pendant cinq secondes.
Pour faire des dilutions en série, ajoutez d’abord 100 microlitres du virus à 900 microlitres du milieu dans le premier tube. Mettre le bouchon sur le tube et mélanger son contenu en tourbillonnant pendant quelques secondes, puis ajouter 100 microlitres de la première dilution à 900 microlitres du milieu dans le deuxième tube. Mettez le bouchon sur le tube et le vortex.
Répétez cette procédure jusqu’au sixième tube. Écrivez le nom du virus et les dilutions complètes sur les plaques HEp-2 12-well. Ajouter une marque pour correspondre à la plaque et son couvercle, car ils peuvent être séparés pendant la coloration.
Retirer le milieu des plaques et distribuer 400 microlitres d’une dilution par puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour l’adsorption du virus. Pendant l’adsorption de virus, préparez la superposition de cellulose de microcrystalline en ajustant d’abord le pH du MEM 2X à environ 7,2 avec une solution stérile de bicarbonate de sodium à 7,5% suivant l’indicateur de couleur.
Pour obtenir 100 millilitres de la superposition, ajouter 10 millilitres de 2X MEM, 10 millilitres de suspension de cellulose monocrystalline de 2,4%, et 80 millilitres du MEM complétés par 2%FCS et mélanger vigoureusement. À la fin de l’incubation de deux heures, ajouter deux à trois millilitres de la superposition à chaque puits des plaques de 12 puits sans enlever l’inoculum. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant six jours.
Pour tacher les cellules avec la solution violette cristalline, secouez d’abord doucement les plaques pour enlever la superposition de cellulose microcrystalline. Retirer les supernatants et laver les cellules deux fois avec 1X PBS, puis ajouter un à deux millilitres de la solution violette cristalline et attendre 10 à 15 minutes. Retirez la solution, qui peut être réutilisée pour la coloration ultérieure des plaques.
Enfin calculer les titres de virus comme une fraction du nombre de plaques visibles dans les puits des plaques sèches et le volume d’inoculum et la dilution. L’exécution d’un essai de plaque sur le contrôle négatif, transfected avec seulement les plasmides d’expression de N, P, L, et M2-1 n’a indiqué aucune plaque à la dilution la plus basse. On s’attendait à ce que les titres obtenus à partir des cellules transfected soient au-dessus de 100 PFU par millilitre si le sauvetage était efficace.
Les titres ont augmenté au fil des passages pour atteindre un million à 10 millions de PFU par millilitre au passage un ou deux. Grâce à ces virus fluorescents, l’inhibition de l’expression du VRS par siRNA ciblant la protéine N et la protéine cellulaire IMPDH peut être facilement observée et mesurée. En revanche, un signal GFP fort sur les cellules témoins transfectées avec le siRNA non ciblé ou les cellules transfectées avec le siRNA contre la protéine cellulaire GAPDH a été observé et mesuré.
De même, ces virus ont permis une observation facile de l’inhibition de la multiplication du VRS par un composé antiviral. Le suivi de la protéine fluorescente M2-1 dans les cellules infectées par le HEp-2 a montré que les IBs et les granules associés à l’IB étaient des structures très dynamiques. Les IB ont été observés comme des structures mobiles et sphériques capables de fusionner et de former de plus grandes inclusions sphériques.
Les granules IB-associés ont subi des cycles continus d’assemblage-démontage avec la formation de petits granules IB-associés qui ont grandi, fusionnés dans de grands granules IB-associés, et ont alors disparu. Le protocole de titration de plaque du RSV utilisant la superposition de cellulose de microcrystalline peut être facilement adapté à d’autres cellules et/ou à d’autres virus. Il faudra ajuster la concentration de la cellulose microcrystalline.
