Notre méthode utilise la sélection de la gamme hôte et des marqueurs fluorescents pour la génération efficace et transparente du virus vaccina recombinant dans une variété de types de cellules. Cette technique combine la vitesse de recombinaison homologue avec la nature sans cicatrice de la sélection dominante transitoire. En outre, nous hébergeons la sélection de gamme pour éliminer la possibilité de changements induits chimiquement.
Cette méthode peut également être utilisée pour modifier le virus de la vaccination ou d’autres varioles pour exprimer des gènes étrangers, par exemple, pour produire des vaccins. Si vous effectuez ce protocole avec la sélection de fluorescence seulement, vous devez vous assurer que vous testez suffisamment de virus pour détecter un recombinant relativement rare sans pression sélective PKR. Cette méthode repose sur le gain et la perte de marqueurs fluorescents pour sélectionner avec succès les virus qui ont acquis les cassettes de recombinaison et pour détecter les virus qui se sont recombinés sans cicatrice.
Pour générer un vecteur de recombinaison, ajoutez d’abord 17 microlitres d’eau libre DNase, 1,2 microlitres de chaque amorce, cinq microlitres de tampon de réaction PCR 5x, de l’ADN modèle et 0,5 microlitres de polymésase d’ADN à un tube PCR par amplicon. Ajouter de l’eau sans DNase supplémentaire pour amener le volume final dans chaque tube à 50 microlitres. Et placez les tubes dans un thermocycleur.
Faire fondre l’ADN à 98 degrés Celsius pendant 30 secondes avant d’utiliser 25 cycles d’un protocole PCR en trois étapes comme indiqué. Pour visualiser les produits d’amplification sur un gel agarose de 1 %, ajoutez 10 microlitres de chaque produit d’ADN et 2 microlitres de tampon de chargement à chaque puits. Faire fonctionner le gel pendant une heure à huit volts par centimètre.
À la fin de la course, utilisez une trousse d’extraction de gel d’ADN selon le protocole du fabricant pour purifier chaque amplicon. Elute les amplicons de la colonne avec 50 microlitres d’eau libre DNase et centrifugation immédiate. Pour linéariser un vecteur de clonage, ajoutez d’abord un microgramme du vecteur, 17 microlitres d’eau libre DNase, 2 microlitres de tampon de réaction et 1 microlitre d’EcoRI à un tube pendant une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, ajouter 0,2 picomoles du vecteur linéarisé 10 microlitres d’eau libre DNase, et 10 microlitres de mélange maître d’assemblage d’ADN à chaque amplicon isolé. Incuber des échantillons à 50 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, transformer E.coli chimiquement compétent avec deux microlitres du produit assemblé selon les protocoles standard.
Plaque 100 microlitres de cellules transformées sur des plaques d’agarose LB complétées par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Après l’incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius, choisissez des colonies bien isolées pour l’inoculation dans le bouillon Luria complétées par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 225 révolutions par minute. Le lendemain matin, utilisez un kit de miniprep plasmide pour isoler les plasmides.
Et vérifiez la concentration et la pureté de l’ADN sur un spectrophotomètre. Pour la génération de virus recombinants, infecter un monocouche confluent de cellules appropriées avec le virus à recombiner à une multiplicité d’infection d’un dans une plaque de six puits. Et incuber les cellules infectées à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure.
À la fin de l’incubation, remplacer le supernatant dans chaque puits par du DMEM frais et utiliser un réaccente transfection disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant. Ajouter trois microgrammes du vecteur de recombinaison d’intérêt à chaque puits. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 48 heures supplémentaires.
Avant de mettre en commun les cellules de chaque condition de transfection en tubes individuels de 1,5 millilitres. Puis congeler-décongeler les cellules en commun trois fois avant de sonner les lysates résultant pendant 15 secondes à une amplitude de 50%. Ensuite, en série 10 fois diluer le lysate sonique, récolté d’un 10 à la première à 10 à la sixième concentration en DMEM frais et ajouter un millilitre de chaque dilution à des puits confluents individuels d’une protéine kinase R ligne cellulaire compétente.
Placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure avant de remplacer les supernatants par un milieu frais et de retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Après 24 à 48 heures, identifier les virus recombinants par microscopie fluorescence. Les plaques des virus recombinants expriment la fluorescence rouge due à l’intégration du gène de fusion mCherry-E3L.
Plaque purifier les virus recombinants trois fois sur les cellules sauvages de type RK13. Après trois cycles de purification de la plaque, infecter les cellules RK13+E3L+K3L avec des dilutions périodiques du lysate de plaque. Identifier les virus effondrés, par microscopie par fluorescence à l’aide d’un système d’imagerie approprié équipé de cubes de filtre GFP et DP.
Ensuite, la plaque purifie le VC-R4 vert seulement, ou les plaques E3L incolores trois fois sur les cellules RK13+E3L+K3L. S’assurer qu’aucune plaque ne fluore le rouge. Infectez les cellules avec au moins 100 unités formant de la plaque pour augmenter vos chances d’identifier une plaque incolore.
Dans de rares cas, plusieurs cycles d’infection peuvent être nécessaires. Les plaques fluorescentes rouges dans la protéine kinase R rk13 cellules compétentes sont indicatives de l’expression virale de mCherry-E3L. Et les plaques incolores ou les plaques exprimant seulement eGFP dans les cellules RK13+E3L+K3L confirment l’effondrement du marqueur de sélection mCherry-E3L.
Le virus recombinant VC-R4, qui n’a pas les deux antagonistes de la protéine kinase R ne peut pas se répliquer dans les cellules protéine kinase R RK13 compétentes tandis que le virus apparent VP872, qui exprime E3L est la réplication compétente. Pour confirmer que cette incapacité à se répliquer dans les cellules RK13 n’était due qu’à la perte d’E3L, gfp amélioré a été remplacé par E3L dans le virus VC-R4. Il a généré un virus pertinent en utilisant le même protocole de sélection.
Fait intéressant, tout en rendant ce virus, des plaques incolores compatibles avec l’effondrement du marqueur de sélection mCherry-E3L ont été identifiées avant la sélection dans les cellules RK13+E3L+K3L qui sont généralement nécessaires pour sélectionner les recombinants sans cicatrices. Probablement en raison de l’identité de séquence étendue entre la cassette de recombinaison mCherry-E3L et le gène E3L inséré dans VC-R4. En moyenne, 12,6% des virions de descendance ont subi une recombinaison avec le plasmide transfecté, semblable aux fréquences précédemment rapportées.
Ici, la fréquence des plaques incolores par rapport aux plaques totales RK13+E3L+K3L cellules est montrée, démontrant que le taux d’effondrement et la perte du marqueur de sélection mCherry-E3L se sont produits à une fréquence d’environ 1,8%. Dans un premier temps, l’utilisation de cellules compétentes PKR garantit que toutes les plaques contenant le virus recombinant. Dans la deuxième étape à l’aide de cellules déficientes PKR permet la détection du virus recombinant avec un locus mCherry-E3L effondrement.
Cette approche nous permet de générer rapidement des virus contenant des gènes exogènes, par exemple, pour la production de vaccins offrent l’expression de différents antagonistes viraux PKR. faciliter l’analyse des interactions spécifiques aux espèces avec PKR à partir de divers hôtes.
