Ce protocole décrit un système génétique inverse fiable et efficace pour fabriquer des rotavirus recombinants. Il explique également comment fabriquer des rotavirus recombinants qui expriment des protéines marqueurs fluorescents. Cette méthode est simple nécessitant un nombre minimal de plasmides et peut générer des rotavirus recombinants qui expriment des protéines fluorées distinctes ainsi que des protéines virales.
Commencez par ensemencer les cellules BHKT7 sur des plaques de 12 puits. Rincer un monocouche fraîchement confluent de cellules avec du PBS. Puis perturber le monocouche avec la solution trypsine-EDTA et resuspendre les cellules en cinq millilitres de GMEM milieu complet.
Déterminer la concentration de cellules BHKT7 viables à l’aide du bleu trypan et d’un compteur cellulaire automatisé. Puis semer deux fois 10 à la cinquième cellule dans un millilitre de GMEM dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant la nuit.
Le lendemain, préparer le mélange de plasmides pour la transfection selon les directives manuscrites. Ajouter ensuite 110 microlitres de sérum réduit préchauffé moyen à chaque mélange de plasmides et pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Ajouter 32 microlitres de réaccente de transfection au mélange.
Faire une brève centrifugation après vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant ce temps, rincer les cellules BHKT7 avec deux millilitres de gmem milieu incomplet. Ajouter un millilitre de milieu incomplet SMEM à chaque puits et remettre la plaque à l’incubateur.
Après l’incubation de 20 minutes, utilisez un pipettor de 200 microlitres pour ajouter le mélange de transfection goutte à goutte à chaque puits. Secouez doucement la plaque et retournez-la à l’incubateur. Deux jours après la transfection, rincer un monocouche fraîchement confluent de cellules MA104 avec PBS.
Perturber le monocouche avec la solution trypsine-EDTA et résuspendre les cellules en cinq millilitres de DMEM milieu complet. Comptez les cellules et ajustez la concentration à huit fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de milieu incomplet de DMEM. Ajouter 0,25 millilitres de cellules MA104 dropwise aux puits avec les cellules BHKT7 transfectées.
Ajustez la concentration de trypsine à 0,5 microgramme par millilitre en ajoutant 0,8 microlitres à une solution milligramme par millilitre de stock de trypsine à chaque puits. Diluer les cellules MA104 restantes à une concentration de 1,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans le milieu complet du DMEM et placer deux millilitres dans chaque puits d’une plaque de six puits. Six jours après la transfection, récupérer le virus recombinant des cellules transfectées.
Soumettez les cellules BHKT7 MA104 à trois cycles de gel/dégel dans des conditions stériles, déplaçant les plaques entre un congélateur négatif de 20 degrés Celsius et la température ambiante. Transférer les lysates dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 500 fois g et quatre degrés Celsius pour pelleter les débris cellulaires.
Recueillir le surnatant et le stocker à quatre degrés Celsius. Ajouter la trypsine à 100 microlitres de lysate cellulaire clarifié à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, préparez une série de dilution sérielle 10 fois allant de 10 à la négative à 10 à la sept négative dans le milieu incomplet DMEM.
Rincer les monomères MA104 deux fois avec deux millilitres de PBS et une fois avec un milieu incomplet DMEM. Ajouter 400 microlitres de dilutions lysate en double aux plaques et les incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en basculant toutes les 10 à 15 minutes pour redistribuer les dilutions à travers le monocouche. Préparez une solution de superposition MEM agarose en combinant des volumes égaux de 2X EMEM préchauffé avec un agarose fondu et refroidi à 1,5 %.
Maintenir cette solution à 42 degrés Celsius dans un bain d’eau et ajuster la concentration de trypsine à 0,5 microgramme par millilitre immédiatement avant de la placer sur les cellules. Aspirer les dilutions lysate de la plaque de six puits. Rincez ensuite les cellules une fois avec deux millilitres de milieu incomplet.
Ajouter délicatement trois millilitres de la solution de superposition MEM agarose sur la monocouche cellulaire dans chaque puits. Laisser durcir l’agarose à température ambiante. Retournez ensuite les assiettes à l’incubateur.
Trois jours plus tard, préparez une solution de superposition MEM agarose telle qu’elle a été décrite précédemment et ajoutez du rouge neutre à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre immédiatement avant l’utilisation. Ajouter deux millilitres de la solution de superposition au-dessus de l’agarose existante dans les plaques de six puits. Laissez l’agarose durcir et remettre la plaque à l’incubateur, en s’assurant de protéger les plaques avec le rouge neutre de la lumière.
Au cours des six prochaines heures, identifiez les plaques de rotavirus à l’aide d’une boîte lumineuse. Utilisez des pipettes de transfert jetables pour choisir des plaques clairement définies, récupérant les bouchons d’agarose qui s’étendent entièrement à la couche cellulaire. Expulser la prise dans un tube de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitres de milieu incomplet DMEM et vortex de l’échantillon pendant 30 secondes.
Amplifiez le virus isolé de plaque élisé dans le milieu par propagation sur ma104 monocouches ou flacon AT25 avec milieu incomplet DMEM et 0,5 microgramme par millilitre de trypsine. Ajouter 600 microlitres de lysates cellulaires infectés clarifiés et 400 microlitres de thiocyanate de guanidinium en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Vortex pendant 30 secondes et les incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Ajouter ensuite 200 microlitres de chloroforme. Vortex la solution pendant 30 secondes et l’incuber pendant trois minutes. Après une microcentrifugation de cinq minutes à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius, transférer 550 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.
Ajouter deux volumes d’alcool isopropylique froid et inverser le tube quatre à six fois. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes. Puis centrifugez-le pendant 10 minutes à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius.
Jeter le surnatant en laissant la pastille d’ARN. Lavez l’ARN en ajoutant un millilitre de 75 % d’éthanol au tube qui l’inverse une fois et en le centrifugant pendant cinq minutes à 7 500 fois g et quatre degrés Celsius. Après avoir soigneusement enlevé l’éthanol, laisser sécher l’ARN pendant cinq à dix minutes.
Puis dissoudre la pastille dans 15 microlitres d’eau sans nucléase. Ajouter deux microlitres de tampon de chargement d’ADN 6X à 10 microlitres de l’échantillon d’ARN dissous. Chargez-le sur un mini gel pré-moulé à 10% polyacrylamide.
Résoudre les ARN par électrophoresis dans le tampon de fonctionnement de tris-glycine pendant deux heures sous un courant constant de 16 milliampères. Une fois le gel terminé, faire tremper le gel de cinq à dix minutes dans de l’eau contenant un microgramme par bromure d’éthidium millilitre et détecter les segments du génome du rotavirus à l’aide d’un transilluminateur UV. Ce protocole génétique inverse a été utilisé pour générer des virus SA11 recombinants qui peuvent être facilement identifiés avec un test de plaque sur les cellules MA104 permettant l’isolement de la plaque.
Les génomes dsRNA du type sauvage rSA11 purifié de plaque et des virus SA11-UnaG ont été extraits avec une solution contenant du phénol et du thiocyanate de guanidinium, résolus par électrophoresis sur un gel de polyacrylamide de 10% et détectés par coloration avec du bromure d’éthidium. Comme prévu, le segment sept ou NSP3 dsRNA de rSA11-UnaG a migré beaucoup plus lentement que celui du type sauvage rSA11 en raison de la présence de séquences 2A-3xFLUnaG. Pour vérifier l’expression de la protéine fluorescente UnaG, les cellules MA104 ont été infectées par le type sauvage et le virus recombinant et examinées à l’aide d’un imageur cellulaire vivant.
L’analyse a montré que rSA11-UnaG produisait de la fluorescence verte alors qu’aucune fluorescence n’était détectée dans les cellules infectées par le type sauvage rSA11. L’analyse d’Immunoblot a été exécutée pour étudier si l’élément 2A de rSA11-NSP3-2A-xflUnaG a favorisé l’expression de deux protéines séparées. L’analyse a montré que NSP3-2A et 3xFL-UnaG ont en effet été exprimés en protéines distinctes indiquant un élément fonctionnel 2A.
Pour le rétablissement réussi du rotavirus recombinant, il est essentiel d’utiliser des cellules BHKT7 de qualité et bien entretenues pour la transfection et les cellules MA104 pour un ensemencement plus élevé ainsi que des quantités précises de plasmides très purs. Bien que ce protocole explique comment utiliser le système génétique inverse pour modifier le gène NSP3 du rotavirus, la même approche peut être utilisée pour modifier d’autres gènes tels que SP1.
