Ici, nous présentons un protocole robuste pour la détection des bactéries dans le tissu de la vessie biopsié, qui a de larges applications à de nombreux types de tissus où les bactéries sont soupçonnées d’être présentes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est impartiale. Il permet au chercheur de détecter les bactéries dans les tissus sans savoir a priori quelles espèces bactériennes sont présentes.
Cette technique peut aider à déterminer si les bactéries ont envahi les parois vésicales des femmes atteintes d’une infection urinaire récurrente et à éclairer les choix thérapeutiques tels que la sélection d’antibiotiques pénétrants dans les tissus. Bien que conçue pour les tissus vésicaux, cette technique peut être largement appliquée à d’autres tissus avec une population bactérienne résidente avec une optimisation minimale. Les personnes qui sont nouvelles à cette technique peuvent avoir du mal avec le placement de coverslip et l’imagerie.
Concentrez-vous sur l’optimisation du placement des coverslip pour réduire les bulles et pratiquer l’imagerie sur des échantillons non précieux. Jashkaran Gadhvi, étudiant diplômé dans mon laboratoire, aidera à démontrer cette procédure. Pour commencer cette procédure, nettoyez un capot à vapeur vide ou une armoire de biosécurité convenablement équipée avec 70 % d’éthanol.
Préparez tous les tampons et reagents nécessaires tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Ensuite, nettoyez cinq pots De Coplin avec 70% d’éthanol et laissez sécher les pots. Lorsque les pots sont secs, étiquetez-les comme indiqué ici et remplissez-les de 100 millilitres de la solution appropriée.
Dans le capot de fumée, placez deux glissières par biopsie dans un support vertical de glissière. Placez le support vertical dans le bocal Xylenes 1 Coplin pendant 10 minutes. Après cela, retirez la grille du bocal et épongez le fond sur une serviette en papier pour enlever l’excès de xylènes.
Placer la grille dans le bocal Xylenes 2 pendant 10 minutes. Et puis réhydrater les sections de tissus dé-paraffinisés dans les lavages successifs à l’éthanol pendant 10 minutes chacun. Lorsque les lavages sont terminés, éponger le fond de la grille sur des serviettes en papier pour enlever l’excès d’éthanol et placer la grille dans le bocal Coplin contenant 100 millilitres de filtre stérilisé, double eau distillée pendant 10 minutes.
Au cours de ce lavage, diluer les sondes à 10 nanomolaires dans le tampon d’hybridation pour créer la solution de coloration, en s’assurant de préparer 150 microlitres de solution de coloration par diapositive. Préparez une chambre humidifiante pour chaque sonde en ajoutant un chiffon de tâche délicat trempé et froissé et de l’eau stérile à un réservoir d’une boîte à pourboire P1000. Placez la cartouche du porte-pointe sur le dessus car c’est là que les glissières seront assises.
Lorsque le lavage final est terminé, retirez la glissière de la grille et placez-la sur une serviette en papier frais, côté tissu vers le haut. Utilisez un chiffon tâche délicate pour sécher la lame, en prenant soin de tamponner doucement près, mais pas sur la section biopsie pour évacuer l’eau. À l’aide d’un stylo hydrophobe, dessinez une bordure autour de la section de biopsie et placez le côté tissu coulissant vers le haut dans la chambre humidifiante.
Ensuite, placez la chambre humidifiante dans un incubateur fixé à 50 degrés Celsius. Pipette entre 50 et 150 microlitres de la solution de coloration directement sur le dessus du tissu de sorte que le rectangle fait par la bordure hydrophobe autour du tissu est rempli et fermer la boîte doucement. Incuber toute la nuit à 50 degrés Celsius dans l’obscurité.
Si l’incubateur a une fenêtre, couvrez-la de papier d’aluminium pour créer un environnement sombre. Le lendemain matin, retirez les glissières des chambres humidifiantes et évacuez rapidement toute solution d’hybridation restante avec un chiffon de tâche délicat. Placez ensuite les côtés dans une grille de coloration verticale.
Placez la grille de coloration dans un bocal Coplin enveloppé de papier d’aluminium contenant 100 millilitres du tampon de lavage préchauffé pendant 10 minutes. Répétez cette étape de lavage deux fois de plus avec tampon de lavage frais dans de nouveaux pots Coplin. Au cours de ces étapes de lavage, préparer la contre-tache en diluant une solution de stock de Hoechst 33342 dans le tampon de lavage, à un rapport de un à 1000.
Dans le même tube, ajouter l’agglutinine germinale de blé Alexa-555 à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et d’Alexa-555 Phalloidin à une concentration finale de 33 nanomolaires. Conserver dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Lorsque le lavage final est terminé, retirez les glissières du bocal Coplin et évacuez doucement tout tampon de lavage excédentaire avec un chiffon de tâche délicat.
Placez les glissières côté tissu vers le haut sur une serviette en papier et ajoutez entre 50 et 150 microlitres de contre-tache directement sur le dessus du tissu de sorte que la bordure hydrophobe soit remplie, mais ne déborde pas. Couvrir jusqu’à quatre toboggans avec un cryobox-top et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après cela, placez les glissières de nouveau dans la grille de coloration et lavez-les deux fois plus dans des pots Coplin contenant tampon de lavage frais, avec chaque lavage d’une durée de 10 minutes.
Ensuite, séchez soigneusement les glissières et placez-les côté tissu vers le haut sur une serviette en papier sous un cryobox-dessus. Presser une goutte de supports de montage directement sur le dessus du tissu et placer délicatement un coverslip de taille appropriée sur le dessus. Appuyez doucement sur les bulles et laissez les glissières de coverslip guérir pendant la nuit dans l’obscurité.
Le lendemain, sceller les bords des couvre-sols jusqu’à la glissade avec une légère couche de vernis à ongles clair et laisser sécher dans l’obscurité pendant 10 minutes, avant de les stocker dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à l’image des biopsies tachées, allumez le microscope confocal et le logiciel associé au microscope. Commencez par une diapositive fish positive et passez au mode visualisation informatique.
Sélectionnez les canaux pour 405, 488 et 555. Réglez le sténopé à l’aide du canal de longueur d’onde le plus long, qui dans ce cas est de 555. Ensuite, trouvez le plan focal actuel pour la visualisation des bactéries étiquetées dans le canal 488.
Sans changer le plan focal, réglez le gain, la puissance laser et le décalage pour chaque canal de sorte que le signal ne soit pas saturé et que l’arrière-plan ne soit pas sur-corrigé. Acquérir l’image dans les trois canaux. Dans cette étude, les bactéries associées aux tissus sont détectées dans les biopsies de la vessie humaine par 16S rRNA FISH.
Ce protocole a été optimisé pour la détection impartiale des bactéries associées à la muqueuse vésicale dans les sections de biopsie de la vessie intégrées à la paraffine. On y voit des micrographes confocaux représentatifs d’une expérience utilisant ce protocole sur des sections de biopsies de la vessie obtenues auprès de femmes atteintes d’infections urinaires récurrentes. Deux sections de série sont hybridées avec l’ARN rRNA universel 16S ou les sondes brouillées.
Les images prises dans la même région du tissu et des bactéries sont proprement visibles dans le tissu hybridé avec les sondes rRNA 16S, mais ne sont pas avec la sonde brouillée. De faux résultats positifs sont également possibles. Dans ce faux positif représentatif, un signal correspondant au collagène ou à l’élastine autofluorescent est détecté dans les canaux 405 et 488 dans les sections hybridées de biopsie de sonde de 16S et de sonde de brouille, soulignant l’importance d’utiliser toujours un contrôle de sonde brouillée.
Pour éviter le blanchiment photo, réduisez au minimum l’exposition des tissus à la lumière après l’application des sondes. Bien que cette technique permette la détection impartiale des bactéries dans les tissus humains, elle ne donne pas d’informations spécifiques aux espèces. Multiplex-FISH avec des sondes spécifiques à la taxonomie pourrait être utilisé pour identifier le genre ou les espèces présentes.
Avant que cette technique ait été développée, il n’avait pas été précédemment démontré que les bactéries pourraient envahir la paroi de réservoir souple des patients récurrents humains d’UTI. Nous utilisons maintenant des sondes spécifiques au genre et aux espèces pour déterminer quelles espèces bactériennes sont présentes. Les xylènes doivent être utilisés dans un capot de fumée en raison de leur toxicité.
Il faut prendre soin de ne pas regarder directement dans le laser pendant l’imagerie. Le laser doit être éteint tout en positionnant votre glissière sous l’objectif.
