Nous sommes redevables à Alice Gaughan et Jiao-Jing Wang dont l&#39;encours de soutien technique, l&#39;apport intellectuel et le soutien moral ont contribué à faire progresser ces études à venir. Ces études ont été soutenues par le AI036532 NIH pour GAH.

1. L&#39;irradiation mortelle <ol><li> Placer un maximum de 10 souris receveuses dans une cage microisolation compatible avec le dispositif d&#39;irradiation à être utilisé. </li><li> Irradier en 2 doses égales de sommation dose totale (dose totale = 9 cGy pour les bénéficiaires BALB.B). Seconde irradiation devrait être de 3 heures après la première. L&#39;injection doit se produire entre 4-6 heures après l&#39;irradiation finale. Souris irradier dans les deux Cs 137 source ou RS2, 000, irradiateur. </li><li> Après la deuxième dose de rayonnement souris en magasin, dans la cage microisolation avec de l&#39;eau acidifiée jusqu&#39;à ce que le moment de la transplantation. </li></ol> 2. Préparation des splénocytes <ol><li> Euthanasier une souris donneuse selon les directives hospitalières. Chaque donateur donne généralement 75x10 6 - 125x10 6 splénocytes. Utilisation CD8 kits de purification, chaque souris donne généralement 6x10 6 - 12x10 6 cellules CD8 T. </li><li> Enlever la rate en faisant d&#39;abord un 2 verticales cm incision de 2 cm à droite de la ligne médiane directementsous la cage thoracique. Couper à travers la fourrure, la peau et la membrane viscérale. </li><li> Enlever la rate et de créer suspension cellulaire unique en plaçant la rate dans 40 ul tamis dans une boîte de Pétri avec du RPMI 1640 avec 5% de FBS. Utilisez un piston de la seringue pour briser la rate rate jusqu&#39;à ce que le tout a été passé à travers tamis. </li><li> Répétez ce processus pour chaque WT et L2G85.B6 des bailleurs de fonds. Ramassez tous les WT suspensions de cellules isolées dans 1-50 ml tube conique, et de collecter toutes les L2G85.B6 suspensions de cellules isolées dans un tube conique séparée 50 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 1200 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Remettre les boulettes en 1640 RPMI avec 5% de FBS et des cellules de comptage. </li></ol> 3. Préparation de moelle osseuse <ol><li> Enlever la peau d&#39;un membre postérieur d&#39;une souris donneuse. </li><li> Retirez soigneusement le tissu musculaire autant que possible du fémur et du tibia / péroné. </li><li> Retirer du membre postérieur du fémur en réduisant l&#39;écart à l&#39;articulation de la hanche. Couper la patte arrière juste au-dessous du tibia / péroné intersection. Toutes les coupes osseuses doivent être faites en utilisant des ciseaux robustes. </li><li> Retirez délicatement le tissu musculaire restante. Coupez-péroné relativement peu de moelle osseuse se trouve dans péroné et ne vaut pas la peine. </li><li> Placez des membres postérieurs dans le froid RPMI 1640 5% FBS processus et répéter avec la seconde branche postérieure. Chaque souris devrait produire entre 20x10 6 - 40x10 6 cellules de moelle osseuse. </li></ol> 4. Suppression de moelle osseuse <ol><li> Retirer une patte arrière à partir du support et les placer dans une boîte de Pétri grande avec une petite quantité de milieux froids (~ 1 ml). </li><li> Coupez l&#39;articulation du genou. En utilisant une seringue (volume&gt; 5 ml), insérer l&#39;aiguille sous-cutanée dans le tibia et appuyer sur la seringue jusqu&#39;à ce que tout le matériel rouge est retiré de l&#39;intérieur du tibia. Répéter l&#39;opération avec le fémur. Jeter os restant dépourvues de moelle osseuse. Répéter l&#39;opération avec les membres postérieurs seconde. </li><li> Créer suspension cellulaire unique par les médias de pipetage contenant moelle osseuse dans une boîte de Pétri grand piston de la seringue utilisation et 40 plmaille de l&#39;écran. Pipette suspension cellulaire unique en tube de 50 ml conique et garder sur la glace. </li></ol> 5. CD3 épuisement Il existe une variété de façons de appauvrissent cellules CD3 + de la moelle osseuse. Notre laboratoire utilise un kit composé par Miltenyi Biotec (CD3-biotine - 130-093-021). Appauvrissent cellules CD3 + de la moelle osseuse selon le protocole du fabricant. Le tampon pour les kits de Miltenyi sera désormais appelé MACS tampon (2 mM EDTA, 0,5% de BSA dans du PBS, pH 7,2). <ol><li> Laver les cellules par centrifugation splénocytes et des cellules de moelle osseuse à 1200 rpm pendant 10 min à 4 ° C et le nombre de cellules. </li><li> Retirez TOUS surnageant. Remettre les cellules de moelle osseuse de 100 pi par 10 millions de cellules de moelle osseuse dans le tampon MACS. </li><li> Continuer avec le CD3 l&#39;épuisement en utilisant le protocole fabrique ». </li><li> Lavez-CD3 cellules déplétées moelle osseuse 3 fois dans du PBS stérile. Comte CD3 épuisé cellules de moelle osseuse et remettre en suspension dans un volume approprié d&#39;injecter 10 7 cellules. </li></ol> Il existe une variété de façons de purifier les lymphocytes T CD8 de souris L2G85.B6. En outre, il existe plusieurs façons de appauvrissent lymphocytes T CD8 à partir de splénocytes WT donateurs. Notre laboratoire utilise des kits de Miltenyi Biotec (CD8 épuisement - 130-049-401, CD8 purification - 130-095-236). <ol><li> Reprendre le culot dans 90 WT tampon MACS pi par 10 7 cellules. Continuer avec la déplétion des cellules T CD8 selon fabrique &quot;protocole (CD8 épuisement - 130-049-401). </li><li> Reprendre le culot dans 40 L2G85.B6 tampon MACS pi par 10 7 cellules. Continuer avec les CD8 purification des lymphocytes T en fonction de fabrique &quot;protocole (CD8 purification - 130-095-236). </li><li> Comptez chaque population de cellules et laver chaque population 3 fois avec du PBS stérile. Resuspendre chaque population en volume suffisant d&#39;injecter 6 WT 18x10 (CD8 appauvri) splénocytes et 2x10 6 L2G85.B6 purifiée des cellules T CD8. </li></ol>7. Préparation injectable <ol><li> Mélanger 10 7 CD3 épuisés cellules de moelle osseuse, 18x10 6 WT (CD8 appauvri) splénocytes, et 2x10 6 L2G85.B6 lymphocytes T CD8 purifiés dans un microtube. Laver avec du PBS stérile et remettre en suspension dans 300 ul. </li><li> Injecter préparation de cellules dans la veine de la queue des souris receveuses. Les injections doivent se faire en utilisant des aiguilles de calibre 28. </li><li> Boutique de souris en cage microisolation avec de l&#39;eau acidifiée. Score souris quotidiennement en utilisant système de notation de notation GVHD développé par Cooke et al 1. </li></ol> 8. Bioluminescent Imaging <ol><li> Six jours après la transplantation, injecter souris receveuses avec 4 mg de D-luciférine. Laisser 5 minutes pour luciférine de réagir avec la luciférase. </li><li> Anesthésier la souris dans la chambre de l&#39;isoflurane imageur bioluminescence et les bénéficiaires d&#39;image pendant 5 min en binning petite. Cela va créer une image haute résolution tout en recueillant autant d&#39;événements que possible. </li><li> Analyser les données à l&#39;aide de séjourLe logiciel Image. L&#39;échelle de l&#39;image pseudo-couleur peut être modifiée pour obtenir les meilleurs résultats. Cependant, il est impératif que la même échelle être utilisé dans les expériences. </li><li> Régions d&#39;intérêt peuvent être créés en utilisant un logiciel image vivante et l&#39;émissivité de lumière peut être quantifiée par le calcul du flux (photons / s) émise par chaque région d&#39;intérêt. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Environ 7-10 jours après la transplantation, les souris commencent à montrer des signes cliniques de GVHD. Les souris semblent délabré en raison du manque de toilettage. Les lauréats seront également commencer à perdre du poids de 7-10 après la greffe jours. Activité et la posture des souris receveuses restera relativement normale jusqu&#39;à environ 12-14 jours après la transplantation. Cumulatifs scores GVHD ne cessera d&#39;augmenter à travers le premier 2-3 semaines après la greffe (figure 1A). Évolution de la maladie est très variable entre les souris, mais les bénéficiaires doivent uniforme succomber à la GVHD de 30-40 days post-transplantation (figure 1B). La figure 2 montre que les souris receveuses ont été imagés 6 post-transplantation jours. Pseudo-couleur variant échelle montre émittance la lumière à travers le corps avec la plus forte intensité de la lumière émise dans la rate et l&#39;intestin. CD8 accumulation de cellules T dans l&#39;intestin est compatible avec les conclusions précédentes 6. Les souris receveuses peuvent être remis en cage microisolation à imager à un moment ultérieur ou euthanasiés pour l&#39;imagerie ex vivo. <table border="1"><tbody><tr><td> Critères </td><td> Grade 0 </td><td> Grade 1 </td><td> Grade 2 </td></tr><tr><td> La perte de poids (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> Posture </td><td> Normal </td><td> Courbant seulement au repos </td><td> Plusieurs se courber; altère movement </td></tr><tr><td> Activité </td><td> Normal </td><td> Légère à modérée diminution de l&#39;activité </td><td> Stationnaire à moins que stimulé </td></tr><tr><td> Texture de la fourrure </td><td> Normal </td><td> Légère à modérée ébouriffant </td><td> Fronçage grave / mauvais toilettage </td></tr><tr><td> Texture de la peau </td><td> Normal </td><td> Mise à l&#39;échelle des pattes arrière / </td><td> Domaines évidents de peau dénudée </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Cooke et al développé ce système de notation en 1996 1. Les souris doivent être notées chaque jour sur chacun des critères sur la gauche. Chaque souris reçoit un score de 0-2 pour chaque critère et le score total est la somme de tous les scores individuels. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> Figure 1. Lethally BALB.B irradiés ont été transplantés avec 10 7 oscellules de la moelle seul ou avec 18x10 6 cellules CD8 T épuisés splénocytes WT et 2x10 6 purifiés L2G85.B6 lymphocytes T CD8. A) les données cliniques notes des bénéficiaires de la moelle osseuse, seul ou avec des lymphocytes T CD8 appauvri splénocytes WT et purifié L2G85.B6 lymphocytes T CD8. B) Les données de survie des bénéficiaires de la moelle osseuse, seul ou avec des lymphocytes T CD8 appauvri splénocytes WT et purifié L2G85.B6 lymphocytes T CD8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> Figure 2. BALB.B souris irradiées de façon létale ont été transplantés avec 10 7 cellules de moelle osseuse, seul ou avec 18x10 6 cellules CD8 T épuisés splénocytes WT et 2x10 6 purifiés L2G85.B6 lymphocytes T CD8. Les récipiendaires ont été injectés avec 4 mg de D-luciférine par injection intrapéritonéale et ont été imagées par IVIS XENOGEN pendant 5 min à petite binning. PsEudes de couleur des images sont indiqués lorsque pourpre représente une faible intensité et le rouge représente les régions à haute intensité d&#39;intérêt ont été établis autour de la souris tout flux total (photons / s) ont été quantifiés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> Figure 3. BALB.B souris irradiées de façon létale ont été transplantés avec 10 7 cellules de moelle osseuse, seul ou avec 18x10 6 cellules CD8 T épuisés splénocytes WT et 2x10 6 purifiés L2G85.B6 lymphocytes T CD8. Les récipiendaires ont été injectés avec 4 mg de D-luciférine par injection intrapéritonéale et ont été imagées par IVIS XENOGEN pendant 5 min à petite binning. Pseudo-couleurs des images sont indiqués lorsque pourpre représente une faible intensité et le rouge représente l&#39;intensité élevée. Les récipiendaires ont été vus sur une journée) 4, B) Jour 6, et C) après le transfert le jour 8.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole pour induire une GVHD chez les souris présentées ici représente un modèle cliniquement pertinente de la GVH murine. Initialement créé par Berger et al., En 1994, les souris C57BL / 6 en combinaison souche BALB.B est MHC-appariés, avec une mortalité GVHD médiée par CD4, CD8 effecteurs dépendants T 2, très similaires au scénario clinique la plus commune 3. Il est connu que la transplantation des cellules T CD8 ne suffit pas à provoquer une GVHD dans ce modèle, mai...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 Crépine cellulaire uM </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-biotine </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Biotine Microbilles </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a Microbilles </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-049-401 </td><td> Utilisée pour appauvrir les lymphocytes T CD8 de la rate. </td></tr><tr><td> Cocktail CD8a purification d&#39;anticorps </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-095-236 </td><td> Utilisé pour purifier l&#39;Les cellules T CD8 de la rate. </td></tr><tr><td> D-luciférine </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

La réaction du greffon contre l&#39;hôte (GVHD) est la barrière limitant l&#39;utilisation à grande échelle de la greffe de moelle osseuse comme traitement curatif pour une variété de déficiences hématologiques. GVHD est causée par les cellules T matures alloréactifs présents dans la greffe de moelle osseuse qui sont infusés dans le récipient et causer des dommages aux organes accueil. Cependant, chez la souris, les cellules T doivent être ajoutés à l&#39;inoculum de moelle osseuse pour provoquer une GVHD. Bien que le travail considérable a été fait pour caractériser T post-transplantation de cellules réponses, la technologie d&#39;imagerie bioluminescente est une méthode non-invasive pour surveiller les habitudes de trafic de cellules T in vivo. Après irradiation létale, les souris receveuses sont transplantés avec des cellules de moelle osseuse et des splénocytes de souris donneuses. Sous-ensembles de cellules T à partir de L2G85.B6 (souris transgéniques qui expriment de manière constitutive luciférase) sont inclus dans la greffe. En seulement certains sous-ensembles de transplantation de cellules T, on est capable de suivre les sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T in vivo,et en fonction de leur emplacement, de formuler des hypothèses concernant le rôle des sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T dans la promotion de GVHD à divers moments. À intervalles prédéterminés après la greffe, les souris receveuses sont imagées par un Xenogen IVIS caméra CCD. L&#39;intensité lumineuse peut être quantifiée à l&#39;aide du logiciel d&#39;image de séjour pour générer une image pseudo-couleur sur la base de l&#39;intensité des photons (rouge = forte intensité, violet = faible intensité). Entre 4-7 après la greffe jours, les souris receveuses commencent à montrer des signes cliniques de GVHD. Cooke et al. 1 développé un système de notation pour quantifier la progression de la maladie basée sur la texture de la fourrure destinataire souris, intégrité de la peau, l&#39;activité, la perte de poids, et la posture. Les souris sont notés tous les jours, et euthanasiés quand ils deviennent moribonds. Les souris receveuses généralement devenue moribonde après la greffe 20-30 jours. Les modèles murins sont des outils précieux pour l&#39;étude de l&#39;immunologie de la GVHD. Sélective transplantation particulier des cellules T sous-ensembles albas pour une identification précise des rôles joue chaque sous-ensemble. De façon non invasive le suivi des réponses des lymphocytes T in vivo ajoute une autre couche de la valeur à des modèles murins GVHD.

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Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murin de transplantation de moelle osseuse est une technique largement utilisée pour étudier les mécanismes immunologiques qui régissent la réaction du greffon contre l&#39;hôte chez l&#39;homme. La capacité de surveiller les tendances du trafic de cellules T<em&gt; In vivo</em&gt; Permet une analyse détaillée de l&#39;évolution et de la perpétuation de la réponse des lymphocytes T au cours de la réaction du greffon contre l&#39;hôte.

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K vues.  The Ohio State University Medical Center. Murin de transplantation de moelle osseuse est une technique largement utilisée pour étudier les mécanismes immunologiques qui régissent la réaction du greffon contre l'hôte chez l'homme. La capacité de surveiller les tendances du trafic de cellules T In vivo Permet une analyse détaillée de l'évolution et de la perpétuation de la réponse des lymphocytes T au cours de la réaction du greffon contre l'hôte.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...