Ce nouveau protocole de greffe de moelle osseuse peut être utilisé pour étudier comment les cellules dendritiques de l’hôte régulent les réponses greffe contre hôte et greffe contre leucémie après la transplantation. Les régénérations cellulaires ex vivo permettent d’adapter ce protocole pour tester le rôle d’autres cellules immunitaires telles que le macrophage et les neutrophiles simplement en modifiant l’état de la culture. Krystal Hossack, directeur de laboratoire, et Sanjeev Gurshaney, premier cycle, feront la démonstration de la procédure avec moi.
Pour la préparation de la moelle osseuse C57BL/6 appauvrie par les cellules T du donneur, récoltez le fémur et le tibia selon les protocoles standard des souris donneurs euthanasiées et transférez les os dans une boîte petri de 92 millimètres de diamètre contenant 1 % de milieu RPMI. À l’aide de ciseaux, retirer les extrémités de chaque os et remplir une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de calibre 26 avec un milieu RPMI frais de 1 %. Insérez l’aiguille dans une extrémité d’un os et pressez le piston pour rincer la moelle osseuse hors de la cavité et dans une passoire cellulaire de collecte.
Lorsque toute la moelle osseuse a été recueillie, filtrer les morceaux de moelle osseuse à travers un filtre à mailles de 75 micromètres et transférer la suspension à cellule unique dans un nouveau tube de 50 millilitres. Sédimenter les cellules par centrifugation et résuspendre la pastille à une concentration de 20 fois 10 à six cellules par millilitre dans PBS complétée par 0,5%BSA. Ensuite, ajoutez 0,05 microgramme d’anticorps THI1 par une fois 10 aux six cellules pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS glacé et resuspendre la pastille à deux fois 10 à la concentration de sept cellules par millilitre en 0,5%BSA complété par 10% jeune complément lapin et 2%DNAse dans l’eau stérile pour une incubation de 45 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 15 millilitres de PBS frais par lavage et réutilisez la pastille en 20 millilitres de PBS contenant 0,5 % de BSA. Mettre en commun les ganglions lymphatiques et la rate dans une passoire pore de 40 micromètres et utiliser un piston à seringues pour macérer les tissus à travers les filtres pour libérer les cellules.
Laver la passoire et le piston avec le milieu RPMI complété par 1%FBS pour recueillir toutes les cellules et sédimenter les cellules par centrifugation. Ajouter cinq millilitres de tampon de lyse ACK à la pastille cellulaire. Après cinq minutes à température ambiante, arrêter la réaction avec cinq millilitres de milieu complété par 1%FBS et pelleter les globules blancs par centrifugation.
Resuspendez la pastille en cinq millilitres de tampon MACS pour compter et diluer les cellules à une concentration de deux fois 10 à huit cellules par millilitre dans le tampon MACS frais. Ajoutez la concentration appropriée d’anticorps anti-érythroïdes, anti granulocytes, anti-B et anti-NK-cellules appauvrissant par une fois 10 aux six cellules pour une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 10 millilitres de tampon MACS froid de glace et résépendez la pastille à une fois 10 à la concentration de huit cellules par millilitre dans le tampon MACS frais.
Ensuite, ajoutez 0,22 microlitres de microbilles anti-biotine par une fois 10 aux six cellules avec mélange pour une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 10 millilitres de tampon MACS glacé et recueillez les cellules T enrichies non liées par séparation magnétique des perles à l’aide du séparateur MACSxpress selon les protocoles standard d’isolation des perles. À la fin de la séparation, sédimenter les cellules T par centrifugation et resuspendre la pastille en cinq millilitres de tampon MACS frais pour le comptage.
Pour générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse, isolez la moelle osseuse des fémurs de type sauvage ou des souris knock-out du facteur B comme démontré et lyse les globules rouges en cinq millilitres de tampon de lyse ACK, arrêtant la réaction avec 10 millilitres de RPMI complétés par 1%FBS après cinq minutes. Après avoir recueilli les cellules sanguines entières par centrifugation, réutilisez la pastille en 10 millilitres de culture moyenne à deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration et ajoutez 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF aux cellules avant d’ensemencer 10 millilitres de cellules sur des plats petri individuels de 100 x 15 millimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant six jours. Le sixième jour, activez les cultures de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse avec 25 microgrammes par millilitre de LPS par plaque.
Au moins 85% des cellules de moelle osseuse cultivés se différencient en cellules dendritiques. La pureté des cellules T après enrichissement de perle magnétique est de 90 %Le modèle C57BL/6 BALB/c dépareillé majeur du MHC correspond étroitement au développement de la GVHD après la transplantation. Le pic de gravité se produit environ 11 jours après le transfert cellulaire suivi d’une réduction des scores cliniques et de la récupération du poids corporel jusqu’au jour 16.
Les destinataires ont uniformément succombé au GVHD par 30 à 40 jours posttransplant. Fait intéressant, la transplantation avec des cellules dendritiques de ko de facteur B améliore la survie du receveur et les scores cliniques de GVHD. Le lymphome à cellules B A20 induit par Luciferase permet de surveiller la croissance tumorale chez les animaux vivants.
Dans cette expérience représentative, tous les destinataires sauvages de type BALB/c qui ont reçu la moelle seule plus A20 sont morts d’une rechute de tumeur. Les receveurs sauvages de type BALB/c transplantés avec des cellules T du donneur appauvries en ACC1 dérivées de la moelle osseuse sont morts de la GVHD. En outre, les animaux qui ont reçu la moelle osseuse du donneur et les cellules T appauvries de l’ACC1 sont morts de la GVHD et de la rechute de tumeur.
Pour générer suffisamment de cellules de moelle osseuse, les os du tibia et du fémur recueillis doivent être complètement exempts de tissu musculaire avant la correction de la moelle osseuse. La purification négative des cellules de moelle osseuse avec biotinylase anti-CD3 et MicroBeads anti-biotine peut également par effectuée pour épuiser le lymphocyte de la moelle osseuse.
