Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’immunologie tumorale, notamment s’il existe une reconstitution des cellules immunitaires spécifiques à la tumeur à partir des tissus périphériques, les transitions entre les cellules immunitaires nouvellement infiltrées et déjà existantes dans le microenvironnement tumoral et leurs réponses à l’immunothérapie. Il s’agit d’une technique pratique et facile à suivre pour distinguer les cellules dérivées de la périphérie des cellules immunitaires infiltrées dans la tumeur et suivre les changements dynamiques, phénotypiques et fonctionnels de ces cellules dans des essais longitudinaux. Commencez par prélever 100 microlitres de la suspension cellulaire B16F10-OVA préparée dans une seringue tuberculine de 1 mL.
Appuyez sur le baril pour déplacer les bulles vers le haut et poussez doucement le piston pour éliminer les bulles d’air. Retenez la souris pour exposer son abdomen. Appuyez sur la patte arrière gauche avec le petit doigt pour resserrer la peau de la région inguinale gauche.
Retirez les poils de la souris de son bas-ventre gauche avec un rasoir électrique. Utilisez du coton imbibé d’éthanol à 75% pour nettoyer le quadrant postérieur de l’abdomen gauche. Tenez la seringue à un angle peu profond compris entre 0 et 15 degrés et, avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, insérez-la sur le côté de la cuisse gauche.
Avancez l’aiguille de 0,5 à 1 centimètre à travers le tissu sous-cutané dans la région inguinale. Tirez sur le piston avant de l’injecter. S’il y a une pression négative, appuyez entièrement sur le piston et observez la formation d’une petite poche de liquide, ou d’un bolus, dans la sous-cutis.
Retirez l’aiguille après l’injection. Relâchez et replacez la souris dans la cage. Le sixième au huitième jour après l’implantation de B16F10-OVA, mesurez la taille de la tumeur avec une échelle de vernier.
Sélectionnez les souris avec un diamètre d’environ trois millimètres ou une tumeur de la taille d’un haricot mungo, et divisez-les également et aléatoirement en deux groupes. Prélever 200 microlitres de suspension de cellules OT-1 dans une seringue à insuline de calibre 29 de 100 unités et enlever les bulles. Placez la souris séparément dans une cage, avec une lampe infrarouge sur la cage pendant 5 à 10 minutes pour dilater la veine caudale.
Immobilisez la souris avec un dispositif de retenue de taille appropriée. Tenez la queue pour la redresser et vaporisez de l’éthanol à 75% pour rendre la veine visible. Tenez la seringue parallèlement à la veine et insérez-la dans la veine à un angle de 0 à 15 degrés.
Retirez légèrement le piston et, si du sang pénètre dans le baril, injectez lentement et régulièrement la suspension à une vitesse maximale d’un millilitre par minute. Une fois l’injection terminée, retirez la seringue et appuyez doucement sur la zone d’injection pendant trois à cinq secondes pour arrêter le saignement. Remettez la souris dans la cage et observez-la de près pendant quelques minutes pour détecter les effets indésirables.
S’il a une mobilité normale et un écoulement nasal, replacez-le en compagnie des autres souris. 8 à 10 jours après le transfert adoptif, sélectionnez des souris donneuses portant une masse tumorale comparable d’environ cinq millimètres de diamètre pour la chirurgie de transplantation. Placez un plat de 100 millimètres sur 20 millilitres dans une armoire de biosécurité et ajoutez 10 millilitres de PBS stérile et glacé.
Après avoir euthanasié la souris, immergez-la dans de l’éthanol à 75 % pendant trois à cinq minutes. Placez la souris en décubitus dorsal sur une planche de dissection recouverte de papier absorbant propre dans l’armoire de biosécurité. Retenez les membres de la souris avec des aiguilles de dissection.
Coupez la peau le long de la ligne médiane du haut de l’orifice urétral jusqu’au xiphoïde avec des ciseaux. Étirez la peau vers le côté gauche du corps de la souris avec une pince à épiler et retenez la peau avec des aiguilles de dissection. Excisez la tumeur, en gardant sa capsule aussi intacte que possible.
Retirez soigneusement et doucement le tissu conjonctif près de la tumeur avec des ciseaux chirurgicaux, puis placez le tissu tumoral dans le plat contenant du PBS stérile et glacé pour une transplantation ultérieure. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour les empêcher de sécher. Rasez le flanc gauche de la souris avec un rasoir électrique, puis appliquez une crème dépilatoire pour enlever les poils restants.
Placez la souris à l’intérieur de l’armoire de biosécurité en position couchée sur une carte de dissection recouverte de papier absorbant propre, avec l’axe vertical de la souris parallèle et sa tête sur le côté droit de l’expérimentateur. Frottez la peau de la zone rasée avec du coton imbibé de povidone-iode. Soulevez la peau au milieu entre les articulations de la hanche de la souris avec une pince à épiler chirurgicale.
Utilisez les ciseaux pour faire une excision verticale de cinq millimètres de long et étendez la coupe rostralement le long de la ligne médiane dorsale à environ 10 à 15 millimètres. Effectuez une dissection nette en insérant les pointes fermées des ciseaux dans l’incision, puis en ouvrant pour séparer le péritoine du flanc gauche de la peau et des tissus mous. Effectuez une dissection nette plusieurs fois pour générer une poche de peau sur le flanc gauche.
Déposez la masse tumorale encapsulée, intacte et dérivée du donneur dans la poche. Fermez l’incision par une suture interrompue, en utilisant deux ou trois points de suture pour chaque incision. Désinfectez la peau autour de la coupe avec du coton imbibé de povidone-iode.
Placez la souris en position latérale dans une cage propre et chaude. Surveillez-le continuellement jusqu’à ce qu’il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la position couchée sternale. Administrer la buprénorphine par voie sous-cutanée à une dose de 0,1 milligramme par kilogramme de poids corporel toutes les huit heures, pour un total de trois doses.
Ne retournez le receveur de la greffe à la compagnie d’autres animaux qu’après qu’il se soit complètement rétabli. En utilisant la cytométrie en flux, deux populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène tumoral CD44 négatif et CD8 positif ont été facilement identifiées dans le microenvironnement tumoral, y compris les lymphocytes T CD45.1 positifs dérivés du donneur et CD45.1 négatifs et CD45.2 positifs infiltrant la tumeur. Au deuxième jour après la transplantation, il y avait environ 83% de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques à l’antigène dérivé du donneur dans la tumeur transplantée, plus prédominants que leurs homologues dérivés du receveur.
La proportion de cellules OT-1 dérivées du receveur était élevée au stade avancé de la tumorigenèse, dépassant les cellules OT-1 inhérentes à la tumeur dérivées du donneur. La chose la plus importante à retenir est d’effectuer une dissection douce lors de la transplantation de tumeur sous-cutanée pour éviter les blessures sur les tissus environnants, en particulier dans les ganglions lymphatiques granulaires.
