La auteurs tiennent à remercier le cerveau humain et de la moelle Centre de ressources fluide (Los Angeles, CA) pour fournir des échantillons de cerveaux normaux. Cette étude a été financée par le National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, la Fondation de la MCJ, Alliance BioSecure, ainsi que le Centre de l&#39;Université sur le vieillissement et la santé, avec le soutien de la Fondation McGregor et Fonds discrétionnaire du Président (Case Western Reserve University) .

1. Préparation d&#39;homogénat de cerveau et de la détergence soluble (S2) et insoluble (P2) Fractions <ol><li> Prenez 100 mg de tissu congelé cerveau humain et ajouter 100 ul de tampon de lyse (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% d&#39;EDTA, pH 7,4). </li><li> Homogénéiser le mélange sur de la glace en utilisant un pilon entraîné par un moteur sans fil, le congeler dans de la glace sèche pendant 5 min et l&#39;homogénéiser à nouveau en utilisant un pilon tirée par la main d&#39;abord, puis par le moteur, et ajouter 300 ul ou 800 ul de tampon de lyse (il s&#39;agit soit du 20 % ou 10% homogénat de cerveau total, respectivement). </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat à 20% ou 10% total du cerveau à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour ramasser le surnageant (S1) à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Ultracentrifugeuse S1 10% à 35.000 tours par minute (100.000 xg) dans un rotor SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) pendant 1 h à 4 ° C. Transférer les surnageants (S2) qui contiennent la fraction soluble dans du détergent dans un tube propre. Remettre en suspension les granulés qui contiennent un détergent insoluble dans l&#39;fraction (P2) dans 100 ul ou 200 ul du tampon de lyse pour faire 10 - ou 5-fois la préparation concentrée. </li><li> Pour PK-digestion, incuber l&#39;échantillon avec les mêmes quantités de PK à 50 pg / ml à 37 ° C pendant 1 heure pour les deux fractions S2 et P2. Ajouter fluorure de phénylméthylsulfonyle à la concentration finale de 5 mM et des volumes égaux de tampon d&#39;échantillon SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, 4% β-mercaptoéthanol, 10% de glycérol, 50 mM de Tris, pH 6,8) pour mettre fin à la digestion PK. Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes et les refroidir à la température ambiante pendant 5 min. Ils sont prêts pour Western blot. </li></ol> 2. La sédimentation de vitesse dans Dégradés Étape saccharose <ol><li> Incuber 450 ul S1 20% avec un volume égal de sarkosyl 2% dans H 2 O pendant 30 min sur la glace. </li><li> Ajouter 0,5 ml de chacune des 60%, 30%, 25%, 20%, 15% et 10% de saccharose dans un tube Beckman avec un maximum de capacité de 5 ml. </li><li> Charger 0,4 ml de S1 sur la partie supérieure de 10-60% gradients de saccharose étape. </li><li> Centrifuger à 48000 rpm (200.000 xg, SW55 rotor) pendant 1 heure, à 4 ° C. </li><li> Collecter 283 ul de chaque fraction de haut du tube et obtenir 12 fractions au total. </li><li> Prenez 20 ul de chaque fraction dans un nouveau tube Eppendorf, ajouter 20 ul de tampon d&#39;échantillon, et faire bouillir pendant 10 minutes. </li><li> Échantillons frais pendant 4 min dans le capot, centrifuger à 1000 xg pendant 1 min et les vortex. Charger les échantillons sur un gel préfabriqué. </li></ol> 3. Chromatographie d&#39;exclusion stérique <ol><li> Utilisez Superdex 200 billes RH (Pharmacia, Uppsala, Suède) dans une colonne de 1 x 30 cm pour déterminer l&#39;état oligomérique de molécules de PrP. </li><li> Sept marqueurs de masse moléculaire (Sigma, St. Louis, MI), y compris dextran bleu (2.000 kDa), la thyroglobuline (669 kDa), apoferritine (443 kDa), β-amylase (200 kDa), l&#39;alcool déshydrogénase (150 kDa), albumine ( 66 kDa) et de l&#39;anhydrase carbonique (29 kDa) sont chargés indépendamment aux concentrations recommandées par Sigma dans 200 volumes d&#39;échantillons ul. </li><li> Le volume d&#39;élution de bleu dextran est utilisé pour déterminer le volume de vide (V 0 = 8,45 ml) et le volume total (V t = 24 ml) est fourni par l&#39;instruction de produit. Les volumes d&#39;élution de crête (V e) sont calculés à partir du chromatogramme et retenues fractionnaires. K av, le coefficient de partage (définissant le comportement de l&#39;échantillon), est calculé en utilisant l&#39;équation: K av = (V e - V 0) / (V t - V 0). La courbe d&#39;étalonnage est déterminée par tracé de l&#39;av K des protéines étalons contre le log de ​​la MW normes 8. </li><li> La masse moléculaire (MW) de différentes espèces de PrP récupérés dans différentes fractions FPLC est évaluée selon une courbe d&#39;étalonnage générée avec la filtration sur gel de différentes normes. </li><li> Injecter 200 S1 ul dans un tampon de lyse contenant sarkosyl 1% dans la colonne pour chaque essai. </li><li> Chromatographie est effectuée dans un système FPLC (GE Healthcare) à un débit de 0,25 ml / min et les fractionss de 0,25 ml chacune sont recueillies au moyen d&#39;un collecteur de fractions (Amersham Biosciences, RediFrac). </li><li> Incuber 0,125 ml de chaque fraction de 0,5 ml prérefroidi méthanol à -20 ° C pendant 2 heures. </li><li> Centrifuger les échantillons à 13.000 xg pendant 30 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 ul de tampon d&#39;échantillon SDS comme mentionné ci-dessus, faire bouillir pendant 10 minutes, laisser refroidir à température ambiante, les charger sur un gel préfabriqué. </li></ol> 4. Capture de PrP par G5p <ol><li> La molécule G5p (100 ug) (aimablement fourni par les Drs. Geoff et John Kneale McGeehan de l&#39;Université de Portsmouth, Royaume-Uni) est conjugué à 7 x 10 8 tosyle activé billes magnétiques par incubation de 100 G5p ug et 350 perles G5p ul dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C pendant 20 h. Attirer G5p-billes sur la paroi latérale des tubes Eppendorf par une force magnétique externe, puis enlever toute solution. Laver les billes avec 1 ml de PBS contenant0,1% de sérum albumine bovine (BSA) pour trois fois. </li><li> Incuber les perles G5p conjugués dans 1 ml de 0,2 M de Tris-HCl, pH 7,4, contenant 0,1% de BSA à 37 ° C pendant 5 heures à bloquer la liaison non spécifique, puis laver les billes avec 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA pendant trois fois comme indiqué ci-dessus. Eliminer la solution et ajouter 1 ml de PBS dans les billes. Les perles G5p préparés sont stables pendant au moins 3 mois à 4 ° C. </li><li> La capture de la PrP par G5p est réalisé en incubant 100 pl fractions S1 ​​ou P2 avec 60 ul de billes conjuguées G5p (10 pg de protéine / 6 X 10 7 perles) dans 1 ml de tampon de liaison (3% de Tween-20, NP-3% 40 en PBS, pH 7,5). </li><li> Après incubation avec rotation constante pendant 3 heures à température ambiante, les billes contenant la PrP G5p sont attirés par la paroi latérale des tubes Eppendorf par une force magnétique externe, ce qui permet de retirer facilement les molécules non liées dans la solution. </li><li> Après trois lavages dans du tampon de lavage (2% de Tween-20 et 2% de NP-40 dans du PBS, pH 7.5), Perles G5p sont collectées et chauffé à 95 ° C pendant 5 min dans le tampon d&#39;échantillon SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, glycérol 10%, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8). </li><li> Après refroidissement des échantillons pendant 5 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés à 1000 xg pendant 5 min à température ambiante. Les surnageants sont prêts pour Western blot. </li></ol> 5. Western Blot <ol><li> Charger les échantillons bouillis dans du tampon d&#39;échantillon SDS sur 15% de Tris-HCl Critère préfabriqués gels (Bio-Rad) à 150 V pour ~ 80 min. </li><li> Les protéines sur les gels sont transférés au PVDF pendant 2 heures à 70V. </li><li> Après le blocage des membranes dans le lait 5% dans du Tris-solution saline tamponnée contenant 0,01% de Tween-20 (TBS-T), les membranes sont incubées pendant 2 h à température ambiante avec 3F4 primaires d&#39;anticorps monoclonaux ou polyclonaux (1:40,000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N 8 (1:6,000), ou anti-C 8 (1:6,000) pour sonder la molécule de PrP. </li><li> Après incubation avec HRP-conjugué anticorps de mouton anti-IgG de souris à1:3000, ou d&#39;âne anti-IgG de lapin à 1:3,000 les bandes de PrP sont visualisées sur un film Kodak utilisant ECL Plus, en conformité avec le protocole du fabricant. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Par rapport à la MCJ sporadiques échantillons, une petite quantité de IPRP C a été détectée dans la fraction P2 dans les cerveaux normaux, bien que la plupart des PrP C a été récupérée dans la fraction S2 (figure 1). Comme indiqué précédemment 8, IPRP comptes pour environ 5-25% de la PrP totale, y compris sur toute la longueur et des espèces N-terminale tronquée. Les analyses par sédimentation sur gradient de saccharose étape a révélé que, bien que la plupart des PrP C de non-MCJ cerveaux ont été récupérés dans les fractions de tête 1-3, de petites quantités de PrP ont également été détectée dans les fractions inférieures 9-11 qui contiennent normalement de grands agrégats 8 (Figure 2). Une grande variété d&#39;espèces PrP Sc a sonnétion de monomères, oligomères petits aux plus grands agrégats ont été isolés par filtration sur gel dans le cerveau avec la maladie de Creutzfeldt-Jakob (figure 3A). Cependant, une petite quantité d&#39;agrégats plus gros avec un poids moléculaire supérieur à 2000 kDa a également été détectée dans les fractions insolubles de cerveaux normaux (figure 3C). En outre, des dimères et des tétramères de PrP C n&#39;ont pas été détectés seulement dans les fractions insolubles, mais aussi dans les fractions solubles (figure 3B et 3C). Après le traitement PK et PNGase, la PrP capturé par G5p a été détecté avec l&#39;anticorps 1E4 contre PrP97-105 8. Trois fragments de base PK-résistants appelé PrP * 20, * 19 PrP, et la PrP * 7 ont été détectés, la migration à ~ 20 kDa, ~ 19 kDa et environ 7 kDa, respectivement (figure 4, panneau de gauche). Cependant, aucune PrP a été détectée lors de l&#39;anticorps 1E4 a été pré-incubées avec un peptide synthétique qui a une séquence identtique à l&#39;épitope 1E4 (figure 4, panneau du milieu), ce qui indique que les bandes détectées par 1E4 sont des fragments de PrP. En outre, l&#39;anticorps anti-C a révélé deux fragments différents PrP migration à ~ 18 kDa (PrP * 18) et ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), en plus de la PrP * 20 (figure 4, panneau de droite). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> Figure 1. Détection des IPRP C et Sc IPRP. Après traitement par la PNGase F au 1/10 du volume réactionnel total à 37 ° C pendant 1 heure pour éliminer les glycanes de la protéine pleine longueur ou N-terminale tronquée espèces PrP dans les fractions soluble et insoluble (S2 et P2) isolé par ultracentrifugation dans des échantillons de cerveau de contrôle normal (CTL) et la MCJ sporadique (MCJ) ont été détectés avec 3F4 contre PrP106-112 (panneau de gauche), anti-N contre PrP23-40 (panneau du milieu), et anti-PrP C contre220-231 (panneau de droite). Dans des échantillons de CTL, une petite quantité de PrP est détectée dans P2, tandis qu&#39;une quantité importante est présente dans S2. En revanche, plus la PrP est détecté dans P2 par rapport à S2 dans des échantillons MCJs. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> Figure 2. Sédimentation de la PrP dans des gradients de saccharose étape. PrP dans les différentes fractions de 1 à 11 de non-MCJ échantillon S1 cerveau a été détectée par Western blot avec 3F4. Bien que la plupart de la PrP C a été détectée dans les fractions top 1-3, de petites quantités de PrP ont également été observées dans les fractions inférieures 9-11. En outre, le motif de bandes de PrP du haut et du bas est différente: la PrP récupérés dans les fractions de tête présente une bande dominante supérieure alors que la PrP récupérés dans les fractions bas présente une bande dominante inférieure. Un PK-traitée PrP Sc a été chargé comme un contrôle sur le côté droit de la tache. <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Détection des oligomères solubles et insolubles C PrP. Soluble et insoluble de PrP C cerveaux humains normaux ont été séparées par ultracentrifugation, puis soumis à une filtration sur gel, respectivement. Les tailles moléculaires des fractions individuelles ont été mesurées par l&#39;exécution d&#39;un groupe de marqueurs de masse moléculaire. (A) PrP Sc espèces à partir d&#39;échantillons de cerveau MCJs. Deux populations d&#39;espèces de PrP ont été détectés: fractions de filtration sur gel de 49 à 65 contiennent des monomères et des oligomères petits, tandis que les fractions 27-33 contiennent des agrégats de grande taille. Les espèces de PrP C de la fraction soluble (S2) (B) et une fraction insoluble (P2) (C) de témoins normaux ont été détectés. PrP a été sondé avec l&#39;anticorps 3F4. Dimères (fraction 55) et tétramères (fraction 51) de la PrP ont été détectés non seulement en P2, mais aussi dans S2 de sampl normal du cerveaues (B et C). Grands agrégats n&#39;ont été détectés que dans des échantillons normaux P2 (C). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> Figure 4. Détection des différents fragments IPRP PK-résistants dans G5p préparations enrichies de cerveaux humains normaux. Échantillons enrichis par G5p ont été traités avec PK et PNGase F avant de Western blot sondage avec 1E4 (panneau de gauche), 1E4 pré-incubées avec un peptide synthétique qui a une séquence identique à l&#39;épitope 1E4 (panneau du milieu), et anti-C ( panneau de droite). 1E4 détecté trois PK-résistants fragments PrP appelée PrP * 20, * 19 PrP, et la PrP * 7 (panneau de gauche). Après le blocage du 1E4 avec le peptide, aucune PrP res ont été détectés (panneau central), ce qui indique que les bandes détectées avec 1E4 sont des fragments de PrP. Anti-C a révélé deux fragments ajout PrP PK-résistants appelé PrP * 18 et PrP-CTF12 /13, en plus de la PrP * 20.

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	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La combinaison des approches présentées ici isole toujours insolubles PrP C et agrégats solubles PrP C oligomères du cerveau humain normal. Ultracentrifugation à 100.000 xg pendant une heure est une méthode classique qui a été largement utilisé pour la séparation de l&#39;insoluble PrP Sc de la PrP C soluble 14. Bien qu&#39;il soit efficace, l&#39;une des mises en garde est d&#39;éviter la contamination lors du tirage du surnageant (S2) après centrifugat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Fluorure de phénylméthylsulfonyle </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM de 2-propanol </td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml dans du H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifugeuse LE-80K, SW55 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Référence 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 billes RH </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC système </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Marqueurs de poids moléculaire </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Varié </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 billes magnétiques </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps 1E4 </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Prêt gel 15% Tris-HCl préfabriqués gels </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

L&#39;événement central dans la pathogenèse des maladies à prions implique une conversion de l&#39;codée par l&#39;hôte cellulaire protéine prion PrP C dans son isoforme pathogène PrPSc 1. PrP C est soluble dans un détergent et sensible à la protéinase K (PK)-digestion, alors que la PrP Sc forme détergent insolubles dans les granulats et est partiellement résistante à la PK 2-6. La conversion de la PrP C et PrP Sc est connu d&#39;associer une transition conformationnelle de α-hélicoïdale de β-feuille structures de la protéine. Cependant, la voie en vivo est encore mal comprise. Une tentative endogène PrP Sc, intermédiaire PrP * ou «prion silencieuse», n&#39;a pas encore été identifié dans le cerveau infecté 7. En utilisant une combinaison d&#39;approches biophysiques et biochimiques, nous avons identifié insolubles PrP C (agrégats désigné IPRP C) à partir de cerveau des mammifères non infectés et mis en culture neuronale8, 9 cellules. Ici, nous décrivons les procédures détaillées de ces méthodes, y compris ultracentrifugation dans un tampon de détergent, de la sédimentation sur gradient de saccharose étape, chromatographie d&#39;exclusion stérique, l&#39;enrichissement IPRP par la protéine du gène 5 (G5p) qui se lient spécifiquement à des formes de PrP structurellement modifiés 10 et PK-traitement. La combinaison de ces approches isole non seulement insoluble PrP Sc et agrégats de PrP C, mais aussi solubles PrP C oligomères du cerveau humain normal. Étant donné que les protocoles décrits ici ont été utilisés pour isoler les deux PrP Sc de cerveaux infectés et le RPIB C à partir de cerveaux sains, ils nous donnent l&#39;occasion de comparer les différences dans les caractéristiques physico-chimiques, neurotoxicité, et l&#39;infectivité entre les deux isoformes. Une telle étude permettra d&#39;améliorer grandement notre compréhension des agents pathogènes infectieux protéiniques. La physiologie et la physiopathologie des IPRP C ne sont pas claires à l&#39;heure actuelle. Notamment, dans un nouveau-identified maladies humaines à prion appelée variable sensible à une protéase prionopathy, nous avons trouvé une nouvelle PrP Sc qui partage le comportement immunologique et la fragmentation des IPRP C 11, 12. En outre, nous avons récemment démontré que IPRP C est la principale espèce qui interagit avec la protéine amyloïde β-dans la maladie d&#39;Alzheimer 13. Dans la même étude, ces méthodes ont été utilisées pour isoler des agrégats et des oligomères Abeta dans la maladie d&#39;Alzheimer 13, ce qui suggère leur application aux agrégats de protéines prion non impliqués dans d&#39;autres maladies neurodégénératives.

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Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Une nouvelle espèce de protéine prion cellulaire (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) A été récemment identifié dans les cerveaux humains non infectés en utilisant les méthodes décrites ici. Ces méthodes peuvent être utilisées pour isoler des espèces différentes PrP, alors que certains d&#39;entre eux sont également utile pour isoler des agrégats de protéines mal repliées autres à partir de cerveaux humains.

Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K vues.  Case Western Reserve University School of Medicine. Une nouvelle espèce de protéine prion cellulaire (PrP C) A été récemment identifié dans les cerveaux humains non infectés en utilisant les méthodes décrites ici. Ces méthodes peuvent être utilisées pour isoler des espèces différentes PrP, alors que certains d'entre eux sont également utile pour isoler des agrégats de protéines mal repliées autres à partir de cerveaux humains.

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Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

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Médecine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

L&#39;utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lésion Explorer: Un Protocole de vidéo-guidée standardisé pour Volumetrics IRM dérivées exactes et fiables dans la maladie d&#39;Alzheimer et normale personnes âgées

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-réseau d&#39;électrodes enregistrements des droits de l&#39;épilepsie post-opératoire corticale tissus

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Utilisation de Saccadometry avec la stimulation cérébrale profonde pour l&#39;étude normale et pathologique fonction cérébrale

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Mechanical and Controlled PRP Injections in Patients Affected by Androgenetic Alopecia

23 patients (18 male and 5 female) aged 21-70 years who displayed male pattern hair loss (MPHL) in Stage 1 to Stage 5 as determined by the Norwood-Hamilton classification scale, and female pattern hair loss (FPHL) in Stage 1 to Stage 2 as determined by the Ludwig classification scale, were treated with non-activated autologous platelet-rich plasma (A-PRP). Autologous blood (55 mL) was harvested using sodium citrate as an anticoagulant. A-PRP (23 mL) was produced for all cases using a closed system according to the transfusion service protocol. Following centrifugation (260 x g for 10 min) the A-PRP was inserted in a laser light selector device, and after the centrifugation, 9 mL of A-PRP was collected.
The scalp of the patients affected by androgenetic alopecia (AGA) was divided into four areas (frontal, parietal, vertex, and occipital); local anesthesia was not performed. Interfollicular A-PRP injections (0.2 mL x cm2) were performed by controlled and mechanical injections scheduled at a depth of 5 mm using a medical injector gun. Treatment sessions were performed with a 30-day interval. For each patient, three treatment sessions were performed.
PRP was injected in the androgen-related areas of scalp affected by hair loss. Placebo (normal saline solution) was loaded in another syringe (10 mL) and injected on the adjacent side in a similar fashion.

This paper aims to describe the interfollicular autologous platelet-rich plasma injections (0.20 mL x cm2) in the scalp of 23 patients affected by androgenetic alopecia at a depth of 5 mm using a medical injector gun equipped with a 30 gauge needle, in three sessions.