Ce protocole peut aider les scientifiques qui s’intéressent à l’étude de la fonction moléculaire des astrocytes humains dans leur niche native. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’isolement et l’enrichissement d’un type cellulaire spécifique, les astrocytes adultes à partir d’échantillons de tissus cérébraux humains en vrac en utilisant le tri des noyaux activés par fluorescence. Cette méthodologie peut être appliquée à l’isolement d’autres types de cellules du néocortex humain, tels que les neurones et les cellules progénitrices d’oligodendrocytes à l’aide d’autres anticorps conjugués fluorescents appropriés.
Commencez à disséquer environ 200 à 400 milligrammes de tissu à partir d’un échantillon de tissu de cortex adulte humain fraîchement congelé. Placez le tissu dans un douncer en verre de sept millilitres contenant quatre millilitres de tampon de lyse glacée sur de la glace et broyez le tissu environ 50 fois. Transférer l’homogénat dans un tube en polypropylène ultracentrifuge de 12 millilitres.
Utilisez une pipette de cinq millilitres pour ajouter 6,5 millilitres de tampon de saccharose glacé au fond du tube ultracentrifuge sans perturber l’interface entre le saccharose et l’homogénat tissulaire. Pour recueillir les noyaux, ultracentrifugez le lysat pendant une heure à 101, 814 fois G et aspirez soigneusement le surnageant et les débris sans perturber la pastille. Ajouter 0,1 % de BSA dans le PBS au tube d’ultracentrifugation pour une incubation de 10 minutes sur la glace avant de remettre en suspension la pastille de noyau.
Ensuite, utilisez le bleu de trypan pour visualiser les noyaux intacts au microscope optique et pour vous assurer que la concentration est supérieure à 10 à cinq noyaux par millilitre Pour le tri activé par fluorescence des noyaux isolés, ajoutez environ 20 microlitres de l’échantillon remis en suspension à une solution d’anticorps contenant l’anticorps anti-NeuN conjugué Alexa fluor 555. Ajouter environ 20 microlitres de l’échantillon remis en suspension à une solution d’anticorps contenant un anticorps anti-PAX6 conjugué à l’APC de souris. Après une incubation d’une heure à quatre degrés Celsius avec agitation, à l’abri de la lumière, ajoutez du DAPI à un rapport de 1:1000 à tous les échantillons et témoins.
Pour inclure des noyaux de la taille appropriée et exclure les globules rouges et les débris, utilisez un tube de contrôle pour bloquer les cellules par leurs zones de dispersion avant et latérales. Pour sélectionner la population de noyaux singulets, porte par zone de diffusion vers l’avant par rapport à la largeur ou à la hauteur de la diffusion vers l’avant et la zone de dispersion latérale par rapport à la largeur ou à la hauteur de la dispersion latérale. Gate by DAPI pour n’inclure que les singulets de noyaux intacts et pour exclure tous les débris et doublets.
Après avoir vérifié en fonction de tout contrôle de fluorescence supplémentaire, exécutez l’échantillon de contrôle DAPI uniquement. Exécutez le contrôle NeuN Alexa fluor 555 uniquement pour déterminer la coupure pour la coloration NeuN-positive dans le canal Alexa fluor 555. Exécutez le contrôle APC PAX6 uniquement pour déterminer la coupure de la coloration PAX6 positive dans le canal APC.
Une fois que tous les contrôles ont été exécutés, les cellules NeuN-positives collectent les neurones et les cellules PAX6-positives avec la population NeuN-négative pour collecter les astrocytes. Gate et collectez toutes les populations gliales supplémentaires d’intérêt de la population PAX6 négative NeuN-négative. Pour le séquençage en vrac de l’ARN mononuclé, après avoir recueilli 50 000 à 500 000 noyaux dans du PBS supplémenté en BSA à 0,04 %, ajouter deux millilitres de solution de saccharose, 50 microlitres de chlorure de calcium à une molaire et 30 microlitres d’acétate de magnésium à une molaire à l’échantillon.
Porter le volume final de la suspension à 10 millilitres avec PBS. Mélanger le contenu du tube par inversion et incuber la réaction sur de la glace pendant 15 minutes. Abattez les noyaux par centrifugation et remettez-les en suspension dans un millilitre de réactif d’extraction d’ARN.
Ensuite, vortex le tube, congeler l’échantillon sur de la glace sèche et stocker les noyaux à moins 80 degrés Celsius. Pour le séquençage de la chromatine en vrac à un seul noyau transposase acceptable, recueillir 50 000 à 75 000 noyaux dans du PBS supplémenté à 0,04 % de BSA dans un tube de microcentrifugeuse recouvert de 5 % de BSA et congeler les noyaux jusqu’à leur analyse en aval. Les populations de noyaux progéniteurs neuronaux, astrocytaires et oligodendrocytes peuvent être triées à partir d’un échantillon de néocortex temporal humain post-mortem fraîchement congelé, comme démontré.
Les études de séquençage de l’ARN mononuclé ont également donné la priorité au PAX6 en tant que facteur de transcription nucléaire exprimé différentiellement dans les sous-populations d’astrocytes adultes protoplasmiques et fibreux. Après le tri, des altérations du transcriptome spécifique au type cellulaire dans le néocortex de l’épilepsie pathologique primaire peuvent être caractérisées. Dans cette analyse, les analyses transcriptomiques ont confirmé que les populations de NeuN négatifs PAX6 positifs étaient solidement enrichies pour les marqueurs panastrocytaires et appauvries pour les marqueurs neuronaux.
La coloration par immunofluorescence peut être utilisée pour confirmer la colocalisation de PAX6 avec la protéine acide fibrillaire gliale dans les astrocytes corticaux humains. Des intervalles post-mortem plus courts sont associés à une plus grande récupération des noyaux intacts à partir d’échantillons de tissus frais. Un rendement élevé de noyaux intacts peut être récupéré à partir de tissus congelés jusqu’à 24 heures après l’autopsie, mais à 30 heures, très peu de noyaux intacts peuvent être récupérés.
La chose la plus importante à retenir est d’obtenir la population PAX6-positive de la population NeuN-négative, car il y a des neurones qui expriment également PAX6, et nous voulons les exclure. Cette technique a également permis d’étudier les astrocytes dans des échantillons de cerveau chirurgicaux d’épilepsie, élucidant davantage le dérèglement moléculaire des astrocytes humains dans le contexte d’une niche pathologique spécifique.
