Le soutien financier pour ce travail a été fournie par la National Science Foundation, le National Institute of Health (NIH), la technologie des matériaux Center (MTC) et l&#39;ORDA à SIUC. Nous remercions la NSF pour une subvention (CHE-0959568) pour l&#39;achat d&#39;un FE-SEM. Nous tenons à remercier le professeur Matthew McCarroll pour des discussions utiles. Julia Reyes tiens à remercier COLCIENCIAS, Agence colombienne et l&#39;Universidad Pedagogica y Tecnológica de la Colombie pour son érudition et de soutien financier.

A. Synthèse et caractérisation de liposomes PDA 4,5,6 Note 1: Protéger la solution PDA de la lumière à l&#39;aide d&#39;emballage papier d&#39;aluminium sur chaque conteneur à travers toutes les étapes expérimentales. Note 2: Deux ensembles différents de solution de liposomes (B et C) ont été préparés suivant la procédure A (Synthèse et caractérisation de liposomes PDA). 1. Synthèse de N-hydroxysuccinimide Diacteylene (NHS PCDA) <ol><li> Pour préparer des liposomes, un ingrédient essentiel PCDA-NHS est nécessaire. Nous avons synthétisé PCDA-NHS en utilisant la procédure suivante: </li><li> Ajouter l&#39;acide 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), de N-hydroxysuccinimide (0.0914 g, 0,786 mmol) et de 1 - (3 - (diméthylamino) propyl)-3-éthylcarbodiimide (0,144 g, 0,713 mmol ) dans un endroit sec CH 2 Cl 2 (20 ml). </li><li> Agiter la solution à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Retirez délicatement le solvant à l&#39;aide de révaporateur otarie pour obtenir un film sec mince. </li><li> Utilisez ampoule à décanter pour en extraire le résidu avec de l&#39;éther diéthylique (25 ml) et d&#39;eau (25 ml) trois fois. </li><li> Sécher la couche organique sur MgSO 4 (1,0 g) pendant une demi-heure. Filtrer et éliminer le solvant par évaporation rotative pour obtenir une poudre solide blanc (0,24 g,&gt; 90%). </li><li> Analyser composé final sous la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). </li><li> RMN 1 H (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0.893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Préparation de liposomes 5,6,7 <ol><li> Dissoudre PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) :: 8: 1: 1 dans 20 ml de dichlorométhane. </li><li> Filtrer la solution avec un papier filtre pour éliminer les agrégats. </li><li> Évaporer complètement le solvant pour obtenir un film mince de monomères. </li><li> Sécher la couche mince pendant la nuit sous vacuum. </li><li> Hydrater le film avec de l&#39;eau déminéralisée (50 ml) pour obtenir une solution de liposome de concentration souhaitée (de 0,65 à 1 mM). </li><li> Sonication de la suspension résultante avec un sonicateur à sonde 76 ° C pendant ~ 18 min. </li><li> Soigneusement passer la solution à travers un filtre en papier pour enlever les agrégats lipidiques </li><li> Refroidir la solution à 4 ° C pendant la nuit afin de promouvoir l&#39;auto-assemblage des monomères. La solution finale doit être optiquement clair. </li><li> Polymériser les monomères de diacétylène auto-assemblées (liposomes) par irradiation avec de 254 nm du rayonnement UV pour ~ 2 min à l&#39;aide d&#39;une source UV Pen Ray (4,5 mW / cm 2) dans l&#39;air. </li><li> La solution de liposome est stable à température ambiante pendant au moins deux semaines. La solution était plus stable au réfrigérateur. </li></ol> B. Préparation de la rhodamine taggés albumine sérique bovine (BSA-Rh) du PCDA liposomes modifiés 1. Liaison de BSA-Rh à la surface des liposomes <ol><li> Dissoudre BSA dans du PBS-Rh buffer (concentration ionique est 0,01 M, pH 7,2) pour obtenir une concentration finale de 1,2 uM de BSA-Rhodamine solution. </li><li> Ajouter 2 ml (1,2 M) de BSA-Rhodamine à 10 ml de solution de liposomes préparée à l&#39;étape A.2. (Voir ci-dessus) à la température ambiante. </li><li> Réaction classique pour la fixation de groupes d&#39;amines à partir du résidu lysine des protéines à l&#39;acide carboxylique activé par NHS groupe a été suivie (schéma réactionnel de la figure 2). NHS-PCDA a été conçu (figure 2, étape 1) pour covalente des molécules de liaison aux protéines avec des liposomes en utilisant NHS-amine réactions (figure 2, étape 2). NHS est un excellent agent qui entraîne en laissant la réaction de l&#39;acide aminé-carboxylique dans la direction vers l&#39;avant. Le rendement de cette réaction dans les conditions appropriées doivent être quantitatives. </li><li> Suppression des BSA libre-Rh: Imbiber un Spectra / Por Biotech Ester de cellulose (CE) membrane (MW C O: 100.000) en désionisée water pendant 15 min. Cette membrane est utilisée pour la dialyse de BSA-Rhodamine n&#39;ayant pas réagi (poids moléculaire ~ 66000 Da) dans de l&#39;eau désionisée. </li><li> Transférer délicatement la solution dans la membrane de dialyse. </li><li> Changez l&#39;eau à 2 h, 8 h, 14 h, 24 h et 36 h pendant la dialyse. </li><li> Recueillir la solution finale dans un flacon recouvert d&#39;une feuille d&#39;aluminium. </li></ol> C. Préparation de SR-diamine et la biotine marquée liposomes 1. Au lieu d&#39;utiliser DMPC à l&#39;étape 2.1, nous allons utiliser la biotine marqué-(1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(biotinyle) (biotine-DOPE). <ol><li> Suivez toutes les étapes par 2,2 à 2,9. </li><li> Au lieu de BSA-Rh dans l&#39;étape B, utilisez Diamine Sulphorhodamine marqué (SR-diamine). </li><li> Suivez toutes les étapes ultérieures de B. </li><li> Des liposomes dans cette préparation contient de la biotine et SR-diamine sur leurs surfaces. Les étapes suivantes sont similaires à A et B (voir ci-dessus) à une exception près: la streptavidine a été ajouté à la solutià enquêter sur les interactions biotine-streptavidine par des changements dans le FRET efficacité. </li></ol> D. Représentant Résultats <img alt="Titre Figure" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Figure titre. Une bande dessinée expliquant la réaction et FRET processus se produisant à la surface du liposome (préparé en suivant l&#39;étape B). A. Surveillance de l&#39;attachement des protéines à des liposomes en utilisant une FRET Suivi de FRET entre la rhodamine et des liposomes PDA préparées à l&#39;étape B. Spectres d&#39;excitation et d&#39;émission de BSA-Rh et spectre d&#39;absorption de PDA sont prises (figure 3A). Nous pouvons clairement voir que le spectre d&#39;émission de BSA-Rh chevauche le spectre d&#39;absorption de PDA. Ce satisfait à l&#39;exigence de résonance pour le mécanisme de FRET. BSA-rhodamine liposomes marqués avant et après polymérisation ont été analysées avec UV-Vet est la spectroscopie de fluorescence. Pour le donneur et l&#39;accepteur d&#39;isolement, le FRET efficacité dépend fortement donneur-accepteur distance (r) et J 1 (j-value). La trempe à l&#39;émission est observé (figure 3B) du fait de FRET entre la rhodamine et PDA due à l&#39;apparition du spectre d&#39;absorption électronique de PDA bleue après photopolymérisation. Dans notre cas, l&#39;efficacité de FRET est égal à zéro pour les liposomes non polymérisées et Rhodamine parce que J = 0 pour les liposomes polymérisés dans la région visible. Nous avons effectué des expériences similaires avec seulement liposomes PDA qui ne contiennent pas de NHS sur leur surface. Dans ces cas, BSA-Rh n&#39;a pas été marqué à la surface des liposomes. Dans ce cas, la distance moyenne entre la rhodamine et PDA (r moyenne) était beaucoup plus grande que le rayon Forster (R 0 = 2,8 nm). Ainsi, nous n&#39;avons pas observé une diminution importante de l&#39;intensité de fluorescence. Cette observation also suggère que l&#39;extinction de la fluorescence est dominante lorsque R &lt;2,8 nm. J et R 0 valeurs ont été calculées à l&#39;aide des formules suivantes: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) dλ λ 4 R 0 = 0,211 [k 2 n -4 J Q D (λ)] 1/6 Le coefficient d&#39;extinction (ε) de bleu-PDA est dans la gamme de 2000-10000 ~ M -1 cm -1, avant l&#39;addition de la streptavidine. Le coefficient d&#39;extinction du bleu-PDA dépend de l&#39;état photo-polymérisation. [2] Par exemple, les valeurs e sera plus importante pour une solution qui a été polymérisé un temps plus long. En outre, l&#39;auto-assemblage des monomères de diacétylène peut également affecter les valeurs de e. Le calcul Jtions tenir compte de ces changements, et ils reflètent les changements dans les coefficients d&#39;extinction PDA en raison de la biotine-streptavidine interactions moléculaires. valeurs de J sont calculées en utilisant l&#39;absorption PDA expérimentale et RS-101 données sur les émissions. Les changements dans les valeurs de J sont dus à passer dans le spectre d&#39;absorption électronique de PDA suite à l&#39;ajout de la streptavidine à la solution (figure 4C). L&#39;unité de valeurs de J est M -1 cm -1 nm 4. B. Suivi de FRET avec addition de streptavidine à la biotine marqué avec solution de liposomes Note 1: Suivi de FRET entre la rhodamine et des liposomes préparés PDA à l&#39;étape C ci-dessus. Spectres d&#39;excitation et d&#39;émission de Sulphorhodamine-étiqueté diamine (SR-diamine) et spectre d&#39;absorption de PDA sont prises (figure 4A). Liposomes non polymérisées et polymérisé biotine marqués ont été analysées à l&#39;aide UV-Viset la spectroscopie de fluorescence. L&#39;émission de la rhodamine (SR-101) est diminuée d&#39;environ 45% après polymérisation (figure 4B), suggérant une trempe d&#39;émission en raison de FRET. Ajouter 40 aliquotes (1 uM) de solution de streptavidine à 2 ml de solution de liposomes. Avec l&#39;addition de streptavidine à la solution, les variations de valeur de J est observé (figure 4C). Que la biotine se lie à la streptavidine, l&#39;intensité du pic de bleu PDA liposome (centré à ~ 645 nm sur la figure 1) est diminuée tandis que l&#39;augmentation du pic d&#39;absorption à 540 nm est observée (F igure 1S). Figure 4D montre les changements du FRET efficacité. L&#39;efficacité de FRET diminué avec l&#39;augmentation de la concentration de streptavidine est également compatible avec notre prédiction. Enregistrer l&#39;émission SR après chaque aliquote outre, 40 ul de streptavidine. Nous avons observé une augmentation constante de l&#39;émission de rhodamine après l&#39;ajout de streptavidine (Figure 5). Cette augmentation de l&#39;émission de rhodamine est dû à une diminution de la valeur de J pour le spectre d&#39;émission et de sulforhodamine spectre d&#39;absorbance après PDA biotine-streptavidine interactions. Au niveau moléculaire, les interactions biotine-streptavidine conduire à de subtils changements dans la longueur de conjugaison efficace de l&#39;ANP qui se traduit par une diminution de la forme bleu-PDA à un plus stable thermodynamiquement rouge-PDA forme 2. C&#39;est la base de l&#39;évolution des valeurs de J. Fait intéressant, les différences subtiles dans les interactions moléculaires pour la biotine liée de façon covalente ou non covalente à des liposomes PDA peuvent être sondés à l&#39;aide de notre test de détection 4. Nous avons également réalisé des expériences de contrôle et de surveillance ont l&#39;émission des échantillons de contrôle dans les mêmes conditions expérimentales que celles pour la streptavidine-biotine système. Les expériences de contrôle se composent de: (1) des solutions de liposomes qui contiennent la biotine sur leursurface a été ajoutée une solution tampon de même volume et de concentration, et (2) sans solution de liposomes récepteurs de biotine à leur surface ont été ajoutés streptavidine de même volume et de concentration. L&#39;intensité de la solution de biotine-liposome marqué après l&#39;addition de streptavidine a montré l&#39;intensité accrue, mais l&#39;intensité de la solution de liposomes des expériences de contrôle (par exemple, s&#39;il vous plaît voir Figure 2S), d&#39;autre part, a montré une diminution de l&#39;intensité des émissions. Ceci est attribué à la dilution de la solution. Ces expériences indiquent clairement que l&#39;émission accrue de la solution est due à des interactions spécifiques moléculaires. Forster rayon (R 0) de la paire rhodamine et PDA est calculée (équation 2) pour ~ 2,80 nm. Cela signifie que, pour isolés PDA-rhodamine paires, 50% des molécules excitées rhodamine état ​​auront leur énergie transféré au PDA lorsque r est égal à 2,80 nm. Nous obs<html> erved que lorsque la biotine est liée de manière covalente au squelette de PDA, l&#39;augmentation des émissions est 2-3 fois supérieure à celle des non-covalente biotine lié à des liposomes. 4 Ces résultats suggèrent fortement que notre système proposé est sensible à distinguer les différences subtiles dans les interactions au niveau du transducteur (liaison entre la biotine et bicouche du liposome) en raison de façon covalente et non covalente récepteurs liés attachés à des liposomes. Selon les capacités d&#39;acquisition de numérisation et de données du spectrophotomètre, suivi en temps réel (en milliseconde deuxième échelle de temps) des interactions protéiques (dans la spectroscopie UV-Vis) sont possibles avec ce système de détection. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Les spectres d&#39;absorption Figure 1. D&#39;bleues et rouges solutions pour PDA. (Encadré) micrographies optiques prises avec un appareil photo numérique. g &quot;/&gt; Figure 2. Schéma réactionnel pour la synthèse PCDA-NHS (étape 1). Réaction du PCDA-NHS au substituant amine des protéines (étape 2). L&#39;étape 2 est la base de la liaison du résidu lysine des protéines à l&#39;acide carboxylique monomère du PCDA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> La figure 3A. Changement dans l&#39;efficacité de FRET observée est due aux changements dans le spectre d&#39;absorption du PDA. Avant de polymérisation n&#39;y a pas de chevauchement entre les BSA-Rh émission et d&#39;absorption PDA mais après polymérisation chevauchements d&#39;absorption PDA avec BSA-Rh émission qui est l&#39;exigence de FRET. Rhodamine est un donateur (rouge) et des liposomes polymérisés PDA agir comme accepteur (bleu). <img alt="Figure 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Figure3B. Spectres de fluorescence de BSA-Rh liposomes marqués avant (bleu) et après polymérisation PCDA (rouge). Une forte diminution de l&#39;émission de la rhodamine a été observée en raison de FRET entre la rhodamine et PDA. <img alt="Figure 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> .. Figure 4A chevauchement spectral (J) de changement de spectre d&#39;absorption PDA (bleu ou rouge) et spectre d&#39;émission Sulphorhodamine (orange) Figure 4A est le spectre représentatif de conditions extrêmes, c&#39;est-à-dire lorsque un excès de streptavidine a été ajouté à la solution. La figure 4A montre une quasi-bleu-rouge à la suite de la transformation PDA addition d&#39;un excès de streptavidine. On voit clairement que J (chevauchement spectral) augmente avec le bleu-décalage du spectre d&#39;absorption PDA <img alt="La figure 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> La figure 4B. Spectres de fluorescence avant (bleu) et après (red) polymérisation liposome. <img alt="La figure 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Etat de la figure 4C pour FRET: J. Changement entre le donneur (sulforhodamine) et accepteur (PDA) avec l&#39;addition de streptavidine à la solution de liposomes. <img alt="Figure 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> La figure 4D. FRET changement d&#39;efficacité entre le donneur (sulforhodamine) et accepteur (PDA) avec l&#39;addition de streptavidine à la solution de liposomes. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Figure 5. Rhodamine spectre d&#39;émission après l&#39;addition de streptavidine aliquotes de la solution de liposome PDA. Encart montre une vue agrandie de l&#39;évolution des émissions dans les spectres SR-101.

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons effectué la liaison sélective des résidus lysine de la protéine à la surface des liposomes en utilisant NHS-amine réaction. Cette méthode basée sur FRET est capable de faire le suivi en temps réel de la biotine-streptavidine et de protéines (BSA) se liant à la surface du liposome. Procédure similaire peut être appliquée à l&#39;étude de la dynamique de liaison des interactions entre protéines différentes avec leurs récepteurs sélectifs. Il est souplesse dans le choix des fluorophores qui f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic acide (PCDA) </td><td> Produits chimiques GFS </td><td> 3261 </td><td> Sensible à la lumière </td></tr><tr><td> N-hydroxysuccinimide (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Sensible à l&#39;humidité </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (diméthylamino) propyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) </td><td> Chem-Impex International </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) </td><td> Lipides Avanti Polar </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine-étiqueté Ser bovineeuh albumine (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(biotinyl) (biotine-DOPE) </td><td> Lipides Avanti Polar </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET est un processus par lequel l&#39;énergie est non-radiative transféré d&#39;une molécule donneur excité à une molécule accepteur de l&#39;état fondamental par le biais longue portée interactions dipôle-dipôle 1. Dans le présent essai de détection, nous utilisons une propriété intéressante de PDA: bleu-décalage du spectre d&#39;absorption UV-Vis électronique de PDA (figure 1) après un analyte interagit avec les récepteurs attachés aux PDA 2,3,4,7. Ce changement dans le spectre d&#39;absorption PDA prévoit des changements dans le recouvrement spectral (J) entre PDA (accepteur) et la rhodamine (bailleurs de fonds) qui conduit à des changements dans l&#39;efficacité de FRET. Ainsi, les interactions entre l&#39;analyte (ligand) et les récepteurs sont détectés par FRET entre fluorophores donneurs et les PDA. En particulier, nous montrons la détection d&#39;une molécule de streptavidine protéine modèle. Nous démontrons également la liaison covalente d&#39;albumine sérique bovine (BSA) à la surface du liposome avec mécanisme de FRET. Ces interactions entre til liposomes bicouches et des molécules protéiques peuvent être détectés en temps réel. La méthode proposée est une méthode générale de détection chimique petites et grandes molécules biochimiques. Depuis la fluorescence est intrinsèquement plus sensibles que la colorimétrie, la limite de détection du test peut être en Afrique sub-nanomolaire plage ou moins 8. En outre, un PDA peut agir comme un accepteur de FRET universel, ce qui signifie que plusieurs capteurs peuvent être mis au point avec un PDA (accepteur) fonctionnalisé avec donneurs et des récepteurs différents attachés à la surface des liposomes PDA.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

On démontre FRET entre le polymère conjugué polydiacétylène (PDA) et un fluorophore attaché à la surface des liposomes PDA pour la détection de biomolécules. Liposomes PDA contient également des molécules réceptrices sur leurs surfaces de biomolécules à être utilisées en tant que sondes. Interactions ligand-récepteur entraîner des changements dans l&#39;efficacité de FRET entre le fluorophore et PDA qui est la base du mécanisme de détection.

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K vues.  Southern Illinois University. On démontre FRET entre le polymère conjugué polydiacétylène (PDA) et un fluorophore attaché à la surface des liposomes PDA pour la détection de biomolécules. Liposomes PDA contient également des molécules réceptrices sur leurs surfaces de biomolécules à être utilisées en tant que sondes. Interactions ligand-récepteur entraîner des changements dans l'efficacité de FRET entre le fluorophore et PDA qui est la base du mécanisme de détection.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Recherche

Biologie

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Surveillance en temps réel de l’activation de l’aurora kinase A à l’aide de biocapteurs FRET conformationnels dans des cellules vivantes

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...