Ce projet a été financé en partie par des fonds fédéraux du National Cancer Institute, National Institutes of Health, sous le numéro de projet ZIA BC 010329.

REMARQUE : Ce test est effectué dans des cellules de 293FT. Une lignée épithéliale bien caractérisée et facilement transfectable dérivée de cellules rénales embryonnaires humaines. Une seule boîte de culture confluente de 10 cm de ces cellules fournit généralement suffisamment de cellules pour ensemencer 20 puits de plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les étapes 1 à 3 doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique.
1. Ensemencement cellulaire (jour 1)
REMARQUE : Dans cette étape, les cellules sont détachées de la ou des boîtes de culture tissulaire, comptées et ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 6 puits pour la transfection à l’étape 2 (Figure 2).
<ol><li>Aspirez le milieu des cellules dans la parabole de 10 cm. Laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et aspirer.</li>
	<li>Ajouter 1 ml d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber pendant 3 à 5 minutes à 37 °C pour détacher les cellules de la boîte.</li>
	<li>Ajoutez 9 ml de milieu complet Dulbecco’s modified eagle (DMEM) dans les cellules pour neutraliser la trypsine et pipetez de haut en bas à plusieurs reprises pour générer une suspension unicellulaire homogène.</li>
	<li>Transférez immédiatement 20 μL de cellules dans un tube de 1,7 ml et mélangez avec 20 μL de colorant bleu trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (Table des matériaux) ou d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Diluer les cellules à 2 x 105 cellules/mL dans un milieu DMEM complet et ajouter 2 mL dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits (4 x 105 cellules/puits). Incuber les cellules à 37 °C et 10 % de CO2 pendant la nuit. REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des cellules de 293FT qui ont été passées moins de 20x. Nous avons précédemment constaté que l’utilisation de cellules avec un plus grand nombre de passages peut entraîner une réduction des rapports BRET et une augmentation de la variabilité du signal de puits à puits.</li>
</ol>2. Transfection cellulaire (jour 2)
REMARQUE : Ici, les cellules sont transfectées avec les constructions d’expression pCMV5-NanoLuc-CRAF et pCMV5-14-3-3ζ-Halo, ainsi que le vecteur vide pCDNA3.1 (Figure 2).
<ol><li>Avant la transfection, diluer les plasmides N-BRET à 5 ng/μL et pCDNA3.1 à 100 ng/μL, et numéroter un ensemble de tubes stériles de 1,7 mL.</li>
	<li>Ajoutez 100 μL de milieu de transfection (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) dans chaque tube, ainsi que 5 ng de pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng de pCMV5-14-3-3ζ et 200 ng de PCDNA3.1.</li>
	<li>Ajouter 2 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) et agiter doucement pour mélanger. Faites tourner brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse pour vous assurer que tout le liquide est recueilli au fond des tubes, puis incubez à environ 25 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter des complexes de transfection goutte à goutte aux cellules et incuber à 37 °C/10 % de CO2 pendant 16 à 20 h pour permettre l’expression des protéines marquées Halo et Nano. REMARQUE : L’ajout d’un vecteur vide (pCDNA3.1) est essentiel pour obtenir une efficacité de transfection élevée des constructions d’expression de N-BRET. L’absence d’ajout de vecteur vide entraîne une réduction des niveaux d’expression des protéines 14-3-3ζ-Halo et Nano-CRAF et, à son tour, entraîne des rapports BRET faibles et incohérents, comme nous l’avons vu précédemment22.</li>
</ol>3. Replacage cellulaire (jour 3)
REMARQUE : Dans cette étape, les cellules sont transférées sur une plaque de 384 puits et soit un ligand Halo 618 (+ligand ; Table des matériaux) ou DMSO (+véhicule) est ajouté pour la lecture des émissions BRET à l’étape 4. Les cellules restantes sont transférées sur des plaques de culture fraîches à 6 puits pour l’analyse par transfert Western à l’étape 5 (figure 2).
<ol><li>Rassemblez les matériaux suivants et préparez la zone de travail comme décrit ci-dessous.<ol><li>À l’aide d’un bain-marie à 37 °C, préchauffer la trypsine-EDTA, avec des milieux de dosage sans sérum et des milieux de dosage supplémentés à 10 % de FBS (voir la table des matériaux pour plus de détails).</li>
		<li>En fonction du nombre d’échantillons à mesurer, pré-étiqueter trois ensembles de tubes stériles de 1,7 mL (ensembles 1 à 3) et un ensemble de tubes stériles à fond conique de 15 mL. Équipez une centrifugeuse à godet oscillant d’inserts de tube de 15 ml et pré-refroidissez à 4 °C.</li>
		<li>Placez les articles suivants dans la hotte de culture tissulaire : réservoirs de réactifs, plaques de culture tissulaire à 384 puits, plaques de culture tissulaire à 6 puits, pipette multicanaux et pointes, lames/chambres de comptage cellulaire et coloration au bleu trypan (table des matériaux), ainsi que les ensembles de tubes 1 à 3 de 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Récoltez et comptez les cellules comme décrit ci-dessous.<ol><li>Aspirez le milieu des plaques à 6 puits et ajoutez 250 μL de trypsine-EDTA aux cellules. Incuber les plaques à 6 puits à 37 °C jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher (3-5 min).</li>
		<li>Ajouter 1 mL de milieu de dosage complété à 10 % de FBS dans chaque puits pour neutraliser la trypsine et pipeter vigoureusement de haut en bas pour générer une suspension unicellulaire.</li>
		<li>Transférez 1 mL de suspension cellulaire dans les tubes de 15 mL pré-étiquetés. Ajouter 1 mL de milieu de dosage complété à 10 % de FBS dans chacun des tubes de 15 mL.</li>
		<li>Retournez les tubes 5 fois pour mélanger et transférez immédiatement 20 μL de suspension cellulaire dans le tube 1.</li>
		<li>Centrifugeuse dans la centrifugeuse à godet pivotant pré-refroidie pendant 5 min à ~250 x g. Au cours de l’étape de centrifugation, mélangez 20 μL de colorant cellulaire au bleu trypan avec les cellules du tube 1, puis comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre. Un rendement de 6-8 x 105 cellules/mL est typique.</li>
		<li>Retirez les tubes de 15 mL de la centrifugeuse et aspirez le média des pastilles de cellule. Remettre les pastilles cellulaires en suspension à 2 x 105 cellules/mL dans un milieu de dosage sans sérum et pipeter vigoureusement pour générer une suspension unicellulaire. REMARQUE : L’utilisation de milieux de test sans sérum est utilisée pour mettre au repos les voies de signalisation cellulaire normales.</li>
	</ol></li>
	<li>Replaquez les cellules en plaques à 384 puits et à 6 puits comme décrit ci-dessous.<ol><li>Retournez les tubes de 15 mL plusieurs fois pour assurer une suspension cellulaire homogène et transférez les tubes de 500 μL dans les ensembles 2 et 3 de 1,7 mL.</li>
		<li>Ajouter 0,5 μL de DMSO (+véhicule) à la série 2 et 0,5 μL de ligand Halo 618 (+ligand) à la sonde 3 et à la pipette pour mélanger.</li>
		<li>Transférez les suspensions cellulaires +véhicule et +ligand dans des puits séparés des réservoirs de réactifs. À l’aide de la pipette multicanaux (Table des matériaux), transférez 40 μL de la suspension cellulaire +véhicule des réservoirs de réactifs vers les puits quadruplés de la plaque de culture à 384 puits. Répétez cette étape pour les suspensions de cellules +ligand.</li>
		<li>Transférez les cellules restantes dans des plaques de culture fraîches à 6 puits. Incuber les plaques de 384 puits et de 6 puits pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lecture des émissions de BRET (jour 4)
REMARQUE : Dans cette étape, le substrat de nanoluciférase (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) est ajouté aux cellules de la plaque de culture à 384 puits et les émissions de l’accepteur N-BRET (618 nm) et du donneur (460 nm) sont lues (Figure 2). Les rapports BRET corrigés sont ensuite calculés.
<ol><li>Préchauffer le milieu de dosage sans sérum dans un bain d’eau à 37 °C et décongeler le substrat de nanoluciférase à 25 °C. Diluer le substrat de nanoluciférase 1:100 dans un milieu de dosage sans sérum et transférer dans un réservoir de réactifs. Préparez suffisamment de ce mélange pour ajouter 10 μL dans chaque puits de la plaque de 384 puits, plus 10 à 15 % de volume supplémentaire.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette multicanaux (Table of Materials), transférez 10 μL du mélange de substrat dans chacun des puits contenant des cellules dans la plaque de culture à 384 puits. Faites pivoter doucement la plaque pendant 1 min, manuellement ou à l’aide d’un agitateur orbital.</li>
	<li>Insérez la plaque à 384 puits dans le lecteur de plaques multimode et enregistrez les émissions de 460 nm et 618 nm pour tous les puits contenant des cellules. REMARQUE : Pour le lecteur de plaques multimode utilisé pour cette étape (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), une hauteur de lecture de 6,5 mm, avec une mesure de temps de lecture de 0,1 s a été utilisée, mais une optimisation supplémentaire peut être nécessaire si vous utilisez d’autres lecteurs de plaques.</li>
	<li>Calculez individuellement les rapports BRET bruts pour +véhicule et +ligand en unités milliBRET (mBU), à l’aide de l’équation suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66436/66436eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Calculer le rapport BRET corrigé en soustrayant le rapport BRET +véhicule de celui du +ligand (tableau supplémentaire 1). REMARQUE : Lorsque l’on compare les résultats de plusieurs expériences, les rapports BRET corrigés peuvent être regroupés et normalisés à la moyenne de la paire N-BRET de type sauvage (WT), composée de Nano-CRAFWT et de 14-3-3ζWT-Halo (tableau supplémentaire 1).</li>
</ol>5. Confirmation des niveaux d’expression des protéines (jours 4 et 5)
REMARQUE : Dans cette étape, les cellules des plaques à 6 puits sont lysées et les niveaux d’expression protéique des protéines Nano-CRAF et 14-3-3ζ-Halo sont déterminés par analyse par western blot à l’aide d’anticorps spécifiques aux marqueurs Halo et Nano. (Figure 2).
<ol><li>Ajouter des inhibiteurs de protéase et de phosphatase au tampon de lyse NP40 (tableau des matériaux), en autorisant 200 μL de tampon de lyse par échantillon.</li>
	<li>Aspirez le milieu à partir de plaques à 6 puits contenant des cellules. Lavez les cellules une fois avec 1 ml de PBS froid et aspirez.</li>
	<li>Ajouter 125 μL de tampon de lyse NP40 dans chaque puits et incuber des plaques de 6 puits à 4 °C sur une plate-forme à bascule pendant 15 min pour lyser les cellules.</li>
	<li>Transférez les lysats dans des tubes de 1,7 mL sur de la glace et centrifugez-les à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez les lysats éliminés sur de la glace et déterminez la concentration en protéines à l’aide de dosages disponibles dans le commerce, tels que les dosages de Bradford ou d’acide bicchoninique (BCA).</li>
	<li>Normaliser la concentration en protéines dans tous les échantillons en transférant un volume approprié de lysat et de tampon de lyse NP40 dans des tubes frais de 1,7 mL jusqu’à un volume total de 100 μL.</li>
	<li>Faites bouillir 5 tampons d’échantillon de protéines (table des matériaux) pendant 1 min et ajoutez 25 μL à chaque échantillon. Faites bouillir les échantillons pendant 5 à 6 minutes, puis centrifugez brièvement les tubes par impulsions pour vous assurer que tout l’échantillon s’accumule à la base du tube.</li>
	<li>Chargez 25 μL d’échantillon dans chaque puits de gels de protéines dupliqués (gel 1 et gel 2), puis transférez les protéines sur des membranes de nitrocellulose ou de PVDF à l’aide des procédures standard de transfert Western, comme décrit précédemment22.</li>
	<li>Bloquer les membranes dans 3 % de BSA-PBS à 25 °C pendant 30 minutes, puis incuber les membranes pendant la nuit avec l’anticorps Halo (dilution 1:1 000 ; Gel 1) et soit de la nanoluciférase, soit de l’anticorps CRAF (dilution 1:500 ; Gel 2) dans une solution saline tris-tamponnée, complété par 0,2 % de Tween-20 (TBST ; Table des matériaux).</li>
	<li>Laver les membranes 1x pendant 5 min dans 10 mL de TBST, puis incuber à température ambiante pendant 1 h avec un anticorps secondaire HRP anti-souris, dilué 1:10 000 dans du TBST.</li>
	<li>Laver les membranes 3 fois sur une plate-forme basculante dans 10 mL de TBST à 25 °C pendant 5 min chacune. Retirez le TBST et visualisez les bandes protéiques à l’aide de réactifs ECL et d’un processeur de film à rayons X ou d’un autre système d’imagerie approprié.</li>
</ol>

CRAF-14-3-3 Analyse de l’interaction dans des cellules vivantes à l’aide d’une approche basée sur BRET

<ol>
	<li>Blasco, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Raf,+but+not+B-Raf,+is+essential+for+development+of+K-Ras+oncogene-driven+non-small+cell+lung+carcinoma.">c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma.</a> Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).</li><li>Blasco, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+regression+of+advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+upon+combined+inhibition+of+EGFR+and+C-RAF.">Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF.</a> Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).</li><li>Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+zeta+negatively+regulates+raf-1+activity+by+interactions+with+the+Raf-1+cysteine-rich+domain.">14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain.</a> J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).</li><li>Machleidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBRET--A+novel+BRET+platform+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions.">NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions.</a> ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).</li><li>Hekman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+C-Raf+phosphorylation+and+14-3-3+protein+binding+in+response+to+growth+factor+stimulation:+differential+roles+of+14-3-3+protein+binding+sites.">Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites.</a> J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464, 431-435 (2010).</li><li>Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+the+measurement+of+Raf-1+kinase+activity.">A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity.</a> Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+facilitates+Ras-dependent+Raf-1+activation+in+vitro+and+in+vivo.">14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).</li><li>Durrant, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+NanoBRET+screening+platform+to+identify+modulators+of+the+RAS/RAF+interaction.">Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction.</a> Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).</li></ol>

Rien à divulguer.

Des études antérieures ont montré que les protéines 14-3-3 jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition des kinases RAF. Comprendre comment ces événements de liaison sont régulés et les effets de la modulation de ces interactions sur la signalisation RAF et l’oncogenèse induite par RAF pourrait révéler de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques qui ciblent la fonction CRAF. Cependant, le cycle d’activation de Raf est soutenu par une pléthore de protéines associées, de modifications...

Les kinases RAF (ARAF, BRAF et CRAF) sont les effecteurs directs des GTPases RAS et les membres initiateurs de la cascade de kinases RAF-MEK-ERK pro-proliférative/pro-survie. Des études récentes ont montré que l’expression de CRAF joue un rôle clé dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS, notamment le cancer du poumon non à petites cellules et l’adénocarcinome canalaire pancréatique 1,2,3,4,5. De plus, les mutations germinales de CRAF provoquent une forme particulièrement sévère de la RASopathie, le syndrome de Noonan 6,7. La compréhension de la régulation de la CRAF est essentielle pour développer des approches thérapeutiques efficaces qui ciblent sa fonction dans les cellules.
Toutes les kinases RAF peuvent être divisées en deux domaines fonctionnels, un domaine catalytique C-terminal (CAT) et un domaine régulateur N-terminal (REG), qui contrôle son activité (Figure 1A)8. Le domaine REG englobe le domaine de liaison RAS (RBD), le domaine riche en cystéine (CRD) et une région riche en sérine/thréonine (riche en S/T). Notamment, la région riche en S/T contient le site N', qui se lie à 14-3-3 de manière dépendante de la phosphorylation (S259 dans CRAF ; Graphique 1A) 8. Le domaine CAT englobe le domaine kinase, ainsi qu’un deuxième site d’amarrage 14-3-3 de haute affinité, appelé site C'(S621 en CRAF ; Graphique 1A) 8. La liaison différentielle des protéines dimériques 14-3-3 aux sites N’et C', ainsi que le CRD, jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition de RAF 9,10,11,12,13. Dans des conditions normales de signalisation, l’activation de RAF est initiée par son recrutement dans la membrane plasmique par RAS, ce qui lui permet de former des dimères actifs, dont l’hétérodimère BRAF-CRAF est la forme active prédominante14,15. Les analyses biochimiques avec BRAF et CRAF, ainsi que les structures de microscopie électronique cryogénique (Cryo-EM) des BRAF dimériques, indiquent qu’un dimère 14-3-3 stabilise les dimères RAF actifs en se liant simultanément au site C’des deux protomères RAF (Figure 1B)9,13,16,17. À l’inverse, des études ont montré que dans des conditions de repos, RAF adopte une confirmation cytosolique, auto-inhibée, où le domaine REG se lie au domaine CAT et inhibe son activité 12,18,19,20. Cet état fermé est stabilisé par un dimère 14-3-3 lié au CRD et au site N’dans le domaine REG et au site C’dans le domaine CAT (Figure 1B)10,13,21. Dans BRAF, ce modèle est soutenu par les structures Cryo-EM récentes de monomères BRAF auto-inhibés et par nos études biochimiques précédentes 10,12,13,21,22. Cependant, alors qu’il est démontré que le 14-3-3 joue un rôle inhibiteur dans la régulation23 de la CRA, un état auto-inhibé de type BRAF peut jouer un rôle moindre dans la régulation12 de la CRAC ; par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes par lesquels les protéines 14-3-3 régulent l’activité de CRAF. La régulation des kinases RAF médiée par 14-3-3 nécessite une pléthore d’événements de phosphorylation et de désphosphorylation RAF, la liaison à diverses protéines régulatrices et des interactions avec la membrane plasmique8. Par conséquent, il est essentiel que les interactions 14-3-3-RAF soient mesurées dans des conditions physiologiquement pertinentes et en présence d’une bicouche lipidique intacte.
Pour résoudre ce problème, la technologie NanoBRET (ci-après appelée N-BRET ; voir le tableau des matériaux pour les détails du kit) a été utilisée pour développer un test basé sur la proximité permettant de mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes (Figure 1C). Ce système basé sur BRET mesure les interactions de deux protéines d’intérêt (POI), où une protéine est marquée avec un donneur de nanoluciférase (Nano) et l’autre avec un marqueur Halo, pour le marquage avec le ligand accepteur d’énergie Halo61822,24. L’interaction des protéines d’intérêt entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur, qui à son tour génère le signal BRET (Figure 1C). La protéine donneuse Nano extrêmement brillante (émission (em) 460 nm) et le ligand Halo618 (em 618 nm) offrent une séparation spectrale et une sensibilité supérieures à celles de BRET conventionnelles, ce qui en fait une plate-forme idéale pour étudier les interactions plus faibles et détecter les changements subtils de liaison24. En effet, nous avons précédemment développé un test basé sur N-BRET pour mesurer les interactions auto-inhibitrices des domaines RAF REG et CAT, ce qui a été essentiel pour la caractérisation d’un panel de mutations RASopathy dans le CRD BRAF et a démontré l’importance critique de ce domaine pour maintenir l’autoinhibition et prévenir l’activation constitutive de BRAF12.
Le test décrit ici mesure les interactions de CRAF, fusionné à une étiquette Nano N-terminale (Nano-CRAF), et de l’isoforme zêta de 14-3-3 fusionnée à l’étiquette Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo ; Figure 1C). Nous montrons que les interactions de Nano-CRAF avec 14-3-3ζ-Halo génèrent un signal BRET robuste, qui peut à son tour être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 au site N'(S259A) et/ou au site C'(S621A). Le protocole suivant fournit des étapes détaillées pour effectuer, optimiser et dépanner ce test.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211&#160;</td>
			<td>Antibody for detecting HaloTag tagged&#160; proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td>Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRAF mouse monoclonal antibody (E10)&#160;</td>
			<td>Santa Crus Biotechnology</td>
			<td>sc-7267</td>
			<td>Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931-1ML&#160;</td>
			<td>Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE&#8482; 9</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>6365809001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBRET&#8482; kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1661&#160;</td>
			<td>NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca++ and Mg++&#160;</td>
			<td>Quality Biologicals&#160;</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995073</td>
			<td>High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium&#160; pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#8482; I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum media, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Trypan Blue Stain&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>T10282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 lysis buffer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,&#160; NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 &#181;M leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x gel sample buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells (human)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>R70007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-14-3-3&#950;-Halo&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision 2104 Multimode Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer 2104</td>
			<td>2104-0010&#160;</td>
			<td>600LP NanoBRET &#38; M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,&#160; Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Countess&#8482; II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMQAX1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher E1-ClipTip&#8482;&#160; Multichannel&#160; Pipettor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>4672070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (version 10.0.3)&#160;</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>94410153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1228K16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer 384-well CulturPlate&#8482;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007680</td>
			<td>White, polystyrene, tissue culture treated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence resonance energy transfer (bret)-based assay for measuring interactions of craf with 14-3-3 proteins in live cells

CRAF est un effecteur primaire des GTPases RAS et joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS. De plus, CRAF est un point chaud pour les mutations germinales, qui causent la RASopathie développementale, le syndrome de Noonan. Toutes les kinases RAF contiennent de multiples sites de liaison dépendants de la phosphorylation pour les protéines régulatrices 14-3-3. La liaison différentielle de 14-3-3 à ces sites joue un rôle essentiel dans la formation de dimères RAF actifs au niveau de la membrane plasmique dans des conditions de signalisation et dans le maintien de l’auto-inhibition de RAF dans des conditions de repos. Comprendre comment ces interactions sont régulées et comment elles peuvent être modulées est essentiel pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent la fonction RAF. Ici, je décris un test basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Plus précisément, ce test mesure les interactions de CRAF fusionné à un donneur de nano luciférase et de 14-3-3 fusionné à un accepteur de marqueurs Halo, où l’interaction de RAF et 14-3-3 entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur et la génération du signal BRET. Le protocole montre en outre que ce signal peut être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 à chacun de ses sites d’amarrage RAF de haute affinité. Ce protocole décrit les procédures d’ensemencement, de transfection et de replacage des cellules, ainsi que des instructions détaillées pour lire les émissions BRET, effectuer l’analyse des données et confirmer les niveaux d’expression des protéines. De plus, des exemples de résultats d’analyse, ainsi que des étapes d’optimisation et de dépannage, sont fournis.

RAF kinases (ARAF, BRAF, and CRAF) are the direct effectors of RAS GTPases and the initiating members of the pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade. Recent studies have shown that CRAF expression plays a key role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers, including non-small cell lung cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma1,2,3,4,5. Moreover, germline CRAF mutations cause a particularly severe form of the RASopathy, Noonan syndrome6,7. Understanding CRAF regulation is critical for developing successful therapeutic approaches that target its function in cells.
All RAF kinases can be divided into two functional domains, a C-terminal catalytic (CAT) domain and an N-terminal regulatory (REG) domain, that controls its activity (Figure 1A)8. The REG domain encompasses the RAS binding domain (RBD), the cysteine-rich domain (CRD), and a serine/threonine-rich region (S/T-rich). Notably, the S/T-rich region contains the N&#39; site, which binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner (S259 in CRAF; Figure 1A)8. The CAT domain encompasses the kinase domain, along with a second high-affinity 14-3-3 docking site, referred to as the C&#39; site (S621 in CRAF; Figure 1A)8. The differential binding of dimeric 14-3-3 proteins to the N&#39; and C&#39; sites, along with the CRD, plays critical roles in both RAF activation and inhibition9,10,11,12,13. Under normal signaling conditions, RAF activation is initiated by its recruitment to the plasma membrane by RAS, allowing it to form active dimers, of which the BRAF-CRAF heterodimer is the predominant active form14,15. Biochemical assays with BRAF and CRAF, along with cryogenic electron microscopy (Cryo-EM) structures of dimeric BRAF, indicate that a 14-3-3 dimer stabilizes active RAF dimers by binding simultaneously to the C&#39; site of both RAF protomers (Figure 1B)9,13,16,17. Conversely, studies have shown that under quiescent conditions, RAF adopts a cytosolic, autoinhibited confirmation, where the REG domain binds to the CAT domain and inhibits its activity12,18,19,20. This closed state is stabilized by a 14-3-3 dimer bound to the CRD and N&#39; site in the REG domain and to the C&#39; site in the CAT domain (Figure 1B)10,13,21. In BRAF, this model is supported by recent Cryo-EM structures of autoinhibited BRAF monomers and by our previous biochemical studies10,12,13,21,22. However, while 14-3-3 is shown to play an inhibitory role in CRAF regulation23, a BRAF-like autoinhibited state may play a lesser role in CRAF regulation12; therefore further studies are required to clarify the mechanisms by which 14-3-3 proteins regulate CRAF activity. The 14-3-3-mediated regulation of RAF kinases requires a plethora of RAF phosphorylation and de-phosphorylation events, the binding to various regulatory proteins, and interactions with the plasma membrane8. Therefore, it is critical that 14-3-3-RAF interactions are measured under physiologically relevant conditions and in the presence of an intact lipid bilayer.
To address this issue, NanoBRET (from here on referred to as N-BRET; see Table of Materials for kit details) technology was utilized to develop a proximity-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells (Figure 1C). This BRET-based system measures the interactions of two proteins of interest (POI), where one protein is tagged with a nanoluciferase (Nano) donor and the other with a Halo tag, for labeling with the Halo618 energy acceptor ligand22,24. Interaction of the proteins of interest results in donor to acceptor energy transfer, which in turn generates the BRET signal (Figure 1C). The extremely bright Nano donor protein (emission (em) 460 nm) and the Halo618 ligand (em 618 nm) provide greater spectral separation and sensitivity over conventional BRET, making it an ideal platform for studying weaker interactions and detecting subtle changes in binding24. Indeed, we previously developed a N-BRET-based assay for measuring the autoinhibitory interactions of the RAF REG and CAT domains, which was essential for the characterization of a panel of RASopathy mutations in the BRAF CRD and demonstrated the critical importance of this domain for maintaining autoinhibition and preventing constitutive BRAF activation12.
The assay described here measures the interactions of CRAF, fused to an N-terminal Nano tag (Nano-CRAF), and the zeta isoform of 14-3-3 fused to C-terminal Halo tag (14-3-3&#950;-Halo; Figure 1C). We show that the interactions of Nano-CRAF with 14-3-3&#950;-Halo generates a robust BRET signal, which can in turn be disrupted by mutations which prevent 14-3-3 binding to the N&#39; site (S259A) and/or the C&#39; site (S621A). The following protocol provides detailed steps for performing, optimizing, and troubleshooting this assay.

Pleins feux sur l’auteur : Intégration des tests basés sur BRET et de l’analyse des mutations rares pour déchiffrer la régulation de la kinase RAF dans les cellules vivantes

Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

The primary focus of our research is to uncover new vulnerabilities in the Ras-MAPK kinase pathway through the study of rare disease associated mutations within. We recently developed another BRET-based assay for measuring the auto inhibitory activities of RAF kinases in live cells. Importantly, this assay was essential for characterizing a group of rare germline mutations in the BRAF cysteine rich domain, which demonstrated the critical importance of this domain for maintaining BRAF auto inhibition and for preventing constitutive BRAF biological activity.This assay measures the interactions of 1433 proteins with the RAF kinase CRAF, and these interactions play essential roles in mediating RAF function in both development and disease. In addition, this assay combined with previously established assays for measuring RAF auto inhibition and the RAF-RAF interaction form the basis of a toolkit for dissecting the regulatory mechanisms of RAF kinases in live cells.

Lorsqu’elle est effectuée comme décrit dans ce protocole (Figure 2), l’interaction de Nano-CRAFWT et de 14-3-3ζ-Halo devrait produire des rapports BRET corrigés de 50-60 mBU (Figure 3A ; Tableau supplémentaire 1). CRAF contient deux sites d’amarrage 14-3-3 dépendants de la phosphorylation, le site N’et le site C'(Figure 1)8. Par conséquent, les contrôles appropriés...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Integrating BRET-Based Assays and Rare Mutation Analysis to Decipher RAF Kinase Regulation in Live Cells at JoVE.com

Ce protocole décrit un test basé sur BRET pour mesurer les interactions de la kinase CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Le protocole décrit les étapes de préparation des cellules, de lecture des émissions BRET et d’analyse des données. Un exemple de résultat avec l’identification des contrôles appropriés et le dépannage pour l’optimisation du test est également présenté.

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

L’objectif principal de notre recherche est de découvrir de nouvelles vulnérabilités dans la voie de la kinase Ras-MAPK grâce à l’étude des mutations associées aux maladies rares à l’intérieur. Nous avons récemment mis au point un autre test basé sur BRET pour mesurer les activités auto-inhibitrices des kinases RAF dans les cellules vivantes. Il est important de noter que ce test était essentiel pour caractériser un groupe de mutations germinales rares dans le domaine riche en cystéine de BRAF, ce qui a démontré l’importance critique de ce domaine pour maintenir l’auto-inhibition de BRAF et pour prévenir l’activité biologique constitutive de BRAF.Ce test mesure les interactions des protéines 1433 avec la kinase RAF CRAF, et ces interactions jouent un rôle essentiel dans la médiation de la fonction RAF dans le développement et la maladie. De plus, ce test, combiné à des tests précédemment établis pour mesurer l’auto-inhibition de la RAF et l’interaction RAF-RAF, constitue la base d’une boîte à outils permettant de disséquer les mécanismes de régulation des kinases de la RAF dans les cellules vivantes.

bioluminescence-resonance-energy-transfer-bret-based-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

640 vues.  Medical University of South Carolina. L’objectif principal de notre recherche est de découvrir de nouvelles vulnérabilités dans la voie de la kinase Ras-MAPK grâce à l’étude des mutations associées aux maladies rares à l’intérieur. Nous avons récemment mis au point un autre test basé sur BRET pour mesurer les activités auto-inhibitrices des kinases RAF dans les cellules vivantes. Il est important de noter que ce test était essentiel pour caractériser un groupe de mutations germinales rares dans le domaine rich...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Intégration des tests basés sur BRET et de l’analyse des mutations rares pour déchiffrer la régulation de la kinase RAF dans les cellules vivantes

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

Recherche

Biochimie

Transfection of 293FT Cells with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo Expression Constructs

To begin, take 293FT cells cultured in a 10 centimeter dish, and aspirate the media. Wash cells with five milliliters of PBS. Then add one milliliter of trypsin EDTA, and incubate for 3-5 minutes at 37 degrees Celsius to detach cells from the dish.After incubation, add nine milliliters of complete DMEM to the cells to neutralize the trypsin. Pipette up and down repeatedly to generate a homogenous single cell suspension, and transfer the cells to a 15 milliliter tube. Immediately transfer 20 microliters of cells to a 1.7 milliliter tube, and mix with 20 microliters of trypan blue stain.Count cells using either an automated cell counter or a hemocytometer. Transfer the appropriate volume of cells to a 50 milliliter tube, and dilute in complete DMEM. Add two milliliters of cell suspension to each well of a six-well plate.Incubate cells at 37 degrees Celsius and 10%carbon dioxide overnight. Prior to transfection, dilute nanoluciferase CRAF and 1433 zeta halo plasmids, along with a pCDNA3 empty vector in TE buffer. Label a set of sterile 1.7 milliliter tubes.Add 100 microliters of transfection media to each tube, along with the expression constructs. Now add two microliters of transfection reagent, and vortex gently to mix. Pulse spin the tubes briefly in a microcentrifuge, and then incubate the tubes at around 25 degrees Celsius for 15 minutes to allow transfection complexes to form.Afterwards, add transfection complexes to cells dropwise, and incubate at 37 degrees Celsius for 16-20 hours to express the halo and nanotagged proteins.

Transfection de cellules 293FT avec les constructions d’expression pCMV5-NanoLuc-CRAF et pCMV5-14-3-3ζ-Halo

Preparing 293FT Cells Transfected with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo for BRET Emission Assay

To begin, label three sets of sterile 1.7-milliliter tubes and one set of sterile 15-milliliter conical bottom tubes. Prepare a swing bucket centrifuge with 15-milliliter tube inserts and pre-cool to four degrees Celsius. Take the six-well cell culture plate with transfected 293FT cells.Aspirate the media from the wells. Add 250 microliters of trypsin-EDTA and incubate at 37 degrees until cells begin to detach. Then add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each well and pipette vigorously to create a single-cell suspension.Transfer one milliliter of cell suspension to pre-labeled 15-milliliter tubes. Add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each of these tubes and invert five times to mix. Then immediately transfer 20 microliters of cell suspension to tube set one.Now centrifuge the 15 milliliter tubes for five minutes at 250 g in a pre-cooled centrifuge. Mix 20 microliters of trypan blue cell stain with cells in set one and count using a cell counter or hemocytometer. After removing the 15-milliliter tubes from the centrifuge, aspirate media from cell pellets and resuspend pellets in serum-free assay media to create a single-cell suspension.To reflate cells in 384-well and six-well plates, invert the 15-milliliter tubes several times for a homogenous cell suspension and transfer 500 microliters to 1.7 milliliter tubes in set two and set three. Add 0.5 microliters of DMSO to set two and 0.5 microliters of Halo 618 ligand to tube set three and mix well. Transfer the DMSO and ligand-positive cell suspensions to separate wells of reagent reservoirs.Use a multi-channel pipette to transfer 40 microliters of each suspension to the 384-well culture plate. Transfer the remaining cells to fresh six-well culture plates for subsequent western blot analysis and incubate both 384-well and six-well plates overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Take serum-free assay media prewarmed at 37 degrees Celsius.Dilute the thawed nanoluciferase substrate 1:100 in serum-free assay media and transfer it to a reagent reservoir. Using a multi-channel pipette, transfer 10 microliters of substrate mixture to each well of the 384-well culture plate. Gently rotate the plate for one minute.Insert the 384-well plate into a multi-mode plate reader and record the 460 and 618 nanometers emissions from all wells with cells. Calculate the raw BRET ratios for vehicle-positive and ligand-positive in milliBRET units using the given equation. Calculate the corrected BRET ratio by subtracting the vehicle-positive BRET ratio from that of the ligand-positive.The nano-CRAFS259A mutant reduces the BRET signal by approximately 45%and the nano-CRAFS621A mutant by around 25%The double mutant nearly eliminates the BRET signal.