Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de sanitaires (U54CA143906 à KGP, OJTM et R01HL101972 à OJTM) et une Fondation Oregon Medical Research Investigator Award clinique précoce (KGP). OJTM est un chercheur Créé American Heart Association (13EIA12630000). Nous remercions le Dr Eric Anderson de l&#39;Institut du cancer de chevalier de la préparation des échantillons de cellules utilisées dans ce travail.

Une. Microscope Spécifications Pour faire de l&#39;imagerie dans le bon mode microscope devrait avoir les caractéristiques suivantes: <ol><li> Posséder à la fois contraste interférentiel différentiel (DIC) et fond clair (BF) contraste. </li><li> Avoir un mouvement d&#39;axe z commandé par ordinateur. </li><li> Avoir un diaphragme d&#39;ouverture réglable pour faire varier l&#39;ouverture numérique de la lentille de condenseur. Une ouverture avec une règle graduée ou lecture électronique est nécessaire de connaître la valeur de l&#39;ouverture numérique. L&#39;ouverture numérique devrait se situer entre 0,1 pour NIQPM à 0,9 (ou ultérieure) pour HTDIC. </li><li> Le microscope doit avoir un filtre étroit de la couleur de la bande pour être utilisé pour l&#39;imagerie par champ lumineux. Ce filtre est nécessaire pour fixer le minimum de réfraction, une facture de longueur d&#39;onde dépendant utilisé pour convertir la phase de la densité de masse pour PNRPI. </li></ol> 2. Contraste interférentiel différentiel (DIC) Acquisition Z-stack <ol><li> Ouvrez le logiciel SlideBook unee créer une nouvelle diapositive pour la collecte de l&#39;image. </li><li> Ensuite, ouvrez la fenêtre de mise au point. Dans la section Filtre de Set, sélectionnez DIC. Dans l&#39;onglet Champ, dans la section condenseur, réglez la barre coulissante ouverture à la position la plus à droite (ouvrir tout le chemin). Ceci permet d&#39;obtenir l&#39;illumination de grande ouverture numérique et améliore sectionnement optique de l&#39;échantillon. </li><li> Focus sur l&#39;échantillon en utilisant un objectif DIC. Réglez l&#39;intensité de la lampe halogène jusqu&#39;à l&#39;échantillon est facilement visible. Pour assurer la caméra n&#39;est pas saturé, sélectionnez l&#39;onglet de la caméra dans la fenêtre de mise au point et vérifier que l&#39;histogramme des intensités des pixels est dans la gamme dynamique de la caméra. </li><li> Ouvrez la fenêtre de capture d&#39;image. Dans la section Type de capture, cochez la case 3D. Dans la section de capture 3D, sélectionnez la chaîne autour du centre et de retour à l&#39;emplacement actuel </strong&gt; boîtes et spécifier la gamme Z-direction, nombre d&#39;avions, et la taille de l&#39;étape. La gamme Z-direction devrait intégrer l&#39;ensemble de l&#39;échantillon. </li><li> Dans la section Filtre de consigne de la fenêtre de capture d&#39;image, cochez la case DIC et spécifier la durée d&#39;exposition. Dans la section Informations sur l&#39;image, le nom de l&#39;image (en option), puis sélectionnez Démarrer pour lancer l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Champ lumineux (BF) Acquisition Z-stack <ol><li> Une fois que le microscope a terminé la collecte de la DIC Z-pile de l&#39;échantillon, ouvrir la fenêtre Focus et sélectionnez Ouvrir dans la section Filtre de Set. Réglez le curseur d&#39;ouverture à la position la plus à gauche (fermé tout le chemin) pour fournir un éclairage faible NA. </li><li> Changer le filtre parcours de lumière microscope au vert. Réglez l&#39;intensité de la lampe halogène jusqu&#39;à l&#39;échantillon est visible. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de saturation de l&#39;appareil en sélectionnant le <strong&gt; onglet de la caméra dans la fenêtre de mise au point et vérifier que l&#39;histogramme des intensités des pixels est dans la plage spécifiée. </li><li> Ouvrez la fenêtre de capture d&#39;image. Les paramètres de capture 3D de l&#39;acquisition de Z-stack DIC seront affichés. </li><li> Dans la section Filtre de consigne de la fenêtre de capture d&#39;image, cochez la case OPEN et indiquer la durée d&#39;exposition. Dans la section Informations sur l&#39;image, le nom de l&#39;image (en option), puis sélectionnez Démarrer pour lancer l&#39;acquisition d&#39;images Z-stack. </li></ol> 4. Exportation Z-stack Images <ol><li> Ouvrez une capture Z-stack. Modifier l&#39;affichage à 100%. Réglez l&#39;histogramme des valeurs de pixels à afficher entre 0 et la valeur maximale en pixels de la caméra (4095 pour 12 caméras de bits, 65535 pour 16 bits.). </li><li> Sélectionnez Affichage&gt; Exporter&gt; Série TIFF. Cela exporter le Z-stack comme une série d&#39;images TIFF(Une pour chaque plan de Z). Enregistrer la série TIFF dans un dossier séparé avec un nom qui a un trait de soulignement à la fin (c&#39;est à dire &quot;DIC Pile 1_&quot;). Répétez cette opération avec chaque Z-stack DIC ou BF. </li></ol> 5. Les mesures de volume <ol><li> Ouvrez le programme HTDIC MATLAB intitulé «JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Conformément à l&#39;article 0 du programme HTDIC, mettre à jour la variable du répertoire des dépendances. Copiez et collez le répertoire contenant le hilbert_transform_dic.m et fichiers sobel_edge_detect.m de l&#39;explorateur (PC) entre les guillemets simples suivant &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 du programme JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li> Dans la section 1, mettre à jour le &quot;images_directory&quot;. Encore une fois, copier et coller le répertoire contenant les images à travers au point sous forme de tif. Entre les guillemets simples. Fonctionnent uniquement SECTION 1 ONCE. </li><li> Alignement et la rotation des images pour Hilbert transforment Run Section 2 du code. Une boîte de dialogue intitulée &quot;Définir HTDIC Paramètres&quot; apparaît. Cinq numbers sont nécessaires à l&#39;utilisateur: le nombre de plan focal où l&#39;image DIC de l&#39;échantillon est mis au point, la résolution latérale (um / pixel dans l&#39;image), la résolution axiale (c&#39;est 0,1 pour l&#39;acquisition d&#39;images de 0,1 um étapes axiales), l&#39;angle de l&#39;image DIC de rotation nécessaire pour effectuer la transformée de Hilbert, les valeurs typiques sont de 45 et -135. Enfin, saisissez la région de la taille de l&#39;intérêt, ce paramètre définit la longueur d&#39;un côté d&#39;une boîte qui apparaîtra par la suite - valeur typique est de 400. Cliquez sur OK. </li><li> Une image du plan focal DIC spécifiée par le numéro de plan focal apparaît avec une boîte bleue. Placez la boîte sur la fonction d&#39;intérêt, par exemple une cellule. La boîte ne doit pas être carré. Une fois que la boîte a été placée sur la région désirée, double-cliquez à l&#39;intérieur de la boîte. </li><li> Un autre personnage apparaît maintenant: ce chiffre contient une image recadrée et tournée de la région d&#39;intérêt sélectionnée à l&#39;étape précédente. Le contraste de l&#39;image doit être tellecaractéristiques que sombres apparaissent à gauche tandis que des caractéristiques lumineuses apparaissent sur la droite. Faites glisser la boîte bleue sur la région d&#39;intérêt, remodeler si nécessaire. </li><li> Section 3 génère un masque pour le cube z-stack. Il existe deux types de masques disponibles: un masque rectangulaire pour créer un rectangle autour de la cellule et un outil à main pour exposer la cellule d&#39;intérêt à la main. </li><li> Pour générer un masque rectangulaire, décommentez la ligne 167 et ligne 170 commentaire (commenter une ligne en plaçant un &quot;%&quot; au début de cette ligne). Exécuter la section 3 du programme. Cliquez sur l&#39;image et faites glisser la souris pour commencer à définir le masque rectangulaire. Double-cliquez sur la case pour l&#39;accepter. </li><li> Pour générer un masque dessiné à la main, commentaire la ligne 167 et ligne 170 décommentez et exécuter la section 3. Cliquez et dessinez le masque désiré avec la souris. Double-cliquez sur le masque de l&#39;accepter. </li><li> Section Exécutez 4to construire Hilbert transformé l&#39;image DIC pile et l&#39;image DIC pile correspondante de la zone d&#39;intérêt.Le masque construit dans la section 3 sera appliquée à la transformée de Hilbert DIC pile et la pile DIC régulière quand &quot;maskON&quot; est mis à 1 à la ligne 179. Réglage &quot;maskON&quot; à 0 va construire des piles d&#39;images sans appliquer le masque. </li><li> Exécuter la section 5 d&#39;optimiser la segmentation d&#39;image des images en coupe transversale de xz de la région d&#39;intérêt. Figure 500, produite par le programme, l&#39;affichage apparaît trois types de contraste différents. Le succès de l&#39;algorithme pour trouver les bordures de la cellule est tributaire de la combinaison du masque utilisé et la valeur de «seuil» à la ligne 229 du programme. Commencez avec une valeur de 0,5. Réglez la valeur de seuil et relancer cette section du programme jusqu&#39;à ce que le mode Plan adéquate est obtenue dans l&#39;une des colonnes. </li><li> Si le mode Plan était le meilleur dans la colonne 1, utilisez la section 6 pour déterminer le volume à l&#39;aide DIC segmentation d&#39;image. Si la colonne 2 a donné des résultats optimaux, exécutez la section 7 pour déterminer le volume de la cellule de l&#39;imagerie DIC Hilbert transformée. Si la colonne 3 gave les résultats optimaux, Section 8 de fonctionner afin de déterminer le volume moyen de l&#39;imagerie DIC Hilbert transformée de Fourier filtré. </li><li> Le volume mesuré de l&#39;échantillon, rapportée dans um cube (fl) est présenté dans le document de la figure 600, 700, 800 ou produite par le programme en fonction de la mesure du volume est choisi. </li></ol> 6. Mesures de masse <ol><li> Ouvrez le programme NIQPM MATLAB intitulé «JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Conformément à l&#39;article 0 du programme NIQPM, mettre à jour l&#39;emplacement de trois répertoires nécessaires pour exécuter le programme. Ce sont les &quot;dependencies_directory,&quot; le &quot;brightfield_directory,&quot; et le &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Ensuite, exécutez la section 1. Cette section de code génère un champ lumineux cube image de la totalité du champ de l&#39;ensemble des images. Fonctionnent uniquement SECTION 1 ONCE. </li><li> Ensuite, exécutez la section 2. Une boîte de dialogue intitulée &quot;Définir NIQPM Paramètres&quot; apparaît. Quatre numéros sont nécessaires à l&#39;utilisateur: le nombre de plan focal où l&#39;image de champ lumineux de lal&#39;échantillon est mis au point, la résolution latérale (um / pixel dans l&#39;image), la résolution axiale (c&#39;est 0,1 pour l&#39;acquisition d&#39;images à 0,1 um étapes axiales), et la région de la taille d&#39;intérêt, ce paramètre définit la longueur d&#39;un côté d&#39;un boîte qui apparaîtra par la suite - une valeur typique est de 200. Cliquez sur OK. </li><li> Une image du plan focal de champ lumineux spécifié par le numéro de plan focal apparaît avec une boîte bleue. <ol><li> Si l&#39;image n&#39;est pas au point, double-cliquez dans la boîte bleue et la section reprise 2, assurez-vous de régler le nombre de plan focal dans la boîte de dialogue. </li><li> Si l&#39;image est mise au point, faites glisser la boîte bleue autour de l&#39;image et la redimensionner en sélectionnant les nœuds de la boîte et en les déplaçant au besoin. Placez la boîte autour de la caractéristique d&#39;intérêt, par exemple une cellule. La boîte ne doit pas être carré. Double-cliquez à l&#39;intérieur de la boîte à l&#39;accepter. </li></ol></li><li> Ensuite, exécutez la section 3 pour construire une pile d&#39;images de fond clair cultivé dans la région de dansintérêt. </li><li> Pour générer la carte de phase, l&#39;image pseudo DIC, et des comparaisons avec des images lumineuses sur le terrain et la véritable image DIC, exécutez la section 4. </li><li> Avec le pseudo DIC et de vraies images DIC aussi proches que possible de la carte de la densité de la masse, la masse totale, et l&#39;histogramme de la densité de cellules peuvent être déterminées en exécutant l&#39;article 5a ou 5b. Section 5a effectue la détection de frontière automatisé du domaine - optimiser «seuil» à la ligne 300 - valeurs typiques varient entre 0,1-1. Relancez cette section que nécessaire pour optimiser la valeur de seuil. Section 5b effectue détermination de la masse, etc après que l&#39;utilisateur définit la cellule d&#39;intérêt. </li></ol>

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T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics.">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li><li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li><li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier dans le travail présenté.

En général, NIQPM est une technique de diffraction limitée validée sur le chemin optique des longueurs allant de 0,25 à 44,7. La validation a été effectuée sur n = 1,596 sphères de polystyrène de diamètre allant de 0,11 à 9,8 um en suspension dans Fluoromount G (données non présentées). Les cellules possèdent chemin longueurs optiques qui vont de près de 0-7. Lorsque la mesure de la distribution de la densité d&#39;un échantillon, on peut constater que l&#39;image de pseud...

L&#39;utilisation de la microscopie optique est désormais omniprésent dans l&#39;enquête des organismes cellulaires. En raison de leur faible absorption et faible diffusion propriétés endogènes sur le spectre optique visible, les cellules n&#39;affectent pas fortement l&#39;amplitude des ondes optiques qui les traversent et donc apparaissent semi quand imagé avec des microscopes de champ lumineux standard. Échantillons cellulaires font, cependant, ralentissent ondes optiques qui transitent par eux d&#39;une manière qui est linéairement liée à la quantité de masse volumique locale dans une région particulière de l&#39;espace à travers lequel la lumière se déplace. L&#39;utilisation de ce laps de temps hétérogènes ou profil &quot;en phase&quot; d&#39;ondes optiques transmis à travers les échantillons microscopiques a été décrite pour la première en 1935 par Frits Zernike 1 et expérimentalement réalisée par Zernikein 1942 2. Zernike a reçu le prix Nobel en 1953 pour cette réalisation. Zeiss commercialisé cette modalité en 1945 3. En 1955, Smith et Nomarski souhaite présenter leurs travaux initiaux sur l&#39;utilisation 4 et 5 théorie de contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) microscopie, une modalité qui utilise le gradient spatial de phase en tant que mécanisme de contraste. DIC a été commercialisé par Zeiss en 1965in étroite collaboration avec Nomarski 6. En 1981, deux laboratoires ont démontré la première enregistrée cellules vivantes DIC imagerie avec l&#39;incorporation de caméras vidéo dans le train optique du microscope DIC 7, 8. L&#39;ère de l&#39;imagerie des cellules vivantes est né. Depuis ce temps, l&#39;exécution de deux à contraste de phase et DIC sur microscopes commerciaux a été largement inchangé. Ces méthodes sont principalement utilisées par les biologistes pour produire des images de cellules à des fins qualitatives: la surveillance de la morphologie, le suivi des structures sous-cellulaires, et les enquêtes de la dynamique de la membrane 9. Ces techniques sont d&#39;ordre qualitatif dans leur configuration &quot;off-the-shelf&quot; que la phase et DIC images sont des fonctions arbitraires de l&#39;intensité de la source lumineuse, les paramètres optiques d&#39;éclairage, et le gain de la caméra CCD, gamma, et les paramètres d&#39;exposition. Une petite légion de physiciens et d&#39;ingénieurs optiques s&#39;est efforcé de modalités d&#39;imagerie quantitative commerciales. Parmi les premiers efforts étaient deux lettres à la nature en 1952 et 1953 où le médecin devenu biophysicien Robert Barer démontré l&#39;utilisation de la microscopie de phase pour déterminer la masse sèche cellulaire des cellules en estimant déphasages par ces types de cellules en utilisant un microscope de phase disponible dans le commerce 10, 11. Le champ a développé une multitude de techniques au cours des années qui ont suivi articulés autour de trois mécanismes de contraste de base sans étiquette: microscopie de phase 10,11, DIC microscopie 12-17, et sur ​​le terrain lumineux 18-22 pour déterminer chemin optique de longueur, la phase, la masse densité, indice de réfraction, et le volume cellulaire. Au paragraphellèle, une grande collection d&#39;instruments optiques personnalisées ont également été développés depuis les années 1950, et ont consenti des mesures optiques allant des applications à la croissance du parasite 23, à la documentation du cycle cellulaire 24 d&#39;enquêter sur la dynamique des membranes de globules rouges 25. En particulier, les dix dernières années ont vu une multitude de microscopie quantitative sans étiquette sous la forme de microscopie de phase de diffraction 26, la microscopie de phase tomographique 27, la microscopie holographique numérique 28, phase délicate microscopie par cohérence optique 29, spatiale interférence de lumière microscopie 30, Hilbert phase de microscopie 31, et la microscopie de phase quantitative 32. Malgré leurs réussites collectives, ces instruments n&#39;ont pas été diffusés dans le domaine plus large de chercheurs biologiques en raison, principalement, de leur instrumentation complexe et les exigences de calcul. Ici, nous Describe l&#39;utilisation d&#39;un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume, la densité et sur des échantillons cellulaires à travers une combinaison de champ lumineux et l&#39;imagerie DIC. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d&#39;effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC), pour déterminer le volume. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique. Les conditions de formation d&#39;image nécessaire à la bonne exécution entrent dans le cadre du fonctionnement normal de la plupart des microscopes disponibles dans le commerce. En outre, les algorithmes de post-traitement sont stables, rapide et robuste - ayant été mis en œuvre dans MATLAB en utilisant la transformée algorithmes (FFT) sur la base de Fourier rapide chaque fois que possible. NIQPM est un procédé pour reconstruire la phase et la densité de la masse axialement intégré de celspécimens lular à partir d&#39;images de champ lumineux. Sommation de cette masse volumique axialement intégrée sur la surface de l&#39;échantillon donne la teneur en masse sèche totale de l&#39;éprouvette. Le protocole de NIQPM repose sur les fondations expérimentales définies par Paganin et Nugent 18, 19 - dans lequel il a été démontré que le profil de phase d&#39;une cellule peut être reconstruit à partir traversant focalisation champ lumineux imagerie de l&#39;échantillon - et le travail théorique de Frank , Altmeyer, et Wernicke 20 - sur la résolution des modèles de vagues parallèles à l&#39;axe d&#39;une manière efficace par FFT. La connexion de la phase de la densité de la masse sèche est basée sur les travaux de Barer 10, 11 et 33 Popescu. Volumétrique informations peuvent être obtenues à partir des images de mise au point à travers DIC dans des conditions d&#39;illumination NA élevées qui permettent sectionnement optique de l&#39;échantillon le long de l&#39;axe optique. Transformée de Hilbert traitement sur les piles d&#39;images DIC améliore grandementLes algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimens en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l&#39;intensité de l&#39;échantillon à partir de celles de l&#39;arrière-plan. Ce travail émane de Arinson et al. 34 bien que nous avons mis en place deux méthodes de filtrage de Fourier pour améliorer le contraste et d&#39;une méthode de détection bord à base de Sobel pour l&#39;analyse automatique volumétrique de l&#39;échantillon. Nous avons également validé HTDIC précédemment sur ​​des sphères de polystyrène d&#39;une taille allant de la limite de diffraction de 20 um de diamètre 36. Bien que les deux NIQPM HTDIC et sont accessibles sur le plan technologique à cause de leur développement sur les microscopes commerciaux, les procédés sont fondamentalement limitées par la configuration matérielle des microscopes eux-mêmes. Les principales limites de ces techniques sont de deux ordres: lente z-stack temps d&#39;acquisition sur des champs commerciaux, en raison de la traduction de l&#39;étape de la totalité de l&#39;échantillon plutôt que de simplement l&#39;objectif, Limite actuellement l&#39;étude des phénomènes plus rapidement que d&#39;environ 1 image / minute, et d&#39;autre part, des effets de diffraction limitent l&#39;utilité de NIQPM et HTDIC à des objets d&#39;une taille allant de 0,2 à 10 et 20 m de diamètre, respectivement. Ainsi, l&#39;échantillon et de sa dynamique de temps associées d&#39;intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l&#39;utilisation de ces méthodes sur les instruments typiques &quot;off-the-shelf&quot;. Passionnante, la plupart des spécimens cellulaires fixes sont facilement étudiées avec ces méthodes. Un aperçu de la NIQPM et protocoles HTDIC sont donnés dans la figure 1. Dans la figure 2, nous illustrons l&#39;imagerie optimale et sous-optimale par-focus dans des conditions d&#39;éclairage à la fois basse et haute NA pour les deux champs lumineux et imagerie DIC. Figures 3 et 4 montrent le paramètre dépendance de l&#39;algorithme de NIQPM soulignant implémentations réussies ou non. <strong&gt; Figure 5 illustre les étapes de l&#39;algorithme de traitement d&#39;image HTDIC et démontre la mise en œuvre optimale de l&#39;algorithme pour déterminer le volume cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume et la densité sur des échantillons cellulaires grâce à une combinaison de champ lumineux et contraste d&#39;interférence différentiel imagerie. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d&#39;effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC) pour déterminer le volume. NIQPM est basé sur un modèle simplifié de propagation de l&#39;onde, appelée l&#39;approximation paraxiale, avec trois hypothèses sous-jacentes: faible ouverture numérique (NA), éclairage faible diffusion, et la faible absorption de la lumière par l&#39;échantillon. Heureusement, les échantillons cellulaires non colorées répondent à ces hypothèses et un éclairage faible NA est facile à réaliser sur des microscopes commerciaux. HTDIC est utilisé pour obtenir des informations volumétrique de par-focus DIC imagerie sous haute illumin NAconditions ation. Illumination NA élevé permet une meilleure découpe de l&#39;éprouvette le long de l&#39;axe optique. Transformée de Hilbert de traitement sur l&#39;image DIC empile améliore considérablement les algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimen en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l&#39;intensité de l&#39;échantillon à partir de celles du fond. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique utilisant des microscopes &quot;off-the-shelf&quot;. Il existe deux principales limitations de ces méthodes: lente z-stack temps d&#39;acquisition sur les étendues commerciales abroge actuellement l&#39;enquête de phénomènes plus rapidement que 1 image / minute, et d&#39;autre part, des effets de diffraction limitent l&#39;utilité de NIQPM et HTDIC à des objets de 0,2 à 10 (NIQPM) et 20 (HTDIC) um de diamètre, respectivement. Par conséquent, les spécimens et son temps associé dynamique d&#39;intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l&#39;utilisation de ces méthodes. Excitant, cellula plus fixespécimens r sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Corriger éclairage de l&#39;échantillon lors de l&#39;acquisition de l&#39;image par-focus est essentielle à la mise en œuvre réussie de la NIQPM un Algorithmes HTDIC nd. Dans la figure 2, nous illustrons éclairage basse et haute NA sous deux DIC et lumineux contraste de champ pour une sphère de polystyrène et le colorectal ligne de cellules d&#39;adénocarcinome humain SW620. Figures 2A, 2C, 2I, et 2K démontrent imagerie optimale pour NIQPM. <...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K vues.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Une approche recombinaison Cre-Lox P pour la détection de la fusion cellulaire In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

En synthèse in vitro de la maternelle, de l&#39;espacement de longue fibreux et segmentaire collagène Espacement long

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted Plasma Membrane Livraison d&#39;un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabrication et caractérisation des fantômes de tissu optique contenant la Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...