Ce travail a été financé en partie par des subventions de la Direction de la technologie du sud du Texas (POCrr 2,009,041), l&#39;Institut pour l&#39;intégration de la médecine et des sciences à partir du Centre National de Ressources de recherche (UL 1RR025767), et de l&#39;Institut national de recherche dentaire et craniofaciale ( 5R21DE017294).

1. Préparation des lames fonctionnalisées <ol><li> Placez les lamelles de microscope dans un tiroir amovible, et laver deux fois en l&#39;immergeant dans une cuvette contenant de l&#39;éthanol 99% (grade histologique). Essuyez les diapositives nettoyer en utilisant des serviettes en papier (en veillant à ne pas générer de la poussière de papier), et à sec en utilisant un jet d&#39;azote gazeux comprimé. </li></ol> NOTE: Ne pas utiliser Kim-Wipes pour essuyer les lames comme il générer de la poussière de papier fin. <ol start="2"><li> Immergez la grille coulissante contenant les lames dans une cuve de coloration rempli d&#39;acide sulfurique concentré et incuber à température ambiante pendant une nuit. </li></ol> REMARQUE: Pour éviter le contact avec la peau, utilisez des gants résistant aux produits chimiques et des lunettes de sécurité tout en travaillant avec des acides concentrés et les produits chimiques toxiques et corrosives. <ol start="3"><li> Soniquer les diapositives pendant 30 min et lavage avec Milli-Q (18 MQ) de l&#39;eau pendant 30 min, suivi avec un autre de lavage dans uncétone pendant 5 min. Ce traitement expose les groupes silanol sur la surface du verre. </li><li> Enduire les lames propres avec 2,5% (vol / vol dans l&#39;eau) de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) solution, par immersion de la grille dans APTES pendant 30 min, laver 3 fois en eau Milli-Q pendant 15 min à chaque lavage, et la cuisson les diapositives dans un four à 110 ° C pendant 15 min. Cuisson permet de réticulation des APTES, résultant en-NH 2-fonctionnalisation de la surface. </li></ol> REMARQUE: Assurez la solution APTES dans un récipient en plastique puisque les dépôts APTES préférentiellement sur ​​les murs de récipient en verre. <ol start="5"><li> Utilisation d&#39;un tournette, enrober les lames avec 1% (poids / volume dans le toluène) en polystyrène-co-anhydride maléique (MA-PS) (Sigma) pour réaliser une mono-couche de revêtement hydrophobe 6. Ajouter 2,0 mL de PS-MA sur une lame de verre propre monté sur une tournette et le manteau à 3000 rpm pendant 30 s. Ces conditions peuvent varier en fonction de paramètres de revêtement de spin tels que le revêtement afinlution, substrat, l&#39;épaisseur de revêtement et régie par l&#39;équation suivante 7 </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> où h est l&#39;épaisseur de film de revêtement, e est le taux d&#39;évaporation, η, ρ C et la viscosité, la concentration et la densité de la solution de revêtement, respectivement, et ω est la vitesse angulaire. REMARQUE: Le toluène est nocif lorsqu&#39;il est inhalé pendant une longue période et de l&#39;utilisation d&#39;une hotte aspirante est recommandé. <ol start="6"><li> Les diapositives peuvent être stockés dans un tiroir pendant un mois dans un endroit sec, sans poussière conditions à 2 - 8 ° C. </li></ol> 2. Préparation des inoculums de levure et d&#39;encapsulation de collagène <ol><li> Préparer une culture de nuit de C. albicans souche SC5314, dans levure-peptone-dextrose [YPD; 10 g / L d&#39;extrait de levure, 20 g / L de peptone et 20 g / L de dextrose] milieu liquide par inoculation d&#39;une colonie unique de C. albicans dans 10 à 20 mL de YPD 8. Incuber la culture dans un agitateur orbital (environ 150 - 200 rpm) à 30 ° C pendant la nuit. Récolte 1 mL levure Candida albicans cellules de nuit cultures YPD (par centrifugation à 5000 rpm pendant 5-10 minutes) et laver deux fois pendant 10 min dans 1 ml de phosphate stérile (PBS, 10 mM de tampon phosphate, 2,7 mM de chlorure de potassium, 137 mM de chlorure de sodium, pH 7,4) (Sigma) par lavage. Récolte des cellules lavées aussi par centrifugation à 1900 rpm pendant 10 minutes. Remettre en suspension les cellules lavées dans 1 ml de tampon de reconstruction (0,2 N NaOH solution avec du bicarbonate de sodium 2,2% (poids / volume) et de 4,8% (poids / volume) HEPES, pH 7,2). </li></ol> REMARQUE: C. albicans est un microorganisme 1/BSL1 des risques du Groupe. Rappelez-vous toujours d&#39;utiliser les bonnes techniques aseptiques / stériles pour le travail avec ce micro-organisme et de suivre les procédures institutionnelles pour une élimination appropriée des matières infectieuses. <ol start="2"><li> Compter les cellules en utilisant un hemocytOmeter sur un microscope à champ clair et de s&#39;adapter à une densité cellulaire de 5 x 10 7 cellules par millilitre. </li><li> Diluer la suspension dix fois par addition de 10 × RPMI-1640 supplémenté avec L-glutamine et tamponnée avec morpholinepropanesulfonic (MOPS) d&#39;acide (pH 7,2). </li><li> Encapsuler les cellules de levure dans le collagène en mélangeant la suspension de cellules dans un milieu RPMI-1640 avec le collagène (1,8 mg / ml) (type 1 de queue de rat, BD Biosciences, Bedford, MA), pour obtenir une concentration finale de 4 × 10 6 cellules / ml. Garder la suspension de collagène-cellule sur la glace pour empêcher la gélification de collagène avant l&#39;impression. </li></ol> 3. Préparation de Ca BChip <ol><li> Nettoyer et désinfecter les surfaces de la microarrayer, y compris la plaque station source, de lavage et de la station à vide, plateau coulissant sous vide et la chambre d&#39;impression, par essuyage avec 70% d&#39;isopropanol. </li><li> Placez et maintenez par le vide le nombre souhaité de lames de verre PS-MA-enduits sur le jeu de diapositives de la microroarrayer. </li><li> Vortex de la suspension cellulaire en collagène vigoureusement et aspirer 100 pl de la suspension bien mélangée dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits, juste avant l&#39;impression. Placer cette plaque de source dans le poste de chargement. </li><li> Mettez l&#39;humidificateur pour maintenir une humidité relative de 100% dans la chambre de puces tout au long du processus d&#39;impression. </li><li> Imprimer 50 NL de la suspension cellulaire dans un tableau de 48 lignes et 16 colonnes avec des taches espacées de 1,2 mm en dehors à l&#39;aide d&#39;un observateur puces à ADN (Omnigrid Micro, Inc Digilab, Holliston, MA) par des non-contact en utilisant le dépôt conique 190 conseils um orifice en céramique (Digilab). </li><li> Premier, rincer et sécher sous vide des conseils à deux reprises après chaque tour de l&#39;impression. </li><li> Immédiatement après l&#39;impression, placer la lame dans une étanche à l&#39;air, chambre humidifiée (cassette hybridation, ARRAYIT Corporation, Sunnyvale, CA) et incuber à 37 ° C pendant 24 heures pour permettre la formation de biofilm. </li></ol> 4. Test de sensibilité de PrLes biofilms dans eformed Ca BChip contre les agents antifongiques <ol><li> Partir de solutions mères ou de la poudre de médicaments antifongiques, préparer une solution de travail en milieu RPMI-1640. Typiques des concentrations maximales de la solution de travail sont 1024 pg / mL pour le fluconazole et 16 pg / ml pour l&#39;amphotéricine B 5. D&#39;autres concentrations peuvent être utilisés pour différents agents. </li><li> Préparer huit concentrations différentes du composé en diluant la solution stock dans deux dilutions, couvrant une plage avec l&#39;estimation de IC 50 du composé dans le milieu. </li><li> Après 24 h de la croissance du biofilm, utilisez le microarrayer d&#39;imprimer 50 NL de huit différentes concentrations des médicaments, ainsi que positif (c.-à-pas de cellules de drogues dans les médias seulement) et négatifs (traité à l&#39;hypochlorite de sodium pendant 20 min) les contrôles, au moins six répétitions au-dessus des biofilms. </li></ol> REMARQUE: Maintenir une humidité relative de 100% pour éviter le séchage des taches tout en complémentd&#39;ING médicaments. <ol start="4"><li> Peu de temps après l&#39;ajout des médicaments, incuber la puce avec les médicaments dans une chambre humide à 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Laver les médicaments hors de tremper l&#39;CaBChip 3-5 fois pendant 2 min à chaque fois dans du PBS et la tache par incubation de la BChip Ca avec 0,5 uM MIN1 à 37 ° C pendant 30 min 9. </li><li> Lavez la tache avec de tremper l&#39;BChip Ca 3-5 fois dans du PBS pendant 1-3 min à chaque dunk, et sécher le BChip Ca aide d&#39;un courant d&#39;azote. Lire l&#39;intensité de fluorescence à l&#39;aide d&#39;un scanner de microréseau (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) à une longueur d&#39;onde de 532 nm avec un gain de 380 PMT. </li><li> Réglez l&#39;intensité de fluorescence du contrôle positif (aucun médicament) et mortes (eau de Javel-traités) taches biofilm à 100% et 0%, respectivement. </li><li> Déterminer le pourcentage d&#39;inhibition par la réduction de l&#39;intensité de fluorescence (F) par rapport à la moyenne des taches de contrôle en utilisant l&#39;équation suivante </li></ol><img alt="L&#39;équation 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> où F, F max et F o sont premières intensités de fluorescence de la drogue traitée, sans contrôle des drogues et de blanchiment traités par taches, respectivement. Les paramètres du scanner ont été ajustés pour obtenir F max et F o de 30000 et 4000 RFU, respectivement. <ol start="9"><li> Calculer la concentration inhibitrice 50% ou IC 50 en ajustant l&#39;équation pente variable colline en utilisant le logiciel GraphPad Prism (La Jolla, CA). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un représentant Ca BChip, constitué d&#39;un 48 × 16 gamme de nano-biofilms de C. albicans, est représenté sur la figure 2. La microscopie sur fond clair montre une caractéristique architecturale d&#39;ensemble de la nano-biofilm. Les images microscopiques électronique à balayage de la série biofilm que les hyphes fongiques sont incorporés dans la matrice defibres de collagène, qui sont approximativement 2 pm et 100 nm de diamètre, respectivement. Les images MIN1 tachés de scanner puces montrent la levure et les formes des hyphes, qui sont caractéristiques des biofilms fongiques. Les images 2D et 3D confocale de fluorescence de MIN1 tachés de biofilms peut être considéré comme ayant l&#39;hétérogénéité spatiale, avec des régions de cellules métaboliquement actives entrecoupées sein de la matrice extracellulaire (composé de collagène comme le matériau d&#39;encapsulation et très probablement aussi, du matériel produit par exopolymériques cellules de biofilm), ce qui n&#39;est pas souillé par le colorant métabolique. L&#39;épaisseur du biofilm a été estimée à environ 50 um. Le BChip Ca a été utilisée pour estimer la sensibilité aux antifongiques de deux médicaments, le fluconazole et l&#39;amphotéricine B, et les résultats sont présentés dans la figure 3. Conformément aux rapports publiés sur des essais standard de l&#39;industrie de la plaque de 96 puits, les biofilms sont résistants contre le fluconazole 10 et le calcul IC 50 pour<html> amphotéricine B est de 0,3 pg / ml 11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> Diagramme Figure 1. Pour la fabrication de Ca BChip. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> Figure 2. Une image de la BChip haute thoughput Ca, imprimé en utilisant une microarrayer robotique et contenant 768 points sur PS-MA-lames recouvertes. Chaque spot est de 50 nL hémisphérique en volume, environ 700 m de diamètre, et avec une séparation de 1,2 mm entre les points. On voit également (dans le sens horaire) sont la microscopie optique, scanner puces à ADN, la microscopie 2D et 3D de fluorescence, et la numérisation d&#39;images en microscopie électronique des biofilms individuelles sur le BChip Ca. Le chiffre SEM à fort grossissement de 25.000 x montre un filament hyphes de largeur 2 um. Figure 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Résultats des tests de sensibilité antifongique et la détermination des valeurs de CI50 pour (A) au fluconazole et (B) en utilisant l&#39;amphotéricine B Ca BChip. Les images de microscopie de fluorescence de l&#39;amphotéricine B traités par les biofilms sont présentés dans (C). Les résultats sont la moyenne ± écart-type moyen de deux puces distinctes contenant 10 répétitions pour chaque condition.

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	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

Jose L. Lopez-Ribot et Anand K. Ramasubramanian capitaux propres dans les technologies MicrobeHTS, Inc, qui est le développement d&#39;agents antifongiques. Technologies MicrobeHTS, Inc fourni aucun soutien financier pour ces études.

Nous avons développé une cellule à base de puces à ADN de haute densité, Ca BChip, composé de volumes nanolitre des biofilms de Candida albicans. La puce a été imprimé sur du verre modifiée substrats, ce qui a permis pour la fixation solide de taches gel de collagène tout en fournissant hydrophobicité nécessaire pour un non-propagation, gel 3D hémisphérique. Un seul Ca BChip peut remplacer environ huit plaques à 96 puits, et plusieurs puces peuvent être imprimées et traitées...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Polystyrène-co-anhydride maléique (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Lames de microscopie en verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Collagène de type I de queue de rat </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robotic Microarrayer </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> Genepix personnels 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> Cassette d&#39;hybridation </td><td> ARRAYIT Corporation </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> MIN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-méthyl-(benzo -1,3-thiazol-2-yl)-méthylidène)-1-phényl quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Le fluconazole </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> Céramique orifice pm Astuce 190 </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> Logiciel GraphPad Prism </td><td> GraphPad Software, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Genepix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

Candida albicans reste le principal agent étiologique de la candidose, qui représente actuellement le quatrième plus fréquente des infections nosocomiales circulation sanguine dans les hôpitaux américains 1. Ces infections opportunistes constituent une menace croissante pour un nombre croissant de personnes immunodéprimées, et porter les taux de mortalité anormalement élevé. Ceci est en partie due à l&#39;arsenal limité de médicaments antifongiques, mais aussi à l&#39;émergence de la résistance contre les agents antifongiques les plus couramment utilisés. Pour compliquer encore le traitement est le fait que la majorité des manifestations de la candidose sont associés à la formation de biofilms, et les cellules au sein de ces biofilms montrent des niveaux accrus de résistance à la plupart cliniquement agents antifongiques utilisés 2. Nous décrivons ici le développement d&#39;une puce à ADN de haute densité qui se compose de C. albicans nano-biofilms, que nous avons nommé Ca BChip 3. En bref, un microarrayer robotique est utilisée tcellules de levure o impression de C. albicans sur un substrat solide. Pendant l&#39;impression, les cellules de levure sont enfermés dans une matrice tridimensionnelle en utilisant un volume aussi faible que 50 nL et immobilisée sur un substrat en verre avec un revêtement approprié. Après l&#39;impression initiale, les lames sont incubées à 37 ° C pendant 24 heures pour permettre le développement du biofilm. Au cours de cette période, les taches se transformer en plein développement &quot;nano-biofilms» qui présentent certains éléments typiques des caractéristiques structurelles et phénotypiques liées à maturité C. albicans biofilms (c.-à-la complexité morphologique, architecture à trois dimensions et la résistance aux médicaments) 4. Dans l&#39;ensemble, le BChip Ca se compose de ~ 750 équivalents biofilms et spatialement distinctes, avec l&#39;avantage supplémentaire que plusieurs puces peuvent être imprimées et traitées simultanément. La viabilité cellulaire est estimée par la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de MIN1 métabolique tache en utilisant un scanner puces à ADN. Cette puce fongique est idéal pour usoi dans le vrai criblage à haut débit pour la découverte de médicaments antifongiques. Par rapport aux normes actuelles (c.-à-le modèle de 96 puits de plaques de microtitration de la formation de biofilm 5), les principaux avantages de la puce biofilm fongique sont l&#39;automatisation, la miniaturisation, les économies en montant et le coût des réactifs et des analyses en temps, ainsi que l&#39;élimination du travail étapes intensives. Nous croyons que la puce tels permettra d&#39;accélérer considérablement le processus de découverte de médicaments antifongiques.

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Nous avons développé une plate-forme puces à ADN de haute densité composé de nano-3D des biofilms<em&gt; C. albicans</em&gt; Appelé<em&gt; Ca</em&gt; BChip. Le profil de sensibilité des médicaments testés sur un<em&gt; Ca</em&gt; BChip est comparable au modèle de plaque de 96 puits classique, ce qui suggère que la puce fongique est idéal pour une véritable criblage à haut débit des médicaments antifongiques.

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) pour criblage à haut débit des médicaments antifongiques

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K vues.  University of Texas at San Antonio. Nous avons développé une plate-forme puces à ADN de haute densité composé de nano-3D des biofilms C. albicans Appelé Ca BChip. Le profil de sensibilité des médicaments testés sur un Ca BChip est comparable au modèle de plaque de 96 puits classique, ce qui suggère que la puce fongique est idéal pour une véritable criblage à haut débit des médicaments antifongiques.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Recherche

Bio-ingénierie

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automatisé Contraction L&#39;analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Applications pour les panneaux d'éclairage Microplate-Compatible open Source

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...