Ce protocole in vitro, basé sur 96 plaques, peut être utilisé pour tester l’effet inhibiteur des anticorps sur de nouveaux agents antifongiques sur l’activité métabolique des cellules fongiques dans les biofilms de Candida. Par rapport à d’autres méthodes, il s’agit d’une technique très sensible, précise, à haut débit, reproductible, conviviale et rentable pour évaluer l’effet des anticorps ou des antifongiques sur le développement des biofilms de Candida. Ce test peut être utilisé pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements à base de médicaments ou d’anticorps, ainsi que de candidats vaccins contre les biofilms de Candida, qui sont associés à la gravité de la candidose invasive.
Cette méthode peut être appliquée pour tester l’effet de nouveaux agents antifongiques ou anticorps pendant la formation ou la maturation du biofilm dans différents contextes en utilisant différentes souches fongiques ou sources d’anticorps. M. Pankaj Chandley, un chercheur doctorant travaillant dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer, ajoutez 100 microlitres de culture de Candida tropicalis à une plaque de microtitrage de 96 puits.
À l’aide d’une pipette multicanal, remplir les deux dernières colonnes avec 100 microlitres de milieu RPMI 1640 MOPS seul. Couvrir la plaque de microtitrage avec un couvercle et une feuille d’aluminium et incuber la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans des conditions stationnaires. Le lendemain, aspirez soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette multicanal.
Retournez doucement la plaque sur les feuilles de buvard et tapotez pour enlever tout milieu résiduel. Lavez la plaque avec 200 microlitres de 1X PBS à l’aide d’une pipette multicanal. Aspirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette multicanal et lavez deux fois avec du PBS.
Pour éliminer l’excès de PBS, sécher la plaque à l’air pendant 30 minutes à température ambiante à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique. Préparer des dilutions en série d’échantillons de sérum inactivés par la chaleur dans un milieu stérile RPMI 1640 MOPS. Ajouter 100 microlitres de la dilution sérique sélectionnée à chaque puits de la plaque de microtitrage à 96 puits.
Dans la colonne 10, ajouter uniquement le milieu RPMI 1640 MOPS pour le témoin positif contenant uniquement des champignons. Ajouter une dilution de un à 50 de sérum dans tous les puits de la colonne 11 pour servir de témoin négatif sans champignon et sérum. Après avoir recouvert la plaque avec un couvercle et du papier d’aluminium, incuber la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, après avoir aspiré soigneusement le sérum à l’aide d’une pipette multicanal, tapotez doucement la plaque inversée pour enlever tout sérum résiduel. Répétez le lavage PBS trois fois et séchez l’assiette à l’air pendant 30 minutes à température ambiante à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique pour sécher tout excès de PBS. Ensuite, dissoudre 25 milligrammes de XTT dans 50 millilitres de lactate de Ringer stérilisé par filtre.
Aliquote 10 millilitres dans des tubes séparés. Couvrez-le de papier d’aluminium et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, dissoudre 8,6 milligrammes de ménadione dans cinq millilitres d’acétone.
Et après avoir distribué 50 microlitres dans 100 microtubes séparés, stockez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius. Prenez 10 millilitres de XTT et ajoutez un microlitre de ménadione pour obtenir une solution de travail d’une micromolaire. Ajouter 100 microlitres de la solution de ménadione XTT par puits de la plaque de microtitrage de 96 puits.
Ensuite, après avoir recouvert la plaque avec un couvercle et du papier d’aluminium, incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Enfin, transférez 80 microlitres du surnageant coloré de chaque puits dans une nouvelle plaque de 96 puits et lisez la plaque à 490 nanomètres. Le sérum de souris immunisées contre la parapssilose Sap2 pourrait empêcher la maturation des biofilms préformés de Candida tropicalis de 65% par rapport à 45% dans le sérum de Sap2-albicans et à 55% chez les souris immunisées contre Sap2-tropicalis.
En général, l’inhibition du biofilm par le sérum immunitaire Sap2 était significativement plus élevée que celle par le sérum immunitaire fictif, qui est de 16% et 13% dans le sérum pré-immun. L’inhibition du biofilm était presque négligeable lors de l’utilisation du PBS et de l’absence de contrôle sérique. Le plus grand soin doit être pris lors de l’exécution des étapes de lavage pour éviter la perturbation des biofilms.
La solution XTT doit être préparée juste avant utilisation et ajoutée immédiatement à la plaque. En suivant cette procédure, les utilisateurs peuvent évaluer l’effet de nouveaux agents antifongiques, candidats vaccins ou anticorps pendant la formation et la maturation du biofilm de Candida dans différents contextes de recherche en utilisant différentes souches fongiques.
