Les biofilms Candida albicans comme de nombreux spécimens biologiques sont fortement translucides à opaques dans leur état natal. Dans ces protocoles, nous montrons que, à l’aide de méthodes de clarification, la structure interne des biofilms fixes intacts peut être photographiée par microscopie optique de section. Avec des étapes de traitement simples, peu coûteuses et relativement rapides, les biofilms fixes intacts peuvent être rendus transparents pour l’imagerie 3D par microscopie de fluorescence à balayage confocal.
Katie Lagree, chercheuse postdoctorale ici et moi-même, démontrera cette procédure aujourd’hui. Pour commencer la croissance du biofilm dans une plaque de 12 puits, préparez la plaque telle que décrite dans le protocole textuel. Placez la plaque sur un mélangeur orbital de 60 RPM dans un incubateur d’air humidifié de 37 degrés Celsius pendant 90 minutes pour laisser le temps à l’adhérence cellulaire.
Après 90 minutes, retirer les cellules moyennes et non attachées et laver avec un milieu stérile ou PBS. Transférer le substrat inoculé dans une autre plaque multi-puits contenant un milieu de filamentation préchauffé. Remettre la plaque dans l’incubateur d’air ambiant humidifié à 37 degrés Celsius et faire pousser les biofilms jusqu’à 48 heures avec un mélange orbital de 60 RPM pour l’aération.
Récupérez la plaque de 48 heures de l’incubateur et retirez le milieu de culture de chaque spécimen. Remplacer le milieu par du PBS et incuber pendant plusieurs minutes pour diluer les protéines sériques. Après avoir enlevé le PBS, remplissez les puits avec fixatif.
Un volume fixatif suffisant doit être ajouté à chaque plat pour immerger toute la croissance du biofilm, y compris sur les côtés intérieurs du plat. Réglez le plat couvert sur un mélangeur orbital lent pendant 20 minutes. Après avoir enlevé le fixatif tel que décrit dans le protocole de texte, préparez-vous à la coloration en drainant le PBS et en remplissant rapidement les puits avec une solution contenant PBS et la tache requise.
Ne laissez pas le biofilm s’écouler ou sécher pendant plus de quelques secondes. Ajouter la tache au plat. La quantité nécessaire de taches dépend de la masse du biofilm.
Ensuite, placez le plat couvert sur un mélangeur orbital lent pendant la nuit et protégez-vous de la lumière avec du papier d’aluminium ou un morceau de papier noir. À l’aide d’une pince à épiler, transférer le biofilm taché fixe de PBS à cinq millilitres de 50/50 PBS-méthanol dans un flacon de verre de 20 millilitres avec le biofilm orienté vers le haut. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à intervalles d’une minute pendant cinq minutes.
Retirez le solvant dans une bouteille de déchets en étant prudent pour éviter tout contact entre la pipette et le biofilm ou le biofilm et le flacon. Remplir délicatement de trois millilitres de méthanol soigné. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à intervalles d’une minute pendant trois minutes.
Maintenant, retirez le solvant dans une bouteille de déchets et remplissez immédiatement avec cinq millilitres de méthanol. Après avoir mélangé manuellement avec le mouvement orbital à intervalles d’une minute pendant cinq à dix minutes, retirez le solvant à la bouteille de déchets. Remplissez immédiatement de trois millilitres de méthanol.
Les biofilms semblent souvent plus opaques à ce stade que leur apparence initiale. Retirer le solvant dans la bouteille de déchets et remplir immédiatement le flacon de cinq millilitres de salicylate méthanol-méthyle 50/50. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à intervalles d’une minute pendant cinq à dix minutes.
Le biofilm doit être semi-transparent dans ce solvant mixte. Après avoir enlevé le solvant dans une bouteille de déchets, remplissez doucement le flacon de trois millilitres de salicylate méthyle soigné. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à intervalles d’une minute pendant trois minutes.
Répétez le processus avec cinq millilitres de salicylate méthylique soigné, mélangeant manuellement à intervalles d’une minute pendant cinq à dix minutes. À ce stade, le biofilm doit être transparent. Retirer le solvant dans la bouteille de déchets et remplir immédiatement le flacon de trois millilitres de salicylate méthylique soigné.
Le biofilm traité est stable dans ce solvant. Si vous utilisez un microscope inversé, utilisez un plat à l’épreuve des solvants qui a un fond de couverture et préparez des espaceurs pour le soutien de l’échantillon inversé. Ici, les entretaires sont des anneaux de silicone de 13 millimètres qui sont pré-trempés dans le salicylate méthylique pendant une heure pour minimiser la dérive de mise au point due à l’enflure.
Pour un biofilm sur un carré de silicone de qualité médicale, inverser le carré et le mettre sur un espaceur dans une piscine de salicylate méthyle dans le plat. Assurez-vous d’éviter les bulles sous le spécimen. Montez fermement le plat sur la scène du microscope et faites entrer l’huile en contact avec l’objectif.
Ajustez la quantité de salicylate méthylique dans le plat de sorte que le ménisque maintient le spécimen fermement vers le bas sur l’espaceur par tension de surface. Placez une gouttelette de salicylate de méthyle sur le substrat carré inversé pour réduire la dispersion de la lumière du fini mat. Couvrir ensuite le plat d’une plaque de verre pour limiter l’évaporation.
Attendez plusieurs minutes que le spécimen s’installe sur les entretentreurs avant l’imagerie. Maintenant, effectuez la microscopie confoccale pour l’image du spécimen tel que décrit dans le protocole de texte. Pour traiter les images, ouvrez ImageJ ou Fidji.
Vérifiez que le programme a suffisamment de mémoire assignée pour que les données soient traitées. Le traitement d’un ensemble de données de deux gigaoctets nécessite au moins huit gigaoctets de RAM dédié pour un fonctionnement en douceur. Ouvrez le fichier d’image d’avion en série à traiter.
Si l’ordinateur n’a pas suffisamment de RAM pour traiter l’ensemble de la pile, les sous-piles peuvent être traitées puis réassemblées en une seule pile. Convertissez les données en format 32 bits pour permettre des opérations arithmétiques à points flottants à l’aide d’un menu d’image, tapez, 32 bits. Cela doublera la taille du fichier.
Soustrayez l’arrière-plan lisse pour augmenter le contraste des fonctionnalités de mise au point. Traiter l’ensemble de la pile en naviguant pour traiter le menu, soustraire l’arrière-plan. Ajustez le rayon de la balle roulante si nécessaire.
Le rayon de boule doit être significativement plus grand que la plus grande dimension des caractéristiques de mise au point à préserver. Pour définir tous les pixels négatifs à zéro, ajoutez chaque image à sa valeur absolue. Tout d’abord, dupliquer la pile à l’aide du menu d’image, dupliquer, dupliquer la pile.
Ensuite, prenez la valeur absolue des données dupliquées en utilisant le menu de processus, les mathématiques, la valeur absolue. Ajouter les deux piles en naviguant pour traiter le menu, calculateur d’image, ajouter. Pour reslice axially la pile d’images, utilisez le menu d’image, les piles, le reslice.
Sélectionnez ensuite l’espacement de sortie 1.0, commencez par le haut et évitez l’interpolation. L’axe de mise au point est maintenant l’axe vertical dans la pile. La dimension Y de la pile resliced est égale au nombre d’avions de mise au point.
Pour faire une projection de vue latérale d’une partie ou de la partie de la pile, accédez au menu d’image, aux piles, au projet Z. Réglez la tranche de départ et arrêtez la tranche pour inclure une partie ou la partie des plans de vue latérale. Sélectionnez l’intensité maximale pour obtenir de meilleurs résultats.
Corrigez l’échelle axialement de la projection de vue latérale en naviguant vers le menu d’image, l’échelle. La projection doit être corrigée pour la pixelisation inégale du plan d’image et l’augmentation de mise au point à l’aide du facteur d’échelle axial. Réglez l’échelle X en une seule et réglez l’échelle Y sur le facteur d’échelle axial.
Sélectionnez interpolation bicubique. Sélectionnez créer une nouvelle fenêtre. Ajustez la luminosité et le contraste.
Ensuite, convertissez-vous en format huit bits pour l’affichage. Alternativement, appliquez une table de recherchez la couleur et économisez comme RGB ou couleur de huit bits. À l’aide de solvants lamentables en série d’index réfractif croissant, le maximum de clarté peut être rapidement estimé.
Ceci est affiné par microscopie conventionnelle de contraste de phase pour trouver le point de contraste minimum. Un biofilm a été échangé en série entre le xylène et un ensemble étroit de liquides de référence dans cette fourchette. Après chaque échange, le même champ a été déplacé et vu à travers une couverture.
Avec l’indice croissant, l’inversion de contraste est d’abord vue quand n égale 1.530 pour la paroi cellulaire, suivie du cytoplasme quand n égale 1.535. L’imagerie profonde des biofilms mutants et sauvages de type C.albicans est montrée ici. Le biofilm de type sauvage a augmenté à une épaisseur de 502 microns comme on le voit dans la projection de vue latérale de la pile d’images confoccales plan 538.
Les projections axiaques de l’apex à la base montrent la variation des types de cellules et des différentes strates du biofilm. Cet exemple montre la structure caractéristique de type sauvage. Le biofilm mutant a augmenté à une épaisseur de 500 microns comme on le voit dans la projection de vue latérale de la pile d’images plan 556.
Ce mutant connu pour subir une croissance filamenteuse en l’absence de facteurs de stress induisant produit une architecture radicalement différente. Comme on le voit à la fois dans la vue latérale et les projections axiales, de nombreuses cellules ramées donnent lieu à des excroissances radiales. Il s’agit d’un protocole d’imagerie profonde à indice réfractif élevé.
Idéalement, l’indice réfractif du spécimen et l’indice réfractif de l’huile d’immersion devraient correspondre. C’est pourquoi, dans ce cas, nous utilisons un objectif d’immersion d’huile. La plupart de nos études ont été l’imagerie structurale de biofilms à l’aide de marqueurs muraux cellulaires, mais toute méthode de fluorescence qui est utilisée avec des spécimens fixes devrait fonctionner, y compris l’immunofluorescence, la fluorescence in situ hybridation, et l’expression des gènes reporter.
Cet organisme particulier, Candida albicans, est proportionnel chez les humains en bonne santé, mais est aussi un agent pathogène opportuniste qui peut causer des infections muqueuse ou systémiques à levures. Dans certaines institutions, des méthodes et des protocoles de confinement BSL II sont nécessaires. En outre, les fixatifs de formaldéhyde et de glutaraldehyde sont volatils et dangereux.
Ce sont des carcinogènes connus. Faire des dilutions de fixatifs dans une hotte de fumée. Gardez les plats contenant des fixatifs dilués couverts et ne mettez pas les contenants contenant ces fixatifs dans une armoire de biosécurité ou dans un incubateur de culture cellulaire.
