Les études ont été menées à l&#39;Irving Moskowitz et Cherna Center for Nano et Nano-Bio imagerie à l&#39;Institut Weizmann des Sciences. Nous sommes reconnaissants à Orna Yeger pour son aide dans la conception et l&#39;exécution de ce protocole.

1. La préparation des échantillons <ol><li> Après l&#39;extraction du tissu qui doit être examiné, tissus minéralisés peuvent être positionnés dans l&#39;instrument et imagé. Pour l&#39;image du fémur une souris doit suivre les étapes suivantes: <ol><li> Retirez la jambe après mortem d&#39;un embryon C57/BL6 18,5 postceutus jours (E18.5). </li><li> Joint le bout étroit d&#39;une pipette en polystyrène (20-200 ul) à l&#39;aide de résine époxy ou d&#39;une autre colle, et remplissez la pointe avec le tampon de travail (PBS ou autre). </li><li> Monter solidement la jambe dans la pointe et sceller l&#39;autre extrémité avec une feuille de parafilm. </li><li> Placez la pointe de la pipette dans un support approprié et suivre le protocole à partir du chapitre 3. Pour visualiser le fémur de la jambe de l&#39;embryon de souris, l&#39;instrument est mis en 40 KV et 200 uA. Pour 8μ résolution 1000 images de projection avec un grossissement de 4x doivent être acquises. </li></ol></li><li> Non minéralisées des tissus doivent être initialement fixées et colorées afin d&#39;augmenter l&#39;atténuation des rayons X sur le tissu d&#39;intérêt en utilisant un des nombreux protocoles disponibles 8,9. Pour les poumons de rats et des échantillons similaires, le protocole de préparation est la suivante: <ol><li> L&#39;implantation de non Orthotopical le carcinome pulmonaire à petites cellules (CBNPC) NCI-H460 sur les poumons de rats nus </li><li> Nodules de cancer du poumon commence à être détectable 4 semaines à partir d&#39;implantation </li><li> Sacrifice le rat et immédiatement infuser avec une solution saline mélangée avec de l&#39;héparine </li><li> Y injecter une solution diluée d&#39;Microfil (Flowtech), (2 ml de solution de composé, 3 ml de diluant et 0,3 ml de durcisseur) dans le ventricule gauche à tacher la circulation bronchique </li><li> Extraire les poumons et le cœur du rat </li><li> Immobiliser l&#39;échantillon (voir chapitre 2 du protocole) en montage serré dans un tube à essai en plastique de 50 ml </li><li> Créer une atmosphère d&#39;éthanol saturé par la mise sur le fond du tube un chiffon imbibé d&#39;éthanol </li><li> Collez ou visser le tube dans un support de l&#39;instrument </li><li> Procéder à l&#39;établissement des paramètres d&#39;imagerie (chapitre 3). Pour l&#39;imagerie complète des poumons de rats de la source est fixé à 40KV et 100 uA. Afin d&#39;atteindre la résolution 16μ on a à acquérir 2500 images de projection à un grossissement de 0.5x. </li></ol></li></ol> 2. Exemple immobilisation En haute résolution, il est important d&#39;éviter tout changement dans la position de l&#39;échantillon pendant la mesure. Pour cela, l&#39;échantillon est solidement fixé dans un récipient en plastique qui s&#39;adapte à sa taille. Embouts de pipette en polystyrène, plastique ou pipettes Pasteur spécialement construit supports en plastique sont utilisés à cet égard. Selon les exigences expérimentales, l&#39;échantillon peut être examiné dans l&#39;air ou immergés dans des solutions d&#39;éthanol ou de tampon. Immobilisation typique et le positionnement final de la jambe de l&#39;embryon de souris dans l&#39;instrument est montré dans la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Positionnement final de la jambe embryonnaires de souris dans l&#39;instrument de micro CT. 3. Réglage des paramètres d&#39;acquisition: x-ray tension et de courant, le temps d&#39;exposition du CCD <ol><li> Placé dans un support, l&#39;échantillon est mis dans la phase de rotation de l&#39;instrument </li><li> Une première image aux rayons X est pris avec la tension et de courant fixé arbitrairement. </li><li> Si l&#39;image est trop sombre, on devrait augmenter le nombre de photons d&#39;abord, ainsi augmenter un peu le courant. Si cela ne suffit pas, on devrait augmenter légèrement l&#39;énergie des photons de rayons X, c&#39;est à dire la tension sur le tube à rayons X. </li><li> Si l&#39;image est trop claire, il faut d&#39;abord diminuer la tension, le courant. </li><li> La luminosité de l&#39;image peut être augmentée en binning. Binning de 1 prend en compte l&#39;intensité de chaque pixel de l&#39;image, tandis que binning de 2 prend la somme de chaque matrice de 2x2 pixels. L&#39;image sera environ 4 fois plus brillante que dans le cas de binning 1, mais il aura la moitié de la résolution. </li><li> Après avoir réglé la luminosité optimale, il faut optimiser le temps d&#39;exposition de la caméra à un compromis entre le meilleur contraste sur un côté et une durée raisonnable de l&#39;expérience d&#39;un autre côté. </li><li> Le contraste des images, notamment des échantillons de faible absorption, peut être améliorée en utilisant des filtres, ce qui réduit le flux de photons, principalement celle des photons d&#39;énergie inférieure. </li></ol> 4. Positionnement de l&#39;échantillon <ol><li> Choisissez le grossissement de travail. Les choix possibles sont 0.5x, 4x, 10x, 20x et 40x. Le champ de vision diminue avec l&#39;augmentation de grossissement. </li><li> Obtenir la résolution optimale et le champ de vue en définissant la distance entre la source de rayons X et l&#39;échantillon et entre l&#39;échantillon et le détecteur. L&#39;augmentation de la source à distance de l&#39;échantillon diminue le champ de vision et augmente la résolution. Echantillon à distance du détecteur a l&#39;effet inverse. </li></ol> L&#39;ensemble du champ pour être visualisés en 3D devrait être présent dans leimage de la projection à tous les angles. On devrait le vérifier en rotation de l&#39;échantillon à différents angles et en amenant l&#39;échantillon le plus près possible de l&#39;axe de rotation. Pour cela, il faut suivre les étapes suivantes: <ol start="3"><li> Prenez une image à 0 degrés, puis faites pivoter l&#39;échantillon à -20 degrés. Si le volume désiré est déplacée latéralement, on doit corriger sa position en repositionnant l&#39;axe de rotation. </li><li> Après correction, l&#39;échantillon doit être tourné sous un autre angle et la position corrigée à nouveau, jusqu&#39;à ce que le champ d&#39;intérêt est à l&#39;intérieur de l&#39;image à tous les angles de -90 à 90 degrés. </li></ol> 5. Tomogramme haute résolution <ol><li> Pendant la mesure, l&#39;échantillon est en rotation par un petit angle à la fois et à chaque angle de projection d&#39;une image est prise. Le nombre total d&#39;images est toujours un compromis entre la résolution souhaitée d&#39;un côté et le temps de la mesure et la taille du fichier sur un autre côté. Comme le montre la figure 2, chaque projection unique comprend toutes les tranches de l&#39;échantillon superposées l&#39;une sur l&#39;autre, et ne peut donc révéler la structure 3D de l&#39;échantillon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Projection d&#39;images du poumon de rat à 0 ° (A), 45 ° (B) et 90 ° angle de rotation (C). <ol start="2"><li> C&#39;est seulement après la prise d&#39;images de projection au moins entre -90 et 90 degrés, on peut procéder à la reconstruction du volume de l&#39;échantillon. Reconstruction prend entre 10 minutes et 2 heures, en fonction du logiciel utilisé et du nombre de projections. Encore une fois, la qualité finale de l&#39;image 3D est un compromis entre la résolution souhaitée et le temps on veut dépenser et de la taille du fichier résultant. </li></ol> 6. Calibration échelle de l&#39;image Le niveau du pixel (valeur) dans une image reconstruite est unique pour cette image. Afin de comparer les deux images différentes, une échelle d&#39;intensité unique doit être imposée sur chaque image. Pour cette <ol><li> Exécuter une tomographie avec une norme fantôme utilisant les mêmes conditions expérimentales que pour l&#39;échantillon </li><li> Recalibrer l&#39;image de l&#39;échantillon en utilisant les valeurs obtenues pour le fantôme. L&#39;échelle la plus courante est le Hounsfield (ou CT) échelle. Pour un grossissement de 4x la valeur de fond de 15 000 (pour l&#39;eau ou du PBS) a été remplacé par 0 et la valeur maximale de 35 000 pour l&#39;os a été remplacé par la valeur standard Hounsfield de 3000. Autres valeurs de pixels résultant de l&#39;interpolation ou extrapolation linéaire en fonction de ces limites. </li></ol> 7. De traitement et analyse d&#39;images Après l&#39;obtention d&#39;images haute résolution, on doit extraire les informations pertinentes en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Le logiciel d&#39;être utilisé doit être conçu pour fonctionner avec de très gros fichiers (jusqu&#39;à 20Go). 8. Les résultats représentatifs Une représentation d&#39;un fémur d&#39;une souris C57/BL6 au jour embryonnaire 18,5 (E18.5) - quatre jours après l&#39;initiation du processus de minéralisation est représenté en figure 3. Les couches minérales sont clairement visibles (blanc), tandis que les tissus mous ne sont pas visibles dans cette préparation. Nous avons pris 1000 images de projection avec un grossissement linéaire de 4x. La résolution finale est de 8 microns. Une analyse minutieuse du rendu de volume illustré dans la Fig.1, montre que la fraction du volume osseux (la fraction du volume osseux qui est occupé par des tissus minéralisés) est de 0,18, et la densité minérale osseuse est de 723 mg / cm 3. Ces valeurs nous permettent de comparer cette structure avec des os dans les autres stades de développement. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Différentes représentations d&#39;une image 3D d&#39;un embryon de souris du fémur. L&#39;(coupe transversale) transversale (A), le sagittal (médio-latérale) section (B) et un aperçu du rendu de volume (C) sont représentés. La figure 4 montre une image 3D des poumons d&#39;un rat nu féminin (RNE), âgés de 12 semaines, implanté orthotopique avec des non un carcinome pulmonaire à petites cellules (CBNPC) NCI-H460. 2500 images de projection ont été prises avec un grossissement linéaire de 0.5x, assurant une résolution finale de 16 microns. L&#39;image montre les vaisseaux sanguins colorés Microfil (jusqu&#39;à 20 microns de diamètre). L&#39;analyse des images montre que 4 semaines après l&#39;implantation, le cancer des nodules multiples sont formées. Ils couvrent une fraction importante du volume pulmonaire (17%). La plupart des taches pulmonaires a été trouvé dans les zones périphériques des tumeurs. De manière significative, comme le montre le figure 4B, les vaisseaux sanguins de plusieurs sont présents aussi à l&#39;intérieur des nodules, couvrant, selon l&#39;analyse préliminaire des 3% de leur volume. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Image 3D de nodules de cancer de plus en plus un ratpoumon. Un instantané de la prestation de volume (A) et une section à travers le volume (B) sont présentés. Les nodules de cancer sont marqués par des flèches. Film 1. Rendu de volume du fémur de la souris dans la figure 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">Cliquez ici pour regarder le film.</a> Movie 2. Rendu de volume des poumons de rats dans la figure 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">Cliquez ici pour regarder le film.</a> Movie 3. Sections de série à travers les poumons. Les nodules apparaissent comme des zones grises dans la plupart des tranches. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">Cliquez ici pour regarder le film.</a>

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	<li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging.">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li><li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoporosis+imaging.">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li><li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT.">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li><li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies:+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography.">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li><li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods.">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li><li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT.">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li><li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT.">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li><li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Plourabou&#233;, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging.">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li></ol>

C57/BL6 souris au jour embryonnaire 18,5 (E18.5) est quatre jours après l&#39;initiation du processus de minéralisation. A ce stade du développement, de l&#39;os avenir est fait de plusieurs couches de osteoids minéralisée, clairement visible dans la figure 3. À ce stade, il convient de souligner que les tissus minéralisés peuvent être visualisées à faible résolution avec des instruments différents qui exigent de moins d&#39;échantillons. Le présent protocole (et l&#39;instrument de micro-CT utilisé dans celle-ci) en plus de fournir une résolution plus élevée, offre la meilleure flexibilité pour l&#39;utilisateur de choisir les meilleurs paramètres géométriques de la mesure. Résultats de la figure 4 montrent que dans les modèles animaux de cancer des poumons orthotopique, non humaine du cancer du poumon à petites cellules peuvent induire le recrutement des vaisseaux sanguins et la néovascularisation. Nous considérons que le tissu pulmonaire n&#39;a été ni déplacé, ni sa forme modifiée lors de la mesure. L&#39;utilisateur doit prendre des précautions particulières pour éviter de tels changements au cours d&#39;une tomographie. Pour certains échantillons, surtout pour les plus doux de tissu, il faut construire des dispositifs spéciaux de détention qui immobilisent parfaitement l&#39;échantillon pendant la mesure. Malheureusement, la présence de fuites élevées de l&#39;agent de contraste dans les environs de la tumeur empêche une quantification fiable des vaisseaux sanguins périphériques. En conséquence, les images sont entachées par un agent de coloration en particulier sur les bords, ce qui est clairement présente dans les films 2 et 3. Nous ne pouvions pas éviter ce déversement, mais les informations utiles sur les nodules de cancer, y compris leur taille, la forme et la présence de vaisseaux sanguins internes n&#39;a pas été affectée. On pourrait bien conclure qu&#39;au moins pour la circulation bronchique qui a été étudié ici, l&#39;approvisionnement en sang périphérique participe à la perfusion tumorale, avec quelques perfusion présents aussi à l&#39;intérieur de la tumeur.

Pour l&#39;acquisition de l&#39;image que nous avons utilisé un XCT-400 MICRO microfocussed système à rayons X tomographique produite par Xradia, Concord, États-Unis. Les images ont été traitées et analysées à l&#39;aide ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) et MicroView (General Electric, USA) les progiciels. N&#39;importe quel logiciel d&#39;image disponibles analyse peut être utilisée à la place

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro informatique (μCT). Haute résolution μCT est très polyvalent et précises (1-2 microns de résolution) pour l&#39;examen technique de 3D ​​de l&#39;ex-vivo des échantillons biologiques 1, 2. Par opposition à la tomographie électronique, les μCT permet l&#39;examen d&#39;un maximum de 4 cm d&#39;épaisseur des échantillons. Cette technique nécessite seulement quelques heures de la mesure par rapport aux semaines en histologie. En outre, μCT ne repose pas sur des modèles 2D stereologic, il peut donc compléter et, dans certains cas peut même remplacer les méthodes histologiques 3, 4, qui sont à la fois du temps et destructrice. Exemple de climatisation et de positionnement dans μCT est simple et ne nécessite pas de vide élevé ou basse température, ce qui peut nuire à la structure. L&#39;échantillon est positionné et une rotation de 180 ° ou 360 ° entre un microfocused source de rayons X et un détecteur, qui comprend un scintillateur et une caméra CCD précise, pour chaque angle d&#39;une image 2D est prise, puis l&#39;ensemble du volume est reconstruit en utilisant un des différents algorithmes disponibles 5-7. La résolution en 3D augmente avec la diminution de l&#39;étape de rotation. Le protocole vidéo actuelle montre les principales étapes de la préparation, l&#39;immobilisation et le positionnement de l&#39;échantillon suivi par imagerie à haute résolution.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro ordinateur (TAO).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Recherche

Bio-ingénierie

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-particules vélocimétrie par image de profil de vitesse pour mesures de débits Micro sang

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imagerie à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes sous contrainte de traction uniaxiale

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...