Ce travail a été financé par le NIH RO1 AI079253 et le ministère des Anciens Combattants.

1. Modèles animaux <ol><li> Souris: Utilisez p47 phox-/ - souris et d&#39;âge et le sexe assortie souris C57BL6/DBA. Obtenir l&#39;approbation pour des expériences de protection des animaux et du Comité institutionnel utilisation. </li><li> Anesthésie: Utiliser un système d&#39;administration continue isoflurane pour induire une anesthésie. Le système de vaporisation (VetEquip) est rempli avec de l&#39;isoflurane (2-3%). Assurez-vous que les souris sont pleinement anesthésiés par l&#39;observation de la respiration, le mouvement et réflexe cornéen en réponse à des stimuli externes. </li><li> Les interventions chirurgicales: Frotter la zone chirurgicale (de table) avec de l&#39;éthanol à 70%. Porter des gants stériles et une blouse chirurgicale propre et un masque. Préparer les souris par clipsage les cheveux et appliquer la bétadine en alternance avec 70% d&#39;éthanol à l&#39;endroit où l&#39;incision sera faite. Effectuer une intervention chirurgicale sur une surface stérile et utiliser des instruments stériles. Souris Moniteur post-opératoire jusqu&#39;à ce éveillé et se déplacer librement. </li><li> Intratrachéale administration zymosan <ol><li> Administrer une anesthésiecomme décrit dans l&#39;1,2. </li><li> Désinfecter la zone chirurgicale (cou) avec de la bétadine et de l&#39;éthanol à 70% et exposer la trachée par une dissection chirurgicale. </li><li> Pierce trachée avec une aiguille de calibre 27 et d&#39;injecter zymosan (St. Louis, MO) à une dose de 1 mg / g en utilisant un mg 0,5 / ul de solution (volume total de 50 pl pour une souris de 25 g) dissous dans du PBS stérile. </li><li> Fermer cou souris enroulé avec des sutures en soie 5-0 stériles dans des conditions aseptiques. </li><li> L&#39;image après 4 h et 24 h. </li></ol></li><li> Ligature caecale et ponction <ol><li> Administrer une anesthésie comme décrit en 1.2. </li><li> Couper les poils dans la zone chirurgicale (abdomen) et désinfecter avec de la bétadine et de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Effectuer une laparotomie médiane et identifier le caecum. </li><li> Ligaturer la partie distale 50% du caecum exposée avec une suture de soie 4-0 et le caecum perforation distale de la ligature avec un passage d&#39;une aiguille de calibre 21. </li><li> Fermer l&#39;incision avec des sutures en soie 4-0 stériles. </li><li> Image après 4 h et24 heures. </li></ol></li><li> Oral tétrachlorure de carbone (CCl 4) l&#39;administration <ol><li> Administrer une anesthésie comme décrit en 1.2. </li><li> Administrer CCl 4 (2 mg / g, St. Louis, MO) dissous dans l&#39;huile de maïs par gavage oral. La procédure de CCl4 administration doit être effectuée dans une zone désignée conformément à l&#39;IBC / EHS politiques. </li><li> L&#39;image après 4 h et 24 h. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;acquisition d&#39;une image Bioluminescent <ol><li> Initialiser le IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) système d&#39;imagerie, réglé sur le mode de luminescence, et attendez que le dispositif à couplage de charge (CCD) pour verrouiller la température. </li><li> Sélectionnez la durée d&#39;exposition, binning (moyenne) et F / Stop (8) paramètres. </li><li> Souris placer en position couchée dans la chambre d&#39;imagerie sur une platine chauffante pour maintenir la température normale du corps. Administrer une anesthésie selon la coiffe par 1,2 alors que les souris sont dans la chambre d&#39;imagerie IVIS. </li><li> Administrer L-012<html> (20 pg / g) dissous dans du PBS stérile (10 pg / pl) par voie intraveineuse via rétro-orbitaire d&#39;injection à chaque moment choisi pour l&#39;imagerie. </li><li> Capturez des images en commençant à 2 min après injection de L-012. Nous utilisons généralement une exposition de 40 sec. </li></ol> 3. Analyse des données en utilisant la région d&#39;intérêt <ol><li> Analyser les données en utilisant un logiciel image vivante v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). </li><li> Ouvrez une image et sélectionner la mesure de la Région d&#39;outils d&#39;intérêt. </li><li> Sélectionnez la région de la forme et de la taille d&#39;intérêts sur la poitrine et / ou l&#39;abdomen après superposition d&#39;une image pseudo-couleur numérique (représentant la détection de photons) sur une image photographique de la souris. </li><li> Quantifier l&#39;intensité du signal (flux de photons) de la région d&#39;intérêt. </li></ol> 4. Statistiques <ol><li> Utilisez statistique progiciel d&#39;analyse à effectuer deux ANOVA avec correction de Bonferroni post-tests à des moments différents. </li></ol>TLE &quot;&gt; Les résultats représentatifs 5. Zymosan est un produit pro-inflammatoire des cellules de levure mur et un puissant activateur de la NADPH oxydase 3. Nous avons montré précédemment que zymosan intratrachéale induit une inflammation des poumons plus robuste neutrophiles et la production de cytokines pro-inflammatoires dans p47 phox-/ - par rapport au type sauvage souris 1. Ici, notre objectif était de comparer la génération de ROS dans les poumons de type sauvage et p47 phox-/ - souris à la suite défi zymosan. A 4 heures après administration intratrachéale zymosan, nous avons observé une augmentation significative de l&#39;émission de photons sur la poitrine chez les souris de type sauvage par rapport au scénario de référence, ainsi qu&#39;une augmentation de l&#39;émission de photons dans de type sauvage par rapport à p47 phox-/ - ont à 4 h et 24 h. En revanche, les signaux de bioluminescence en p47 phox-/ - souris sont restées au niveau de référence à 4 h après le traitement zymosan (Fig.1 AB). Ainsi, la NADPH oxydase semble be la principale source de production de ROS dans les poumons après l&#39;administration zymosan. Ensuite, nous avons évalué la production de ROS dans le modèle de septicémie CLP-induite. Le sepsis est un syndrome potentiellement mortelle associée à des organes cibles des blessures, y compris une lésion pulmonaire aiguë (ALI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) 4, 5. ROS médiée par des blessures a été considérée comme un facteur important dans induite par le sepsis dysfonction d&#39;organes multiples. Nous avons constaté que les ROS ont été considérablement augmenté au cours de la poitrine (4 h) et sur l&#39;abdomen (24 h) à la suite CLP souris de type sauvage par rapport à la valeur initiale. Cependant, les niveaux de ROS en p47 phox-/ - ont étaient similaires aux niveaux de référence à des points temporels deux (Fig.2 AC). Ces résultats montrent que la génération de ROS dans le modèle CLP-induite septicémie souris est NADPH oxydase dépendante. Enfin, nous avons utilisé l&#39;imagerie par bioluminescence pour détecter la production de ROS dans un CCl 4-induite mode de lésions hépatiquesl. CCl 4 provoque une nécrose hépatocellulaire, et a été utilisé pour modéliser à la fois une atteinte hépatique aiguë et 6 fibrose hépatique. Contrairement aux modèles décrits précédemment de l&#39;inflammation et des blessures, nous avons constaté que la production de ROS dans l&#39;abdomen était modeste (environ 35%) a augmenté par rapport au départ de p47 phox-/ - souris à 4 heures après l&#39;administration de CCl 4. Cependant, l&#39;ampleur de CCl 4 induite par les ROS génération était significativement plus élevée chez les souris de type sauvage que dans p47 phox-/ - ont (Fig.3 AB). Ces données suggèrent que l&#39;p47 phox génération contenant du NADPH oxydase dépendante et indépendante de ROS se produire dans CCl atteinte hépatique aiguë 4-induite. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> Figure 1. Production de ROS dans les poumons après le traitement zymosan. A) représentant bioluminescenCE imagerie de la production de ROS. Notez qu&#39;en plus de la poitrine, la luminescence est détectable sur l&#39;abdomen à la fois de type sauvage et p47 phox-/ - souris et la luminescence abdominale est inchangée par le traitement zymosan. B) comptages de photons de la poitrine de type sauvage et p47 phox-/ - souris après une seule injection intra-trachéale (IT) du zymosan. Imagerie par bioluminescence a été initialement réalisée, 4 h et 24 h. Émission de lumière à partir de la région d&#39;intérêt sur la poitrine a été identifié en utilisant la pseudo-couleur indiquée échelle. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, n = 6-9 par groupe, * = p &lt;0,05. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> Figure 2. Détection de ROS suite CLP. Une imagerie) représentant la bioluminescence de la production de ROS, BComptages de photons) de la poitrine, et C) comptages de photons de l&#39;abdomen de type sauvage et p47 phox-/ - ont au départ, 4 h, et ​​24 h après CLP. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, n = 4-5 par groupe, * = p &lt;0,05. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> Figure 3. Production de ROS dans l&#39;abdomen après CCl 4-lésions hépatiques induites. Une imagerie) bioluminescence Représentant de la production de ROS et B) comptages de photons de l&#39;abdomen de type sauvage et p47 phox-/ - ont au départ, 4 heures et 24 heures après l&#39;administration orale CCl 4 traitements. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SE;. N = 4-5 par groupe, * = p &lt;0,05 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> </a&gt;.

<ol>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

&quot;En temps réel&quot; la mesure des espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) chez les animaux vivants peuvent être obtenus en utilisant des sondes fluorescentes et chimiluminescence. Tandis que les sondes fluorescentes comportant souffrent de faiblesse de signal sur bruit 12, la technique d&#39;imagerie décrit est plus sensible à la détection de l&#39;émission de lumière à la suite d&#39;une réaction chimique de ROS avec le substrat à base de luminol L-012. Comme toutes les techniques d&#39;i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako Chemicals USA, Inc </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> le tétrachlorure de carbone </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of nadph oxidase activity in different animal models

NADPH oxydase est une enzyme essentielle qui assure la médiation défense de l&#39;hôte antibactérienne et antifongique. En plus de son rôle dans la défense de l&#39;hôte antimicrobienne, la NADPH oxydase a les fonctions essentielles de signalisation qui modulent la réponse inflammatoire 1. Ainsi, le développement d&#39;une méthode de mesure en &quot;temps réel&quot; la cinétique de la NADPH oxydase dérivée de génération de ROS est prévu pour être un outil de recherche précieux pour comprendre les mécanismes pertinents de défense de l&#39;hôte, de l&#39;inflammation et des blessures. Granulomatose chronique (CGD) est une maladie héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections graves et de l&#39;inflammation excessive. L&#39;activation de la NADPH oxydase phagocytaire nécessite la translocation de ses sous-unités cytosoliques (p47 phox, p67 phox, p40 phox et) et Rac à un flavocytochrome liée à la membrane (composé d&#39;un phox gp91 et p22 phox hétérodimère). Pertedes mutations de fonction dans l&#39;un de ces composants résultat oxydase NADPH en DMC. Similaires aux patients atteints de CGD, gp91 phox souris déficientes en p47 phox et les souris déficientes ont une activité défectueuse NADPH oxydase phagocytaire et l&#39;hôte altération de la défense 13, 14. En plus des phagocytes, qui contiennent les composants de la NADPH oxydase décrites ci-dessus, une variété de types de cellules expriment différentes isoformes de la NADPH oxydase. Nous décrivons ici une méthode pour quantifier la production de ROS chez les souris vivantes et de délimiter la contribution de la NADPH oxydase à la génération de ROS dans les modèles d&#39;inflammation et des blessures. Cette méthode est basée sur la réaction de ROS L-012 (un analogue de luminol) pour émettre de la luminescence qui est enregistrée par un dispositif à couplage de charge (CCD). Dans la description originale de la sonde L-012, L-012-dépendante chimioluminescence a été complètement abolie par la superoxyde dismutase, ce qui indique que la principale ROS détecté dans cette réaction était superanion oxyde 15. Des études ultérieures ont montré que la L-012 peut détecter les autres radicaux libres, y compris les espèces réactives de l&#39;azote 16, 17. Kielland et al. 17 ont montré que l&#39;application topique d&#39;acétate de phorbol myristate, un puissant activateur de la NADPH oxydase, mené en NADPH oxydase dépendante de la production de ROS qui pourrait être détectée chez les souris en utilisant la sonde luminescente L-012. Dans ce modèle, ils ont montré que la luminescence L-012-dépendante a été aboli en p47 phox souris déficientes. Nous avons comparé la génération de ROS dans les souris de type sauvage et NADPH oxydase déficiente en p47 phox-/ - ont 2 dans les trois modèles suivants: 1) l&#39;administration intratrachéale de zymosan, une cellule pro-inflammatoire fongique mur produit dérivé qui permet d&#39;activer la NADPH oxydase; 2) ligature caecale et ponction (CLP), un modèle de sepsis intra-abdominal avec une inflammation pulmonaire aiguë secondaire et des blessures, et 3) le tétrachlorure de carbone par voie orale(CCl 4), un modèle de lésion hépatique ROS-dépendante. Ces modèles ont été spécifiquement choisis pour évaluer la NADPH oxydase dépendante de la production de ROS dans le cadre de l&#39;inflammation non infectieuse, la septicémie polymicrobienne, et la toxine induite par une lésion d&#39;organe, respectivement. En comparant la bioluminescence chez la souris de type sauvage de p47 phox-/ - ont nous permet de définir la contribution spécifique de ROS générés par p47 phox de la NADPH oxydase contenant au signal bioluminescent dans ces modèles. Résultats de l&#39;imagerie de bioluminescence qui ont démontré une augmentation des niveaux de ROS dans les souris de type sauvage par rapport à p47 phox-/ - ont indiqué que la NADPH oxydase est la principale source de production de ROS en réponse à des stimuli inflammatoires. Cette méthode offre une approche minimalement invasive pour &quot;temps réel&quot; suivi de la production de ROS au cours de l&#39;inflammation in vivo.

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Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxydase est la principale source d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

Imagerie par bioluminescence de l&#39;activité de la NADPH oxydase dans différents modèles animaux

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K vues.  Vanderbilt University School of Medicine. NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

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Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

Diagnostic de l&#39;ecto-et endoparasites chez les rats et les souris de laboratoire

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Recherche

Immunologie et infection

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La salive, les glandes salivaires, et Collection hémolymphe de tiques Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

L&#39;isolement et la transplantation de différents âgées murins thymiques greffes.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In vivo Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante Acinetobacter baumannii Gravez Infections En utilisant l&#39; imagerie par bioluminescence

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non invasif<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique à fluorescence d&#39;une activité MMP inflammatoire à l&#39;aide d&#39;un agent d&#39;imagerie fluorescente activable

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imagerie en direct de l&#39;activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...