Nous tenons à remercier William T. Eckert pour raconter la vidéo. Développement du protocole de laine de verre a fait partie de l&#39;eau du Wisconsin et de première instance de la santé pour les risques entériques (WAHTER étude), financés par des États-Unis EPA Grant STAR R831630. Échantillons de l&#39;Alaska ont été recueillis par A. Reeves, A. Ramey, et B. Meixell avec le soutien financier de l&#39;USGS. Toute utilisation des noms commerciaux, le produit, ou le cabinet est à des fins descriptives seulement et n&#39;implique pas l&#39;approbation par le Gouvernement des États-Unis.

1. Préparation de la laine de verre <ol><li> Avant et après avoir effectué chaque lot de filtres, la stérilisation de la zone de travail avec une solution javellisée à 10%. </li><li> Mettez des gants et une blouse. Stériliser un seau à l&#39;autoclave à 121 ° C et 15 psi pendant au moins 20 minutes. Placez la laine de verre dans le seau stérile. </li><li> Saturer la laine de verre avec de l&#39;eau par osmose inverse et laisser tremper pendant 15 minutes. </li><li> Égoutter l&#39;eau par osmose inverse dans le seau. </li><li> Saturer la laine de verre avec 1 M de HCl et laissez tremper pendant 15 minutes. </li><li> Égoutter le HCl 1 M dans le seau. </li><li> Rincer la laine de verre avec de l&#39;eau par osmose inverse. </li><li> Mélanger soigneusement. </li><li> Vérifiez le pH en utilisant du papier pH et répétez l&#39;eau par osmose inverse de rinçage jusqu&#39;à ce qu&#39;un pH neutre est atteint. </li><li> Décanter l&#39;eau de rinçage. </li><li> Saturer la laine de verre avec 1 M de NaOH et laisser tremper pendant 15 minutes. </li><li> Égoutter le NaOH 1 M dans le seau. </li><li> Répéter l&#39;osmose inverse de rinçage jusqu&#39;à ce qu&#39;un pH neutre soit atteinte. </li><li> Décanter l&#39;eau de rinçage. </li><li> Au lieu d&#39;un seau, une rondelle de laine de verre peuvent être construits, ce qui est de conception similaire à un lave-verres de pipette (Figure 1). </li><li> Couvrir la laine de verre complètement avec phosphate stérile (PBS) ajusté à pH 6,8. </li><li> Utilisez la laine de verre préparée immédiatement ou conserver à 4 ° C. Il peut être stocké pendant jusqu&#39;à deux semaines. Avant d&#39;utiliser, assurez-vous que le pH est neutre car il va augmenter au fil du temps. Si le pH n&#39;est pas neutre, re-rincer avec de phosphate stérile saline tamponnée (pH 6,8). </li></ol> 2. Montage du filtre de laine de verre <ol><li> Percer un trou 11/16 de pouce dans les capuchons de PVC et de fils de prise de sorte que les raccords mâles nylon adaptateur peut être vissées dans les bouchons. Cette étape est nécessaire seulement pour la première assemblée. Par la suite, les bouchons peuvent être utilisés pendant des années. Appliquez du Téflonruban adhésif pour les fils de nylon et raccords à vis pour les bouchons. </li><li> Emballez le tuyau en PVC avec des petits morceaux de laine de verre. Utilisez un piston en métal, comme une soupape de moteur de voiture, d&#39;emballer serré. Emballage ne nécessite pas une grande force. Pack assez serré pour que la laine de verre reste en place et les canaux ne font pas. Toutefois, ne placez pas si étroitement de l&#39;eau ne peut s&#39;écouler à travers le filtre. Lorsque emballés de manière appropriée, un débit de 4 à 5 litres par minute devrait pouvoir être atteint lorsque le filtre est attaché à des robinets d&#39;eau avec des pressions comprises entre 40-60 psi. Pour la taille des tuyaux en PVC spécifiée par ce protocole, environ 85 grammes lavé et laine de verre rempli est utilisé par tuyau. Tare du tube vide en PVC sur un équilibre chargement par le haut et le bloc avec de la laine de verre lavé jusqu&#39;à ce que la masse tuyau augmente de 85 grammes. </li><li> Insérez maille de polypropylène dans les bouchons en PVC avec raccords mâles en nylon adaptateur. </li><li> Appliquer du ruban de téflon pour les parties filetées du tuyau en PVC. </li><li> Visser les capuchons en PVC à l&#39;p PVCipe et l&#39;étiquette d&#39;une extrémité de filtre à l&#39;afflux et l&#39;autre extrémité l&#39;écoulement. Ceci est important plus tard pour l&#39;étape d&#39;élution. Par quel bout est marqué d&#39;entrée n&#39;a pas d&#39;importance. </li><li> Poussez 60 ml de phosphate stérile saline tamponnée (pH = 6,8) dans le filtre à l&#39;aide d&#39;un cathéter basculé seringue. Excédent sortira extrémité opposée. </li><li> Wrap se termine bien avec du Parafilm pour éviter toute fuite. Les filtres peuvent être stockées jusqu&#39;à 30 jours à 4 ° C. </li></ol> 3. D&#39;échantillonnage <ol><li> Stériliser tube utilisé pour l&#39;échantillonnage par recirculation ou par immersion articles pendant 30 minutes dans 0,525% (ie, une solution à 10% d&#39;eau de Javel standard) NaClO. Suivez ce en drainant la solution d&#39;hypochlorite et de neutraliser avec du thiosulfate de sodium à 0,05%, en ajoutant 25 ml d&#39;un stock anhydre solution à 2% de thiosulfate de sodium à un litre d&#39;eau par osmose inverse. </li><li> Pour l&#39;échantillon d&#39;eau avec un pH supérieur à 7,5, ajuster le pH à entre 6,5 et 7,0 avec HCl. La concentration de HCl peut varier de 0,25M à 1 M. Quatre litres HCl 0,5 M est généralement suffisant pour deux échantillons de 800 litres, selon le pH ambiant de l&#39;eau et la capacité de mémoire tampon. Injecter HCl lors de l&#39;échantillonnage à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique ou Venturi (Figure 2). Ajuster la vitesse de la pompe ou l&#39;ouverture à venturi pour obtenir le pH cible. Mesurer le pH à la sortie de conduit échantillon en utilisant un pH-mètre champ. </li><li> Utilisez un préfiltre si les sabots de laine de verre filtre de l&#39;eau avec une turbidité élevée. (Spécifications pour le préfiltre et son logement sont dans la ligne la liste des matériaux.) Parce que les agents pathogènes peuvent être attachés à des particules piégées par le préfiltre doit être élue avec le filtre de laine de verre (voir ci-dessous). </li><li> Régler le débit à entre 2 et 4 litres par minute. Volumes d&#39;échantillons typiques sont comprises entre 200 et 1.500 litres. </li><li> Débrancher le filtre de laine de verre et le ranger dans un sac en plastique stérile à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 48 heures. </li></ol> 4. Élution <ol><li> Apposer le filtre de laine de verre à un anneautenir avec l&#39;extrémité d&#39;entrée d&#39;échantillon pointant vers le bas dans une bouteille en polypropylène. Éluer opposé de la direction d&#39;écoulement de l&#39;échantillon. </li><li> Pousser 80 ml d&#39;extrait de boeuf stérile 3% en 0,05 M de glycine ayant un pH de 9,5 dans le filtre. </li><li> Attendre 15 minutes. </li><li> Pousser un autre ml de l&#39;extrait de boeuf 80 stérile 3% en 0,05 M de glycine ayant un pH de 9,5 dans le filtre. </li><li> Poussez l&#39;air approfondie du filtre jusqu&#39;à ce que la mousse sort de l&#39;entrée du filtre. </li><li> Ajuster le pH éluat à entre 7,0 et 7,5 avec HCl 1M. </li><li> Éluat Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 24 heures ou à -20 ° C pendant de longues périodes de temps. </li><li> Éluer le préfiltre si elle est utilisée. Dévissez la partie supérieure de la cartouche du logement et verser toute l&#39;eau résiduelle à l&#39;intérieur du boîtier tout en maintenant le préfiltre en place avec des mains gantées stériles. </li><li> Retirez le préfiltre de la cartouche du logement et de le glisser dans un 15 &quot;x 6&quot; sac zip-lock. </li><li> Verser 200 ml d&#39;extrait de boeuf stérile 3% dans 0,05 M glycine avec un pH de 9,5 dans le sac, fermer hermétiquement avec la fermeture à glissière. </li><li> Inverser le préfiltre sac à plusieurs reprises afin d&#39;assurer la surface entière entre en contact avec l&#39;extrait de boeuf. </li><li> Attendez 15 minutes, à l&#39;occasion d&#39;inversion et de masser le préfiltre en sac. </li><li> Ouvrez le zip-lock. Saisir le sac autour du préfiltre étroitement à retirer le plus d&#39;extrait de boeuf autant que possible et tirer le préfiltre avec des mains gantées stériles,. </li><li> Verser l&#39;éluat extrait de boeuf dans une bouteille en polypropylène. </li><li> Ajuster le pH éluat à entre 7,0 et 7,5 avec HCl 1M. </li><li> Éluat Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 24 heures ou à -20 ° C pendant de longues périodes de temps. L&#39;éluat préfiltre peut être analysé séparément pour les agents pathogènes ou combiné avec l&#39;éluat filtre de laine de verre. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <table border="1"><tbody><tr><td> Des agents pathogènes </td><td> Niveau turbidité de l&#39;eau (NTU) un </td><td> Montant ensemencée / L b, c, d </td><td> % De récupération ± 1 SD </td><td> Essais Nombre indépendants </td></tr><tr><td> Entérovirus-poliovirus Sabin III </td><td> 0.5 </td><td> 500 </td><td> 81% ± 11 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Entérovirus poliovirus Sabin III </td><td> 0.5 </td><td> 5000 </td><td> 67% ± 12 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Entérovirus-poliovirus Sabin III </td><td> 215 </td><td> 500 </td><td> 59% ± 32 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Entérovirus-poliovirus Sabin III </td><td> 215 </td><td> 5000 </td><td> 38% ± 22 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Entérovirus-poliovirus Sabin III </td><td> 447 </td><td> 500 </td><td> 56% ± 18 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Entérovirus-poliovirus Sabin III </td><td> 447 </td><td> 5000 </td><td> 63% ± 37 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Cryptosporidium parvum </td><td> 0.5 </td><td> 5 </td><td> 38% ± 14 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Cryptosporidium parvum </td><td> 0.5 </td><td> 50 </td><td> 53% ± 19 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Pleurerptosporidium parvum </td><td> 215 </td><td> 5 </td><td> 40% ± 16 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Cryptosporidium parvum </td><td> 215 </td><td> 50 </td><td> 30% ± 6 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Cryptosporidium parvum </td><td> 447 </td><td> 5 </td><td> 33% ± 13 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Cryptosporidium parvum </td><td> 447 </td><td> 50 </td><td> 28% ± 11 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Salmonella enterica </td><td> 0.5 </td><td> 5 </td><td> 29% ± 24 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Salmonella enterica </td><td> 0.5 </td><td> 500 </td><td> 56% ± 16 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Salmonella enterica </td><td> 215 </td><td> 5 </td><td> 32% ± 24 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Salmonella enterica </td&gt; <td> 215 </td><td> 500 </td><td> 34% ± 11 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Salmonella enterica </td><td> 447 </td><td> 5 </td><td> 34% ± 18 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Salmonella enterica </td><td> 447 </td><td> 500 </td><td> 31% ± 24 </td><td> 8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Unité de turbidité néphélométrique </li><li> Les entérovirus énumérés par qPCR que des copies génomiques / L </li><li> C. parvum énumérés par immunofluorescence comme oocystes </li><li> S. enterica énumérés par la culture comme formant des colonies-unités </li></ol> Tableau 1. La concentration de la laine de verre avec des turbidités d&#39;eau variables et des densités de pathogènes. <table border="1"><tbody><tr><td> Des agents pathogènes </td><td> Lieu d&#39;échantillons d&#39;eau </td><td> Montant ensemencée / L, un </td><td> Reco%<html> très </td></tr><tr><td> Grippe aviaire H5N2 </td><td> Sundi lac, Anchorage arrondissement </td><td> 2500 </td><td> 42,9% </td></tr><tr><td> Grippe aviaire H5N2 </td><td> Minto Flats, Fairbanks North Star Borough </td><td> 2500 </td><td> 36,7% </td></tr><tr><td> Grippe aviaire H5N2 </td><td> Portage Valley, Anchorage arrondissement </td><td> 2500 </td><td> 7,8% </td></tr><tr><td> Grippe aviaire H5N2 </td><td> Potter Marsh, Anchorage arrondissement </td><td> 2500 </td><td> 41,5% </td></tr><tr><td> Grippe aviaire H5N2 </td><td> Willow Lake, au Yukon-Koyukuk arrondissement </td><td> 2500 </td><td> 15,5% </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Mesuré par qPCR que des copies génomiques / L </li></ol> Tableau 2. Concentration de laine de verre du virus de la grippe aviaire en utilisant l&#39;eau provenant de cinq sites en Alaska. les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figure 1 &quot;/&gt; Figure 1. Schéma de la rondelle de laine de verre. Cela peut être utilisé à la place d&#39;un seau, un gain de temps de rinçage. Le concept est semblable à une rondelle pipette en verre. <img src="/files/ftp_upload/3930/3930fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. De filtration de laine de verre avec injection d&#39;acide par une pompe péristaltique. Noter la &quot;T&quot; de connecteur lorsque le tuyau de pompe présente acide dans la ligne d&#39;échantillonnage entre le robinet d&#39;eau et d&#39;un filtre en laine de verre. ajustement du pH n&#39;est nécessaire que si l&#39;eau prélevée a un pH&gt; 7,5. Filtres de laine de verre sont efficaces en concentrant les agents pathogènes de l&#39;eau avec un large éventail de niveaux de turbidité et de la densité des agents pathogènes (tableau 1). Pour tester cette hypothèse, 20 litres d&#39;eau du robinet déchlorée a été mélangé avec du limon du sol séché loam (0, 1,27, ou 2,75 g / L) pour atteindre le niveau désiré de la turbidité et ensuite ensemencé avec des agents pathogènes à des densités différentes. L&#39;eaua été adoptée à travers un filtre de laine de verre, les agents pathogènes concentrés dans l&#39;éluat ont été dénombrés, et cette valeur a été le numérateur dans le calcul de récupération pour cent. La quantité d&#39;agents pathogènes dans l&#39;eau ensemencés, qui est, le dénominateur du calcul de récupération pour cent, a été déterminée d&#39;abord par l&#39;ensemencement des agents pathogènes dans un éluat négatif, alors l&#39;énumération des agents pathogènes. L&#39;éluat négative a été préparé par le passage d&#39;un échantillon de 20 litres non ensemencées à travers un filtre et d&#39;élution. Quantifier les agents pathogènes ensemencées dans un éluat négative évite des différences de dénombrement des agents pathogènes qui pourraient résulter de différences matrice créée par le filtre de laine de verre. L&#39;importance de cette étape lors de la quantification des agents pathogènes par PCR en temps réel est discuté dans Lambertini et al. 3. Un échantillon de 20 litres de contrôle négatif a été concentré par filtration de laine de verre afin de déterminer n&#39;y avait pas présente natif agents pathogènes qui pourraient confondre le calcul de récupération pour cent. Un 10 um nominale des pores de taille pré-filtre wtel qu&#39;il est utilisé lorsque le niveau de turbidité était ≥ 215 NTU. Poliovirus a été quantifiée par PCR quantitative en temps réel en utilisant la concentration secondaire et procédures d&#39;extraction des acides nucléiques et des amorces et la sonde décrite dans Lambertini et al. 3. Cryptosporidium parvum a été quantifiée dans le volume de l&#39;échantillon concentré final (FCSV) créée par la procédure de concentration secondaire pour le poliovirus . Les oocystes ont été visualisés par immunofluorescence (MERIFLUOR Cryptosporidium et Giardia Kit de détection, Meridian Life Science, Inc, Cincinnati, OH). Salmonella enterica a été quantifiée dans le FCSV par placage sur une gélose XLD (Remel, Lenexa, KS) et le comptage des colonies de formage unités. Filtres de laine de verre sont efficaces dans la concentration des virus de la grippe aviaire (tableau 2). Faible virus de la grippe aviaire pathogène (H5N2) a été ensemencée dans l&#39;eau à plusieurs endroits en Alaska et dans la récupération pour cent calculé tel que décrit Above. La concentration secondaire et les procédures d&#39;acides nucléiques ont été réalisées comme pour le poliovirus, le virus a été quantifiée par PCR en temps réel en utilisant les amorces et les sondes décrites dans Spackman et al 4.

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Pas de conflits d&#39;intérêts déclarés.

Filtres de laine de verre ont été utilisés par plusieurs équipes de recherche de se concentrer 3,5,6 virus entériques humains à partir d&#39;une variété de sources d&#39;eau comme l&#39;eau potable a terminé en 7, les eaux souterraines 8,9, 10 eaux de surface, eau de mer 11, des eaux usées 12, et ruissellement des terres agricoles 13. Nous rapportons ici les filtres sont également efficaces dans la concentration du virus de la grippe aviaire ai...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif ou d&#39;un élément </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique </td><td> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> </td><td> A144-500 </td></tr><tr><td height="24"> L&#39;hydroxyde de sodium </td><td> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> </td><td> BP359-212 </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Le chlorure de sodium Phosphate de potassium dibasique- Phosphate de potassium monobasique- </td><td> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> </td><td><html> BP358-212 BP363-500 BP362-500 </td></tr><tr><td> L&#39;hypochlorite de sodium à savoir, eau de Javel </td><td> <a href="http://www.clorox.com" target="_blank">Le Co. Clorox</a> </td><td></td></tr><tr><td> Thiosulfate de sodium anhydre </td><td> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> </td><td> S 475-212 </td></tr><tr><td> Extrait de bœuf, desséchée </td><td> <a href="http://www.bd.com" target="_blank">Becton, Dickinson and Company</a> </td><td> 211520 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> </td><td> G46-500 </td></tr><tr><td> La laine de verre sodocalcique huilé Ou R-11 d&#39;isolation en fibre de verre sans revêtement </td><td> <a href="http://www.isover.com" target="_blank">Isover</a> <html> ref = &quot;http://www.jm.com&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Johns Manville </td><td> Bourré 725 QN </td></tr><tr><td> Polypropylène maille </td><td> <a href="http://www.industrialnetting.com" target="_blank">Industrielle de compensation</a> </td><td> xN4510 </td></tr><tr><td> 2 &quot;x4&quot; Sch 80 mamelon tuyau en PVC fileté </td><td> <a href="http://www.grainger.com" target="_blank">Grainger</a> </td><td> 6MW35 </td></tr><tr><td> 2 &quot;PVC SCH 40 bouchon </td><td> <a href="http://www.grainger.com" target="_blank">Grainger</a> </td><td> 5WDW3 </td></tr><tr><td> Homme de montage en nylon adaptateur (1/2 &quot;x1 / 2&quot;) </td><td> <a href="http://www.usplastic.com" target="_blank">Etats-Unis en plastique Corp</a> </td><td> 62178 </td></tr><tr><td> Les bouteilles d&#39;échantillonnage pour éluat-1 litre </td><td> <a href="http://www.fishersci.com" target="_blank">Fisher Scientific</a> </td><td> 03-313-4F </td></tr><tr><td> 60 ml seringue </td><td>&quot;Http://www.fishersci.com&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Fisher Scientific </td><td> NC9661991 </td></tr><tr><td> bandes de pH </td><td> <a href="http://www.whatman.com" target="_blank">Whatman</a> </td><td> 2614 991 </td></tr><tr><td> Préfiltre, polypropylène, 10 pouces cartouche, 10 pm </td><td> McMaster-Carr </td><td> 4411K75 </td></tr><tr><td> Préfiltre de logement </td><td> Cole-Parmer </td><td> S-29820-10 </td></tr></tbody></table>

glass wool filters for concentrating waterborne viruses and agricultural zoonotic pathogens

La première étape clé dans l&#39;évaluation des niveaux d&#39;agents pathogènes dans l&#39;eau contaminée présumée est la concentration. Les méthodes de concentration ont tendance à être spécifique à un groupe particulier pathogène, par exemple aux États-Unis de l&#39;environnement Méthode Agence de protection de 1623 pour Giardia et Cryptosporidium 1, ce qui signifie de multiples méthodes sont nécessaires si le programme d&#39;échantillonnage vise plus d&#39;un groupe pathogène. Un autre inconvénient des méthodes actuelles est l&#39;équipement peut être compliqué et coûteux, par exemple la méthode VIRADEL avec la cartouche du filtre à 1MDS pour concentrer les virus 2. Dans cet article, nous décrivons comment construire des filtres de laine de verre pour la concentration des agents pathogènes d&#39;origine hydrique. Après élution de filtre, le concentré se prête à une étape de concentration seconde, comme la centrifugation, suivie par la détection des pathogènes et le dénombrement par des méthodes culturales ou moléculaire. Les filtres ont plusieurs avantages. La construction est simple et les filtres peuvent être construits à unetaille ny pour satisfaire aux exigences spécifiques d&#39;échantillonnage. Les pièces du filtre sont peu coûteux, permettant de recueillir un grand nombre d&#39;échantillons, sans de graves répercussions sur le budget du projet. Grands volumes d&#39;échantillons (100S à 1000 s L) peut être concentrée en fonction du taux de colmatage de turbidité de l&#39;échantillon. Les filtres sont faciles à transporter et avec un équipement minimal, comme une pompe et d&#39;un débitmètre, ils peuvent être mis en œuvre dans le domaine de l&#39;échantillonnage de l&#39;eau potable traitée, l&#39;eau de surface, eaux souterraines, et le ruissellement agricole. Enfin, la filtration de la laine de verre est efficace pour concentrer une variété de types d&#39;agents pathogènes de sorte qu&#39;un procédé est nécessaire. Nous rapportons ici l&#39;efficacité des filtres à base d&#39;eau en concentrant l&#39;entérovirus humain, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, et le virus de la grippe aviaire.

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Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Filtres de laine de verre ont été utilisés pour concentrer les virus d&#39;origine hydrique par un certain nombre de groupes de recherche à travers le monde. Ici, nous montrons une approche simple pour la construction de filtres de laine de verre et de démontrer les filtres sont également efficaces dans la concentration d&#39;origine hydrique, les bactéries pathogènes viraux et protozoaires.

Filtres laine de verre pour concentration des virus d&#39;origine hydrique et agricole des agents pathogènes zoonotiques

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K vues.  United States Geological Survey. Filtres de laine de verre ont été utilisés pour concentrer les virus d'origine hydrique par un certain nombre de groupes de recherche à travers le monde. Ici, nous montrons une approche simple pour la construction de filtres de laine de verre et de démontrer les filtres sont également efficaces dans la concentration d'origine hydrique, les bactéries pathogènes viraux et protozoaires.

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Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Méthodes de transfert rapide et la localisation des agents pathogènes dans l&#39;intestin de Lyme Tick

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Recherche

Immunologie et infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La salive, les glandes salivaires, et Collection hémolymphe de tiques Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Fabrication de Surfaces de verre de qualité optique pour étudier la Fusion des macrophages

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...