Ces études ont été financées, en partie, par le Fonds des enfants Hospital de Boston urologie du revenu du Fonds de dotation et les National Institutes of Health des subventions NIBIB P41-EB002520 (Kaplan); NIDDK T32-DK60442 (Freeman); NIDDK 1K99-DK083616 (Mauney). Nous reconnaissons le Dr Peter Zvara de l&#39;Université du Vermont à l&#39;aide dans l&#39;établissement de la technique de placement de la sonde de cystostomie et la cystométrie.

<ol>
	<li>Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+for+bladder+substitution.">Tissue engineering for bladder substitution.</a> World. J. Urol. 18, 364-370 (2000).</li><li>Roehrborn, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+lower+urinary+tract+symptoms+(LUTS)+and+benign+prostatic+hyperplasia+(BPH).">Male lower urinary tract symptoms (LUTS) and benign prostatic hyperplasia (BPH).</a> Med. Clin. North Am. 95, 87-100 (2011).</li><li>Niknejad, K. G., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+augmentation+techniques+in+women.">Bladder augmentation techniques in women.</a> Int. Urogynecol. J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystometric+methods+in+female+rats.">Comparison of cystometric methods in female rats.</a> Neurourol. Urodyn. 27, 324-329 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Évaluations cystométriques de configurations qui suivent l&#39;implantation de biomatériaux et de l&#39;augmentation de la vessie chez des modèles animaux de petite taille représente une étape de validation important dans l&#39;identification optimales caractéristiques structurelles et mécaniques de conceptions de la matrice pour une utilisation dans des situations cliniques. Dans cette étude, nous décrivons les méthodes chirurgicales pour effectuer augmentation de la vessie chez la souris et les rats ainsi que des techniques pour déterminer les propriétés cystométriques urodynamiques des organes d&#39;ingénierie pour des évaluations fonctionnelles. Nous avons utilisé ces techniques dans de multiples expériences impliquant à la fois chez la souris et les rats, avec chaque expérience composée de 30 rongeurs + sans problèmes importants. Notre laboratoire de recherche est un conglomérat diversifié de spécialistes des sciences fondamentales et des chirurgiens de médecins, chirurgiens et avec au moins 5-6 ans d&#39;études post-universitaires de formation chirurgicale pratiquée sur les aspects procéduraux de ces expériences. Quel que soit le type de biomatériau utilisé, la principale différence entre augmentant la vessie chez le rat par rapport souris est la taille de la vessie. En raison de plus petite taille de la vessie, la dissection et l&#39;incorporation du biomatériau est techniquement plus difficile chez la souris. Pour aider à la visualisation, d&#39;un microscope chirurgical peut être utilisé. Comme la taille de la vessie chez les rats est plus grande, il se prête davantage à des situations où plus d&#39;une procédure doit être effectuée sur la vessie (par exemple l&#39;augmentation et le placement d&#39;un cathéter cystostomie). En outre, le protocole décrit ci-dessus l&#39;utilisation de PE-50 tubes pour le rat 13, cependant, les cathéters de taille encore plus grandes, jusqu&#39;à PE-100 ont été utilisés, en particulier pour les études à long terme 14. Chez la souris, un calibre plus petit tel que le PE-10 tube peut être utilisé 15,16, mais il faut garder à l&#39;esprit que les tubes souples plus petits et plus ne peut pas transmettre les changements de pression au transducteur avec précision. En outre, la méthode alternative d&#39;assurer le cathéter sur le dos (étape 8 ci-dessus *) se fait en mien raison de leur petite taille corporelle et l&#39;aiguille pointe émoussée et une casquette IV CE sont trop lourdes. L&#39;inconvénient de cette est la nécessité d&#39;une anesthésie pour extraire le bout du cathéter dans la poche sous-cutanée avant la cystomanométrie. Des études ont montré que dans les premiers jours (0-4 jours premiers) après le placement des cathéters, la cystomanométrie révèle pressions vésicales élevées et avec des volumes mictionnels hyperactivité faible. Ces résultats ont semblé se stabiliser autour de la sixième à la septième jour 14,17 et donc, est probablement le moment idéal pour l&#39;évaluation cystomanométrique. Cependant, la plupart des rapports dans la littérature effectuer cystométrie dans les 3 premiers jours de cathétérisme de 18 ans, ce qui explique la grande variation dans les paramètres ci-dessus par rapport au temps. En quittant le cathéter sus-pubien pour une durée supérieure à 3 jours comporte morbidités telles que le risque de calculs, le délogement, une infection, une hématurie et l&#39;occlusion du cathéter avec des débris. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; taux de perfusion différents au cours de la cystomanométrie ont été décrits à partir 1-3mL/hr pour les souris et 15,16 pour les rats 10-11mL/hr 13,19,20. Les vitesses de perfusion supraphysiologiques peuvent causer des pressions faussement élevés 14. Nous utilisons un débit de perfusion de 12,5 pi / min (0,75 mL / h) pour les souris et 100 pi / min (6 ml / h) pour les rats dans notre configuration, mais la baisse des taux peut également être utilisé. La température de la solution saline physiologique doit être la température ambiante au moins, bien au chaud (37 °) une solution saline est plus optimale afin d&#39;éviter hyperactivité de la vessie provoquée par inculquer solution froide. En cystomanométrie éveillé, il est crucial pour permettre la stabilisation de la structure miction que l&#39;animal devient ajusté à la cage, ce qui dans notre expérience nécessite une période de ~ 10-20 minutes. Suite à cela, les cycles de la miction régulières peuvent être enregistrés pour 45-120 minutes ou au minimum de cycles mictionnels 3-4. L&#39;animal doit être observée en temps réel car l&#39;animal est librement moving et des complications telles que torsion ou un vrillage du cathéter peut altérer l&#39;analyse cystomanométrique. Limiter le bruit de l&#39;environnement au cours de la cystomanométrie est souhaitée pour diminuer les déplacements des animaux et des objets suivants. Cystomanométrie Inconscient n&#39;a pas les problèmes qui en découlent comme la cystomanométrie éveillé, mais anesthésiques multiples ont été montré pour empêcher les contractions vésicales spontanées. Cette inhibition correspond directement à la durée prévue de l&#39;action des anesthésiques, c&#39;est à dire lorsque les subventions effet anesthésiant, contractions spontanées reprendre 14. En outre, les pressions mesurées lorsque la vessie débordait, étaient statistiquement plus grande chez les rats anesthésiés, à la fois vivant et post mortem, ce qui indique un effet sur les propriétés de mise en conformité passive de la paroi de la vessie. Cet effet est observé avec 21 pentobarbital, kétamine, et chloralose GI / IP, en plus de l&#39;halothane inhalé et intrathécale nesacaine 14. Une étude plus approfondie des différents anesthésiques confirmationm cette constatation avec la suppression du réflexe mictionnel pour les anesthésiques par inhalation à la fois (isoflurane et le méthoxyflurane) et des barbituriques (pentobarbital et thiobutabarbital) sous anesthésie niveaux modérés 17. Cet effet a été observé avec des niveaux encore plus de lumière ou un sédatif de l&#39;anesthésie avec des médicaments tels que le fentanyl-dropéridol et la kétamine-diazépam, et comme dans l&#39;étude précédente, que l&#39;effet de l&#39;anesthésie calmée, et nous n&#39;avons donc l&#39;inhibition 17. Pour cette procédure, uréthane injections intrapéritonéales peuvent être utilisés, car il a été démontré que la miction réflexe est préservée tout en permettant également une anesthésie adéquate 17,22. Par ailleurs, aucun effet n&#39;est observé à l&#39;égard de pressions miction 23. Placement cathéter sus-pubien pour cystomanométrie est décrit ici, puisque le cathétérisme intra-urétrale a été démontré que plus les courbes de pression de la vessie et des débits plus faibles compatibles avec une obstruction de la vessie de sortie par rapport 24.En outre, le cathétérisme intra-urétrale n&#39;est possible que chez les animaux anesthésiés, et même alors, le cathétérisme peut être difficile, en particulier chez les rongeurs mâles et les souris. En conclusion, le choix de modèle à utiliser pour l&#39;augmentation de la vessie et / ou l&#39;analyse cystomanométrique dépend des objectifs de l&#39;étude spécifique. Du point de vue technique, le modèle de rat détient clairement l&#39;avantage pour les raisons évoquées ci-dessus. Cependant, le modèle de la souris peut être utilisée dans les études évaluant le rôle des gènes spécifiques des produits finis-codées dans les maladies des voies urinaires, en raison de leur sensibilité pour la manipulation génétique. Ce n&#39;est généralement pas possible chez le rat. Réveillez-vous le plus fidèlement cystométrie imite l&#39;état physiologique normal dans lequel ces animaux subissent leurs cycles de miction, et donc, est susceptible de donner une détermination plus fiable physiologique de la fonction vésicale. En outre, la variable de confusion des effets directs d&#39;unenesthetics sur la fonction vésicale est évité.

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériaux: </td><td> Description / utilisation: </td></tr><tr><td> Cisailles à raser </td><td> Préparation de rat / souris pour la chirurgie </td></tr><tr><td> Draps stériles, bétadine, l&#39;éthanol 70%, de la gaze stérile </td><td> Préparation de champ chirurgical stérile </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Instruments: </td></tr><tr><td> Lame de bistouri </td><td> Incision de la peau </td></tr><tr><td> pince à dents </td><td> Manipulation peau </td></tr><tr><td> Pinces fines </td><td> Atraumatique (pas de dents), pas de stries ou avec stries fines pour manipuler </td></tr><tr><td> Pilote petite aiguille </td><td> La dissection des tissus de Sharp </td></tr><tr><td> Ciseaux de Metzenbaum </td><td> Incision Bldder </td></tr><tr><td> Ciseaux ténotomie </td><td> Pour les sutures de rétraction et d&#39;élaborer des sous-cutanée tunnel (cathéter cystostomie) </td></tr><tr><td> Les petites pinces courbes </td><td> Tunnel sous-cutané (cathéter cystostomie) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Sutures: </td></tr><tr><td> 6-0 points de suture en polypropylène </td><td> Sutures séjour de la vessie et de suture pursestring </td></tr><tr><td> 7-0 suture polyglactine </td><td> Anastomose de l&#39;échafaudage de la vessie </td></tr><tr><td> Suture polyglactine 4-0 </td><td> Fermeture du muscle / peau </td></tr><tr><td> 3-0 ou 4-0 de suture en soie </td><td> Extrémité du cathéter à la peau Sécurisation </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Les aiguilles et les seringues: </td></tr><tr><td> Aiguille 18 Gauge </td><td> Perçant la vessie pour cathéter cystostomie </td></tr><tr><td> 25 et 30 aiguilles de calibre </td><td> Test de la vessie pour les fuites </td></tr><tr><td> 1 ml solution saline fseringue illed </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 22 pointe émoussée Gauge </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cathéter cystostomie: </td></tr><tr><td> PE-50 tube </td><td></td></tr><tr><td> Briquet </td><td> Le torchage PE-50 tube </td></tr><tr><td> Petit clamp courbe </td><td> Développer tunnel sous-cutané </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cystométrie: </td></tr><tr><td> MLT844 ADInstruments la saisie des données et des logiciels LabChart </td><td> La pression d&#39;acquisition de données </td></tr><tr><td> Pompe Harvard seringue 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) </td><td> Pompe de perfusion de solution </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Anesthésiques (cystométrie Inconscient): </td></tr><tr><td> Jesoflurane </td><td> Induction / entretien de l&#39;anesthésie générale </td></tr><tr><td> Uréthane </td><td> Cystomanométrie Unconconscious </td></tr><tr><td> Bupivicaïne ou l&#39;équivalent </td><td> L&#39;anesthésie locale </td></tr><tr><td> Le méloxicam </td><td> Analgésie post-opératoire </td></tr><tr><td> La buprénorphine </td><td> Analgésie post-opératoire </td></tr></tbody></table>

evaluation of biomaterials for bladder augmentation using cystometric analyses in various rodent models

La fonction rénale et de la continence de l&#39;urine dépendent de façon cruciale au bon fonctionnement de la vessie, qui stocke l&#39;urine à basse pression et il expulse avec une précision orchestré contraction. Un certain nombre de anomalies congénitales et acquises, y compris urologiques valves urétrales postérieures, l&#39;hyperplasie bénigne de la prostate et vessie neurogène secondaire au spina-bifida / lésion de la moelle épinière peut entraîner dans le remodelage tissulaire pathologique conduisant à la conformité avec facultés affaiblies et la capacité réduite 1. Obstruction fonctionnelle ou anatomique des voies urinaires est fréquemment associée à ces conditions, et peut conduire à l&#39;incontinence urinaire et des lésions rénales à partir de stockage accrue et des pressions mictionnelles 2. L&#39;implantation chirurgicale de segments gastro-intestinaux pour accroître la capacité d&#39;organes et de réduire les pressions intra-vésicales représente l&#39;option de traitement chirurgical primaire de ces troubles lorsque la direction médicale échoue 3. Cependant, cette approche est d&#39;entravered par la limitation de tissus de donneurs disponibles, et est associée à des complications importantes, y compris l&#39;infection des voies urinaires chroniques, perturbation métabolique, la formation de calculs urinaires, et la malignité secondaire 4,5. Les recherches actuelles en ingénierie tissulaire de la vessie est fortement axée sur l&#39;identification des configurations de biomatériaux qui peuvent soutenir la régénération des tissus à des sites de défauts. Conventionnel 3-D échafaudages dérivés de polymères naturels et synthétiques tels que la sous-muqueuse intestinale petites et poly-acide glycolique ont montré un certain succès à court terme pour soutenir la régénération musculaire urothélial et lisse ainsi que favoriser l&#39;accroissement de la capacité de stockage d&#39;organes dans des modèles animaux les deux et dans le clinique 6,7. Cependant, des lacunes dans échafaud intégrité mécanique et de la biocompatibilité se traduisent souvent par de la fibrose délétère 8, contracture du greffon 9, et la calcification 10, augmentant ainsi le risque d&#39;échec des implants et la nécessité for secondaires des interventions chirurgicales. En outre, la restauration des caractéristiques mictionnels normales en utilisant les constructions standards des biomatériaux pour cystoplastie d&#39;agrandissement doit encore être réalisé, et donc la recherche et le développement de matrices de nouvelles qui peuvent remplir ce rôle est nécessaire. Afin de réussir à développer et évaluer les biomatériaux optimales pour l&#39;augmentation de la vessie clinique, recherche sur l&#39;efficacité doit être effectué d&#39;abord dans des modèles animaux standardisés en utilisant des méthodes chirurgicales détaillées et des évaluations sur les résultats fonctionnels. Nous avons précédemment rapporté l&#39;utilisation d&#39;un modèle chez la souris augmentation de la vessie afin de déterminer le potentiel de fibroïne de soie à base d&#39;échafaudages à la médiation et la régénération des tissus caractéristiques mictionnels fonctionnels. 11,12 analyses cystométriques de ce modèle ont montré que les variations dans les propriétés structurales et mécaniques des implants peuvent influer sur les caractéristiques résultant urodynamiques des vessies de l&#39;ingénierie tissulaire 11,12. Corrélation positivetions entre le degré de régénération des tissus matrice à médiation déterminée histologiquement et la conformité fonctionnelle et la capacité ont été évaluées par cystométrie montré dans ce modèle 11,12. Ces résultats suggèrent donc que les évaluations fonctionnelles de configurations de biomatériaux dans les systèmes de rongeurs de la vessie d&#39;augmentation peut être un format utile pour évaluer les propriétés d&#39;échafaudage et d&#39;établir la faisabilité de vivo avant les études de grands animaux et de déploiement clinique. Dans l&#39;étude actuelle, nous présenterons différentes étapes chirurgicales de l&#39;augmentation de la vessie chez les souris et les rats en utilisant des échafaudages de soie et de démontrer les techniques de cystométrie éveillé et anesthésié.

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Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Les étapes chirurgicales de l&#39;augmentation de la vessie sont décrits en utilisant 3-D échafaudages dans des modèles murins et de rat. Pour tester l&#39;efficacité de configurations de biomatériaux pour l &#39;augmentation de la vessie, les techniques de cystométrie à la fois éveillé et anesthésié sont présentés.

Évaluation des biomatériaux pour l&#39;augmentation de la vessie à l&#39;aide des analyses cystométriques dans des modèles rongeurs Divers

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

evaluation-biomaterials-for-bladder-augmentation-using-cystometric

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.1K vues.  Harvard Medical School. Les étapes chirurgicales de l'augmentation de la vessie sont décrits en utilisant 3-D échafaudages dans des modèles murins et de rat. Pour tester l'efficacité de configurations de biomatériaux pour l 'augmentation de la vessie, les techniques de cystométrie à la fois éveillé et anesthésié sont présentés.

Vidéo: Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

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Bio-ingénierie

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthèse des Nanotubes de carbone Multi modifiés avec des nanoparticules d’argent et de l’évaluation de leurs activités antibactériennes et propriétés cytotoxiques

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Évaluation des comportements photosynthétiques par des mesures simultanées de la réflectance des feuilles et des analyses de fluorescence de la chlorophylle

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

Modèle calvarial de l'augmentation osseuse dans le lapin pour l'évaluation de la croissance osseuse et la néovascularisation dans les matériaux de substitution osseuse

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par CHO à l’aide d’un séparateur acoustique

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...