Les auteurs tiennent à remercier Chiyoko Kobayashi et Kiyokazu Agata pour obtenir des conseils utiles sur la transplantation planaire ainsi que les membres passés et présents du laboratoire Sánchez pour les discussions précieuses lors de l&#39;élaboration de ces techniques. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant formation (5T32 HD0791) à BCG et les NIH R37GM057260 à l&#39;AAS. ASA est un Howard Hughes Medical Institute.

Remarque: ce protocole suggère l&#39;utilisation de matières potentiellement dangereuses (plomb et chloretone). Acquérir, lire et suivre les fiches signalétiques pour tous les matériaux potentiellement dangereux. 1. Culture animale, de sélection et de préparation <ol><li> Pour la culture des animaux et de l&#39;eau planaire manipulation utilisation (1X sels Montjuïc 9) et pipettes de transfert en plastique. </li><li> Sexuelle biotype Schmidtea mediterranea peut être utilisée lorsque soulevée dans le laboratoire dans des conditions normales de culture 10. Pour produire des spécimens asexuées de taille requise, S. mediterranea soulevé à la température ambiante dans des conditions normales 9 devrait être alimenté au double au triple fréquence normale (2-3 fois par semaine) pour un à deux mois avant de les utiliser. Alternativement, les animaux nourris asexuées à une fréquence normale peut être maintenue à 10 degrés Celsius indéfiniment afin d&#39;augmenter leur taille moyenne. </li><li> Sélectionnez les animaux qui sont entre 1 à 2 cm delongueur et plus large que 2 mm, puis mourir de faim les animaux 3-7 jours avant de les utiliser. </li><li> Si vous effectuez des traitements pharmacologiques ou radiologique sur les hôtes, les donateurs, destinés ou des animaux partiellement irradiés, effectuer un traitement (s) à ce stade. </li><li> Si les traitements pharmacologiques ont été réalisées que nécessaire pour nourrir les animaux, mourir de faim les animaux environ 3 à 7 jours supplémentaires avant de les utiliser. </li></ol> 2. Préparation des solutions et des matériaux <ol><li> Préparer la solution de chloretone, une légère anesthésique local, en dissolvant 0,1-0,2% p / v chloretone dans l&#39;eau planaire et le refroidissement de la solution sur la glace. </li><li> Si vous effectuez une irradiation partielle seulement, passez à l&#39;étape 2.7. Pour la greffe de tissus passez à l&#39;étape 2.3. </li><li> Utilisation d&#39;un bec Bunsen, pliez 0,75 mm de diamètre intérieur, utilisé pour couper le tissu greffé, et 0,7 mm de diamètre extérieur, utilisé pour créer un trou dans l&#39;hôte, qui recevra le greffon, tubes capillaires à un angle de 90 ° à 1-2 cm de la fin de bistube de ch. Pour économiser des matières, plier les deux extrémités de chaque tube capillaire et les couper en deux pour produire deux outils. Veillez à ne pas flamber les confins des tubes. </li><li> Couper les documents suivants aux dimensions indiquées: <ul><li> Noir filtre en papier (coupé en rectangles d&#39;environ 2,5 cm. X 1,5 cm) </li><li> Whatman n ° 3 papier filtre (coupé en rectangles d&#39;environ 2 cm. X 0,5 cm) </li><li> Kimwipe (plié et découpé en liasses environ. 3 cm x 0,5 cm x 4 plis) </li><li> Papier à rouler les cigarettes (retirer la bande de gomme et les couper en rectangles d&#39;environ 3 cm. X 2 cm) </li></ul></li><li> Préparer une solution modifiée Holtfreter de (3,5 g / L de NaCl, 0,2 g / L de NaHCO 3, 0,05 g / L de KCl, 0,2 g / L MgSO 4, 0,1 g / L CaCl 2, pH 7,0-7,5) et de la caséine une solution saturée de Holtfreter et froid à la fois à 4 ° C. </li><li> Joindre une Kimwipe plié à un carré de parafilm et placer sur la plaque refroidisseur Peltier ou autre dispositif de refroidissement situé sous un microscope à dissection. Saturer le Kimwipe avec Holtf réfrigérésreter la solution et le lieu noir deux rectangles de papier filtre sur la Kimwipe. </li><li> Ligne des boîtes de Pétri avec Whatman n ° 2 du papier filtre. Humidifier le papier filtre avec une solution Holtfreter et refroidir les plats sur la glace. Pour l&#39;irradiation partielle une parabole plus grande et de la doublure de papier filtre peut être utilisé. </li></ol> 3. Anesthésie et d&#39;immobilisation <ol><li> Remplissez une boîte de Pétri avec une solution chloretone réfrigérés et les vers de la pipette dans le plat. Pour la transplantation que anesthésier un hôte et un donneur à la fois. Pour l&#39;irradiation partielle de nombreux (n&gt; 10) les animaux peuvent être anesthésié à la fois. </li><li> Laissez les vers à tremper dans la solution chloretone jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent immobiles (5-10 min). </li><li> Rincer les vers en les pipettant dans un plat rempli d&#39;une solution Holtfreter réfrigérés de. </li><li> Immobiliser les animaux en les pipetage sur du papier filtre noir saturé avec une solution Holtfreter réfrigérés et les orienter face ventrale vers le bas avec une pince. Si les animaux sont capables de locomote, imprégnez-vous une solution Holtfreter excès, légèrement diminuer la température de votre Peltier ou assiette froide, ou d&#39;augmenter la durée du traitement chloretone. </li></ol> 4. L&#39;irradiation partielle Remarque: Suivez ces étapes pour préparer les animaux pour l&#39;irradiation partielle. Si vous effectuez la transplantation au lieu, passez à la section 5. <ol><li> Placez un plat réfrigéré Petri de l&#39;étape 2.7 sur la glace dans un seau à glace qui s&#39;adapte à l&#39;intérieur d&#39;une source de rayons X supérieure irradiateur. </li><li> Disposer les animaux anesthésiés dans une boîte de Pétri en déplaçant le papier filtre noir sur lequel ils sont immobilisés. En utilisant des pinces à se déplacer vers anesthésiés directement peuvent les blesser. </li><li> Le transport d&#39;animaux agencée à un haut-source de rayons X et irradiateur situés le bac à glace de telle sorte que la distance entre le tube à cathode à des animaux est minimisée, afin de maximiser le débit de dose efficace. </li><li> Plomb position de l&#39;écran (s) (figure 1) entre les animaux et la cathode tube comme vous le souhaitez. Boucliers doit être de 4,5 à 6 mm d&#39;épaisseur pour permettre une atténuation de 97 à 99% d&#39;un 325kV faisceau de rayons X 11. </li><li> Délivrer la dose de rayons X. Si complète d&#39;ablation de cellules souches de non-blindés régions est désiré, livrer 30 Gy ou plus en utilisant un irradiateur de rayons X. Pour référence, 30 Gy équivaut à 3,6 minutes à 320 kilovolts et 10 milliampères dans une précision X-Ray Inc XRAD320 avec une distance du champ à la source de 30 centimètres. </li><li> Immédiatement après l&#39;administration est complet, la manipulation des vers par le papier filtre noir, les animaux de transfert dans l&#39;eau glacée planaire. Laisser l&#39;eau planaire se réchauffer à température ambiante et les animaux à se déloger du papier filtre noir. La procédure d&#39;irradiation partielle est maintenant terminée. </li></ol> 5. La transplantation de tissus <ol><li> En utilisant une pipette de transfert et de forceps, organiser hôte anesthésié et les vers des donateurs sur les rectangles de papier séparées filtre noir sur le Kimwipe qui a été refroidi sur le Peltiplaque er ou refroidisseur sous la loupe binoculaire. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un tube de 0,75 mm de diamètre interne du capillaire découper la fiche du greffon du donneur et, en utilisant une pince, placez-le sur une sur la partie moyen de l&#39;hôte. Si un matériau de greffe se coince dans le tube capillaire, de déloger avec des pinces. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un tube de 0,7 mm de diamètre extérieur capillaire retirer une fiche de l&#39;hôte et l&#39;utilisation de la position des pinces du greffon dans le trou qui est laissé derrière. </li><li> Transfert de l&#39;hôte transplanté sur son rectangle de papier noir filtre dans la boîte de Pétri préparée à l&#39;étape 2.7. </li><li> Mouillez un morceau de papier à rouler avec une solution saturée de caséine Holtfreter et placez-le sur le dessus de l&#39;hôte transplanté comme schématisé à la figure 2A. </li><li> Faire tremper quatre morceaux de papier filtre dans la caséine solution saturée Holtfreter et envelopper l&#39;hôte transplanté comme schématisé dans la figure 2B. </li><li> Faire tremper quatre liasses de Kimwipe coupe dans la caséine solution saturée Holtfreter et les étendre surle papier filtre provenant de l&#39;étape 5.6 (figure 2B). Replacez le couvercle et mettre la boîte de Pétri sur la glace. </li><li> Transfert le ver planaire des bailleurs de fonds dans l&#39;eau pour récupérer, guérir et se régénérer. </li><li> Lorsque toutes les greffes sont terminées, placez les vers transplantés dans un incubateur à 10 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain matin, en prenant soin de ne pas perturber la greffe, de découvrir le ver et le transférer (sur son papier filtre noir) à une boîte de Pétri remplie d&#39;eau planaire. </li><li> Soit permettre au ver de se dégager du papier filtre ou retirez-le délicatement avec une pince. </li><li> Changez l&#39;eau une fois tous les planaire 2-3 jours. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Immédiatement après l&#39;irradiation partielle planaire apparaît normale et naturelle. En fonction de la dose délivrée et la géométrie du bouclier utilisé, tissu irradié peut régresser et même désintégrer 7. Tissus blindé doit rester intacte. Follla régression du tissu en raison, et une perte de l&#39;intégrité des tissus, un blastème se former et les structures manquantes seront régénérés (figure 3A). Si une amputation est faite dans la région partiellement irradié, le tissu irradié sera sauvé (c.-à-empêché de régression ou de désagrégation) (figure 3B). Dans les deux indemne et la régénération cas amputée sera retardée par rapport à une amputation non-irradié planaria (figure 3C). Si une dose de rayons X de 30 Gy a été délivrée et l&#39;animal partiellement irradié n&#39;a pas été blessé, l&#39;ablation réussie de cellules souches dans un motif correspondant avec le bouclier de plomb utilisé peut être confirmée de 2 à 3 jours après l&#39;irradiation partielle par hybridation in situ pour la cellule souche marqueur Smed-piwi-1 12 (aka smedwi-1) (figure 4). Le matin, après une transplantation, une greffe réussie du tissu transplanté doit être évidentes wans le tissu de l&#39;hôte, ayant adhéré à la fois les surfaces dorsale et ventrale de l&#39;hôte (figure 5A). Parfois, la greffe se conformera à la seule surface ventrale ou dorsale. Si la transplantation a été un échec total, aucun signe de la greffe sera visible à partir soit de la surface dorsale ou ventrale de l&#39;hôte (figure 5B). Peu de temps après une greffe réussie de tissu non irradié dans un hôte qui avait été une ablation des cellules souches par une irradiation létale 13,14, hybridation in situ pour Smed-piwi-1 révèle que les cellules souches sont présentes essentiellement dans le greffon (figure 5C ). En outre, greffes réussies de tissus non irradiés dans des hôtes irradiées de façon létale se traduira par le sauvetage des tissus de l&#39;hôte et à long terme la survie de l&#39;hôte 15. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> Figure 1. Disposition générale de la composante de bases pour une irradiation partielle. Dans un irradiateur de rayons X avec une partie supérieure positionnée source de rayons X (tube cathodique) du planaire anesthésié est positionné directement au-dessous de la source de rayons X dans le champ d&#39;irradiation. Afin de maximiser le débit de dose de rayons X, la distance entre le planaire et la source de rayons X doit être minimisée. Un blindage de plomb doit être placé entre le tube cathodique et le ver anesthésié, au plus près du ver comme pratique. Le blindage de plomb doit être conçu, fabriqué et placé de telle sorte qu&#39;il protège le tissu désiré, mais expose complètement le reste du ver. De nombreux fabricants commerciale produira boucliers de plomb personnalisés à partir de votre schéma de conception simple, nous l&#39;avons utilisé avec succès des systèmes Alpha Corp (Bluffdale, UT). Le fil doit être suffisamment épais pour permettre la quantité désirée de blindage. Par exemple, si près de blindage complet d&#39;une 320 kV faisceau de rayons X est souhaité, le chef de file devrait être de 4,5 à 6 mm d&#39;épaisseur. La planaire et le bouclier sont positionnés surtremper une Holtfreter de papier filtre bordée boîte de Pétri qui repose dans un seau à glace. Étant donné un champ d&#39;irradiation suffisamment grand de rayons X et un certain nombre de boucliers de plomb identiques, de nombreux spécimens peuvent être partiellement irradié à un moment (non illustré). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> Figure 2. Construction de la chambre de récupération. (A) Une vue éclatée de la chambre de récupération greffes de tissus, montrant tous les composants qui sont posés sur le dessus les uns des autres après avoir été trempé dans une solution saturée de la caséine du Holtfreter. (B) une chambre de récupération presque terminé, illustrant le placement de l&#39;emboîtement Whatman n ° 3 rectangles de papier filtre qui enferment l&#39;serré planaire anesthésié, pour empêcher tout mouvement lors de la cicatrisation. La construction minutieuse de la chambre de récupération empêche les mouvements des animaux et à la dessiccation, la promotion de la guérison rapide et une plus grande efficacité de la transplantation de tissus. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> Figure 3. Résultats représentatifs de simples irradiation partielle postérieure. Comme Dubois décrits 7, (A) lorsque la moitié postérieure de planaires ont été protégés avec le plomb et ensuite exposée aux rayons X d&#39;irradiation du tissu antérieure a été observée à régresser à la frontière entre le irradié et blindé tissus au cours de laquelle blastèmes points non pigmentées formé et les animaux ont commencé à se régénérer. (B) D&#39;autre part, lorsque les animaux ont été décapités à la suite de l&#39;irradiation partielle effectuée dans la même (A), la régression du tissu n&#39;a pas été observée et le reste du tissu irradié antérieure a été sauvé. Le décapité animaux partiellement irradiés têtes régénérées (B), cependant, la régénération a été considérablement retardée par rapport à non irradiées contrôles décapités (C). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> Figure 4. Représentant outcome de l&#39;ablation partielle de cellules souches après irradiation partielle. Tout montage hybridation in situ (WISH) pour le marqueur de cellules souches Smed-piwi-1 révèle que la planaire de type sauvage ont des cellules souches distribuées tout au long de leur corps à l&#39;exception du tissu antérieure à la photorécepteurs (tête de flèche) et le pharynx bon (astérisque) 14. (A) WISH pour Smed-piwi-1 dans le contrôle irradié, mais entièrement blindé planaria fixé trois jours qui suivent l&#39;irradiation montre une distribution de cellules souches qui est indiscernable de celle des planaires de type sauvage. (B) D&#39;autre part, souhaitent pour Smed-piwi-1 chez les animaux qui n&#39;ont été que partiellement blindés, laissant le exposées antérieure et postérieure, mais ont également fixé les trois jours suivant montre l&#39;irradiation que les cellules souches sont une ablation des régions non-blindés . Barres d&#39;échelle sont de 500 microns. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> Figure 5. Examples de la transplantation de tissus réussite et d&#39;échec. (A) Les images en direct de vues dorsale et ventrale d&#39;une planaire transplantés avec succès trois jours après la transplantation. Le greffon (indiqué) est clairement visible sur les deux faces dorsales et ventrales et est entouré de tissus non pigmentée caractéristique à l&#39;interface du greffon hôte. (B) En conséquence, les transplantations infructueuses ne présentent pas de greffe de tissu visible sur le site de transplantation (indiqué) et de plutôt montrer une cicatrisées, non pigmentée, la plaie latérale de la transplantation a échoué. Une greffe qui adhère seulement à la dorsale ou la surface ventrale de ressembler à une transplantation réussie (A) lorsqu&#39;elle est vue à partir d&#39;un côté et une transplantation d&#39;échec (B) lorsqu&#39;elle est vue à partir de l&#39;autre. (C) Lorsque de type sauvage (wt) de tissu est greffé dans un hôte irradié qui a été une ablation de cellules souches résidentes et les cellules souches transplantées sont révélé plus tard par la volonté de Smed-piwi-1 deux jours après la transplantation,le succès de la transplantation est clairement affiché par la présence spécifique des cellules souches que dans ou autour de l&#39;emplacement du greffon (pointes de flèches). Barres d&#39;échelle sont de 500 microns.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Importance de l&#39;immobilisation Immobilisation est de loin l&#39;étape la plus critique pour la réussite de chacun de ces processus. Si planaria sont mal immobilisé avant l&#39;irradiation partielle, ils peuvent se déplacer sous le blindage de plomb, produisant des résultats incohérents et la confusion. En outre, si les animaux ne sont pas suffisamment immobilisé après la transplantation, le ver hôte sera probablement s&#39;éloigner de la greffe de tissu, résultant en un échec de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Transfert général But pipette </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Tubes capillaires (ID 0,75 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Tubes capillaires (OD 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Noir de papier filtre </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman n ° 2 filtre en papier 1002-055 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810B </td></tr><tr><td> Whatman n ° 3 papier filtre 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Papier à rouler les cigarettes </td><td> Zig-Zag, d&#39;origine </td><td> NA </td></tr><tr><td> Petrivaisselle </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> Pince DUMONT, INOX n ° 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloretone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Caséine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Le plomb Shields </td><td> Alpha Systems Corp, Bluffdale, UT </td><td> Conception sur mesure </td></tr><tr><td> XRAD-320 irradiateur biologique </td><td> Précision X-Ray, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

La planaire, un ver plat d&#39;eau douce, s&#39;est révélée être un puissant système pour disséquer la régénération des métazoaires et 1,2 biologie des cellules souches. La régénération des tissus planaire de toute manquants ou endommagés est rendu possible par les cellules souches adultes appelé néoblastes 3. Bien que ces cellules souches ont été définitivement démontré d&#39;être pluripotentes et singulièrement capable de reconstituer un animal entier 4, l&#39;hétérogénéité au sein de la population de cellules souches et de la dynamique de leurs comportements cellulaires restent largement non résolues. En raison du grand nombre et une large diffusion des cellules souches dans le plan du corps planaire, des méthodes avancées de manipulation de sous-populations de cellules souches pour l&#39;étude moléculaire et fonctionnelle in vivo sont nécessaires. La transplantation de tissus et de l&#39;irradiation partielle sont deux méthodes par lesquelles une sous-population de cellules souches planaires peuvent être isolés pour une étude plus approfondie. Chaque technique présente des avantages distincts. Tla transplantation question permet de l&#39;introduction de cellules souches, dans un hôte naïf, qui sont soit intrinsèquement génétiquement distincte ou qui ont été préalablement traités pharmacologiquement. En variante, l&#39;irradiation partielle permet l&#39;isolement de cellules souches dans un hôte, juxtaposés à un tissu dépourvu de cellules souches, sans l&#39;introduction d&#39;une plaie ou d&#39;une culasse en intégrité des tissus. L&#39;utilisation de ces deux méthodes, on peut étudier les facteurs cellulaires autonomes et non autonomes que les fonctions de contrôle sur les cellules souches, comme la prolifération, la différenciation et la migration. Les deux tissus de transplantation 5,6 et partielle d&#39;irradiation 7 ont été utilisés historiquement dans la définition de la plupart des questions au sujet de la régénération planaire qui restent à l&#39;étude aujourd&#39;hui. Cependant, ces techniques sont restés sous-utilisés en raison de la nature laborieuse et incohérente des méthodes précédentes. Les protocoles présentés ici représentent un grand pas en avant dans la réduction du temps unee les efforts nécessaires pour générer de manière reproductible un grand nombre d&#39;animaux greffés ou partiellement irradié avec des efficacités de près de 100 pour cent. Nous couvrons la culture des grands animaux, l&#39;immobilisation, la préparation pour l&#39;irradiation partielle, la transplantation de tissus, et l&#39;optimisation de la récupération des animaux. En outre, le travail décrit ici démontre la première application de la méthode par irradiation partielle pour une utilisation avec la planaire le plus largement étudié, Schmidtea mediterranea. En outre, le tissu efficace de greffage dans planaria ouvre la porte pour le test fonctionnel des sous-populations de cellules souches naïfs ou traités dans des essais de repeuplement, qui a longtemps été la méthode étalon-or de dosage adulte potentiel des cellules souches chez les mammifères 8. Une large adoption de ces techniques sera sans aucun doute à une meilleure compréhension des comportements cellulaires de cellules souches adultes au cours de l&#39;homéostasie tissulaire et la régénération.

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d&#39;immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l&#39;irradiation partielle d&#39;animaux vivants.

Immobilisation planaire, l&#39;irradiation partielle, et la transplantation de tissus

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K vues.  University of Utah School of Medicine. Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.

Vidéo: Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Transplantation de peau murine

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Recherche

Biologie

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Transplantation des cellules germinales et de tissus testiculaire xénogreffe chez la souris

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Un modèle de souris d’une Obstruction intestinale partielle

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Scrunching planaire comme une lecture comportementale quantitative pour la détection de stimuli nocifs

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.